高灵敏食物过敏原检测方法及其试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种高灵敏食物过敏原检测方法及其试剂盒。1）食物过敏原蛋白偶联磁珠，所述的食物过敏原包括但不限于水产类、奶类、蛋类、肉类、谷物类、坚果类、水果类、蔬菜类、豆类食物过敏原蛋白；2）构建标准曲线：梯度稀释抗食物过敏原的IgG抗体标准品与食物过敏原蛋白偶联磁珠进行免疫反应，然后利用抗人IgG二抗进行信号放大反应，根据平均吸光度值和相应的浓度进行线性回归，构建标准曲线；3）筛查食物过敏原，利用食物过敏原蛋白偶联磁珠与过敏患者的血清进行免疫反应，然后利用抗人IgG二抗进行信号放大反应，然后确定食物过敏原的种类及对应的抗体的浓度。本发明灵敏度范围不高于2pg/mL，可适用于转基因食品的过敏原检测。
【专利说明】高灵敏食物过敏原检测方法及其试剂盒
【技术领域】
[0001]本发明涉及食物安全及过敏检测领域，尤其涉及一种高灵敏食物过敏原检测方法及其试剂盒。
【背景技术】
[0002]过敏性疾病影响全世界近四分之一的人口，被世界卫生组织列为21世纪重点防治的三大疾病之一。食物过敏医学上也称变态反应，是指机体受抗原(包括半抗原)刺激后，产生相应的抗体或致敏淋巴细胞，当再次接触同一种抗原后在体内引起体液或细胞免疫反应，由此导致组织损伤或机体生理机能障碍。它是一种复发率很高的疾病。据食品过敏或过敏性反应网络统计，约有90%的过敏反应是由花生、果仁、鱼、贝类、鸡蛋、牛奶、大豆、鱼虾、蘑菇和小麦等食物引起(以花生引起的过敏最为严重)，10%的过敏是由170多种其他食物引起。根据流行病学调查，近年来过敏症发病率呈逐年上升的趋势。据调查西方大概有20-25%的人受过过敏原的袭扰，我国大约有5-10%的人受过敏原的袭扰。上海、浙江、广东等沿海地区收过敏原袭扰的人群已超过10%，随着工业的快速发展，生活水平的提高，饮食的改善，受过敏原袭扰的人群每年以1.5%的速度增加。美国每年约有29T2.5%的人发生食物过敏，儿童及婴幼儿的发病率约59T8%。据不完全统计，我国的发病率高于发达国家。目前，随着科技进步和经济的发展，产生了诸多新的食品资源，以及食品生产、流通、消费方式的改变，传统的食物过敏的地域性打破，并且随着转基因作物的大量出现，许多新的转基因食品大量涌现，也使得食物过敏更具备了潜在的危险性。食物过敏在相当大的程度上�：ψ殴羧巳旱慕】担；は颜呤称钒踩丫晌称钒踩芾聿棵偶笆称飞笠邓媪俚闹匾侍狻�
[0003]许多人在直接或者间接接触这些过敏原之后，会因过敏而患上支气管哮喘、上呼吸道结膜炎、湿疹、皮炎等症，有时甚至产生危及生命的过敏性休克。因此迫切需要从众多食物中筛查出隐藏的过敏原，让易敏者避开含有致敏成分的食物以及治疗过敏反应，同时排除类似过敏症状慢性疾病的误诊。过敏患者由于摄入引发过敏反应的食物过敏原蛋白后，体内嗜碱粒细胞和肥大细胞脱颗粒化引起特异性的IgG沉淀抗体进入血液，使血液中这种特异性IgG抗体水平提高。该特异性IgG抗体在体外能识别其对应的抗原，即食物过敏原蛋白，并与之结合。
[0004]对于过敏原性的检测，体内实验方法可提供最为直接的证据，如双盲食物激发试验和皮肤针刺试验，但由于安全因素等方面的考虑，只有在不得已的情况下在医院进行，而且费用昂贵、风险大；与此相比体外实验方法具有方便、安全的优点，但却存在着准确性差的缺点。随着科技的发展，未来食品过敏原检测将向准确、安全、经济、快速、高通量、高灵敏度的体外检测技术方向发展。
[0005]食物过敏原诊断试剂的种类很多，影响试剂质量的因素也很多，为保证试剂质量需要尽可能的提高技术指标。灵敏度作为一项重要的技术指标，对试剂盒的评价具有重要的意义。因为极少量的分析物可能对界定疾病状态、疾病筛查有重要意义。在食物过敏原检测中体内产生的抗体是十分微量的，而市场上现有技术大多只能达到纳克级，在检测低于此浓度时就变得比较困难，而难以达到预期目的。
【发明内容】
[0006]为了克服现有技术的不足，本发明的目的是提供一种高灵敏食物过敏原检测方法及其试剂盒。
[0007]一种高灵敏食物过敏原检测方法，步骤如下:
1)食物过敏原蛋白偶联磁珠，所述的食物过敏原包括但不限于水产类、奶类、蛋类、肉类、谷物类、坚果类、水果类、蔬菜类、豆类食物过敏原蛋白；
2)构建标准曲线:梯度稀释抗食物过敏原的IgG抗体标准品与食物过敏原蛋白偶联磁珠进行免疫反应，然后利用抗人IgG 二抗进行信号放大反应，根据平均吸光度值和相应的浓度进行线性回归，构建标准曲线；
3)筛查食物过敏原，利用食物过敏原蛋白偶联磁珠与过敏患者的血清进行免疫反应，然后利用抗人IgG 二抗进行信号放大反应，然后根据得到的信号与步骤2)所得的标准曲线确定食物过敏原的种类及对应的抗体的浓度。
[0008]所述的信号放大反应为显色反应。
[0009]所述的步骤3)中确定食物过敏原的种类的cut-off值设定为抗体浓度Ing/mL的值在标准曲线对应的吸光度值。
[0010]所述的步骤I)中，具体方法如下: 1.1)取一只5mL的离心管向其中分别加入3.84mL 50mM pH4.0的磷酸盐缓冲液、ImL5%的磁珠、60uL 50mg/mL的EDAC溶液和IOOuL 100mg/mL的NHS溶液，把离心管置于摇床上，室温条件下活化30min ；
1.2)将离心管置于磁力架上吸住磁珠，弃掉清液，并向离心管中加入5mL50mM pH6.5的磷酸盐缓冲液；重复洗涤3次，最后一次加入4.499 mL 50mM pH6.5的磷酸盐缓冲液；
1.3)再向其中加入5ug/mL的食物过敏原蛋白500uL，1%牛血清蛋白luL，把离心管置于摇床上，40 °C条件下反应45min ；
1.4)重复1.2)的洗涤步骤；
1.5)加入4.9901^ 50mM pH6.5的磷酸盐缓冲液与IOuL 1%BSA溶液，4°C条件下封闭保
存待用。
[0011]所述的步骤3)中，具体方法如下:
3.1)取若干只2mL的离心管，分别加入300uL偶联食物过敏原蛋白的磁珠，用磁力架吸住磁珠，弃掉清液，然后加入300uL pH7.4的磷酸盐缓冲液，如此洗涤3次。最后吸干；
3.2)向洗涤后的磁珠中加入120uL，含20%甘油，梯度稀释的抗体，室温条件下孵育40min ；
3.3)孵育结束后，用磁力架吸住磁珠，弃掉清液，再加入300uL的PBS洗涤液，漩涡震荡，再用磁力架吸住磁珠，如此洗涤5次，最后吸干液体；
3.4)向洗涤后的磁珠中加入100ng/mL的辣根过氧化物酶标记的二抗120uL，含20%甘油，室温条件下孵育40min ；
3.5)重复步骤3.3)； 3.6)向洗涤后的磁珠中加入IOOuL的TMB显色液，避光反应15min ；
3.7)避光反应后，向其中加入IOOuL ImoL/L的盐酸溶液，终止反应，并把液体转移到酶标板上；
3.8)用酶标仪读取吸光度值；
3.9)结果计算。
[0012]所述的磁珠的表面具有羧基、氨基或者无基团,粒径大小在100nnT3um。
[0013]食物过敏原检测试剂盒，它包括但不限于已包被的水产类、奶类、蛋类、肉类、谷物类、坚果类、水果类、蔬菜类、豆类食物过敏原蛋白中的一种或多种的磁性纳米微球、人IgG标准液、辣根过氧化物酶标记二抗、TMB、样品稀释液、洗涤液和终止液，灵敏度范围不高于2pg/mL。
[0014]所述的试剂盒，适用于转基因食品的过敏原检测。
[0015]本发明的有益效果:将磁珠作为固相载体，来代替ELISA检测中的酶标板微孔。此固相载体相比于普通ELISA的酶标板微孔拥有更大的表面负载量，并且可以对目标物质具有更强的富集作用，通过外加磁场和洗涤的过程可以对目标物起到一个浓缩的作用，最终提高食物过敏原检测的灵敏度、准确性和线性范围。灵敏度范围不高于2pg/mL，可适用于转基因食品的过敏原检测。
【专利附图】
【附图说明】
[0016]图1是实施例四中试剂线性实验的结果示意图；
图2是实施例试剂线性实验的结果示意图。
【具体实施方式】
[0017]以下结合附图和实施例对本发明做进一步的说明。
[0018]本发明的食物过敏原检测试剂盒，其组成包括已包被的水产类、奶类、蛋类、肉类、谷物类、坚果类、水果类、蔬菜类、豆类食物过敏原蛋白的磁性纳米微球，人IgG标准液、辣根过氧化物酶标记二抗，TMB，样品稀释液，洗涤液和终止液。
[0019]1、食物过敏原蛋白偶联磁珠
①取一只5mL的离心管向其中分别加入3.84mL 50mM pH4.0的磷酸盐缓冲液、ImL5%的磁珠、60uL 50mg/mL的EDAC溶液和IOOuL 100mg/mL的NHS溶液，把离心管置于摇床上，室温条件下活化30min。
[0020]②将离心管置于磁力架上吸住磁珠，弃掉清液，并向离心管中加入5mL 50mMpH6.5的磷酸盐缓冲液；如此重复洗涤3次，最后一次加入4.499mL 50mM pH6.5的磷酸盐缓冲液。
[0021]③再向其中加入5ug/mL的食物过敏原蛋白500uL，l%牛血清蛋白luL，把离心管置于摇床上，40°C条件下反应45min。
[0022]④重复②的洗涤步骤。
[0023]⑤加入4.990mL 50mM pH6.5的磷酸盐缓冲液与IOuL 1%BSA溶液，4°C条件下封闭保存。待用。
[0024]2、食物过敏原检测试剂盒的使用方法①取若干只2mL的离心管，分别加入300uL偶联食物过敏原蛋白的磁珠，用磁力架吸住磁珠，弃掉清液，然后加入300uL pH7.4的磷酸盐缓冲液，如此洗涤3次。最后吸干。
[0025]②向洗涤后的磁珠中加入120uL (含20%甘油)梯度稀释的抗体,室温条件下孵育 40min。
[0026]③孵育结束后，用磁力架吸住磁珠，弃掉清液，再加入300uL的PBS洗涤液，漩涡震荡，再用磁力架吸住磁珠，如此洗涤5次，最后吸干液体。
[0027]④向洗涤后的磁珠中加入100ng/mL的辣根过氧化物酶标记的二抗120uL (含20%甘油)，室温条件下孵育40min。
[0028]⑤重复步骤③。
[0029]⑥向洗涤后的磁珠中加入1OOuL的TMB显色液，避光反应15min。
[0030]⑦避光反应后，向其中加入IOOuL ImoL/L的盐酸溶液，终止反应。并把液体转移到酶标板上。
[0031]⑧用酶标仪读取吸光度值。
[0032]⑨结果计算 取重复孔平行三次的吸光度平均值；以系列标准溶液的平均吸光度值和相应的浓度进行线性回归，构建标准曲线；计算样品重复孔的平均吸光度值大于CUt-Off值(Ing/mL对应的吸光度)的那个吸光度值从标准曲线中计算出食物过敏原抗体的含量，此含量反应了患者的过敏程度。
[0033]实施例一
I对虾过敏原蛋白偶联磁珠
①取一只5mL的离心管向其中分别加入3.84mL 50mM pH4.0的磷酸盐缓冲液、ImL5%的磁珠、60uL 50mg/mL的EDAC溶液和IOOuL 100mg/mL的NHS溶液，把离心管置于摇床上，室温条件下活化30min。
[0034]②将离心管置于磁力架上吸住磁珠，弃掉清液，并向离心管中加入5mL 50mMpH6.5的磷酸盐缓冲液；如此重复洗涤3次，最后一次加入4.499mL 50mM pH6.5的磷酸盐缓冲液。
[0035]③再向其中加入5ug/mL的对奸过敏原蛋白500uL (对奸过敏原是一种相对分子质量约36Kd的酸性糖蛋白，属肌肉中的原肌球蛋白。蛋白浓度1.5mg/mL，溶于PBS，效价≥1:1000-5000。)，1%牛血清蛋白luL，把离心管置于摇床上，40°C条件下反应45min。
[0036]④重复②的洗涤步骤。
[0037]⑤加入4.990mL 50mM pH6.5的磷酸盐缓冲液与IOuL 1%BSA溶液，4°C条件下封闭保存。待用。
[0038]2对虾过敏原抗体的检测方法
①取3只2mL的离心管，分别加入300uL偶联对虾过敏原蛋白的磁珠，用磁力架吸住磁珠，弃掉清液，然后加入300uL pH7.4的磷酸盐缓冲液，如此洗涤3次。最后吸干。
[0039]②向洗涤后的磁珠中加入120uL (含20%甘油)的小鼠抗对虾过敏原蛋白单克隆抗体(溶于 PBS，pH7.4 中，蛋白浓度 lmg/mL，含 BSA 等稳定剂，ELISA(1:500)，IHC(1:200)，IP (1:50), WB (1:300)。)，室温条件下孵育 40min。
[0040]③孵育结束后，用磁力架吸住磁珠，弃掉清液，再加入300uL的PBS洗涤液，漩涡震荡，再用磁力架吸住磁珠，如此洗涤5次，最后吸干液体。
[0041]④向洗涤后的磁珠中加入100ng/mL的辣根过氧化物酶标记的二抗120uL (含20%甘油)，室温条件下孵育40min。
[0042]⑤重复步骤③。
[0043]⑥向洗涤后的磁珠中加入IOOuL的TMB显色液，避光反应15min。
[0044]⑦避光反应后，向其中加入IOOuL ImoL/L的盐酸溶液，终止反应。并把液体转移到酶标板上。
[0045]⑧用酶标仪读取吸光度值。
[0046]⑨结果计算
取重复孔平行三次的吸光度平均值；以系列标准溶液的平均吸光度值和相应的浓度进行线性回归，构建标准曲线；计算样品重复孔的平均吸光度值大于CUt-Off值(Ing/mL对应的吸光度)的那个吸光度值从标准曲线中计算出对虾过敏原抗体的含量。特异性达91.3%。
[0047]实施例二:食物过敏原筛查试验
对35例食物过敏患者抽取血液，将其制备血清，来筛查食物过敏原。检测吸光度值，计算抗体浓度，其中值大于cut-off值(Ing/mL对应的吸光度)的判断为阳性。其检测结果如下表1所示:
表1
【权利要求】
1.一种高灵敏食物过敏原检测方法，其特征在于，步骤如下: 1)食物过敏原蛋白偶联磁珠，所述的食物过敏原包括但不限于水产类、奶类、蛋类、肉类、谷物类、坚果类、水果类、蔬菜类、豆类食物过敏原蛋白； 2)构建标准曲线:梯度稀释抗食物过敏原的IgG抗体标准品与食物过敏原蛋白偶联磁珠进行免疫反应，然后利用抗人1gG 二抗进行信号放大反应，根据平均吸光度值和相应的浓度进行线性回归，构建标准曲线； 3)筛查食物过敏原，利用食物过敏原蛋白偶联磁珠与过敏患者的血清进行免疫反应，然后利用抗人1gG 二抗进行信号放大反应，然后根据得到的信号与步骤2)所得的标准曲线确定食物过敏原的种类及对应的抗体的浓度。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的信号放大反应为显色反应。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的步骤3)中确定食物过敏原的种类的cut-off值设定为抗体浓度1ng/mL的值在标准曲线对应的吸光度值。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤1)中，具体方法如下: .1.1)取一只5mL的离心管向其中分别加入3.84mL 50mM pH4.0的磷酸盐缓冲液、1mL5%的磁珠、60uL 50mg/mL的EDAC溶液和1OOuL 100mg/mL的NHS溶液，把离心管置于摇床上，室温条件下活化30min ； .1.2)将离心管置于磁力架上吸住磁珠，弃掉清液，并向离心管中加入5mL50mM pH6.5的磷酸盐缓冲液；重复洗涤3次，最后一次加入4.499 mL 50mM pH6.5的磷酸盐缓冲液； .1.3)再向其中加入5ug/mL的食物过敏原蛋白500uL，1%牛血清蛋白luL，把离心管置于摇床上，40 °C条件下反应45min ； .1.4)重复1.2)的洗涤步骤； .1.5)加入4.990mL 50mM pH6.5的磷酸盐缓冲液与1OuL 1%BSA溶液，4°C条件下封闭保存待用。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的步骤3)中，具体方法如下: .3.1)取若干只2mL的离心管，分别加入300uL偶联食物过敏原蛋白的磁珠，用磁力架吸住磁珠，弃掉清液，然后加入300uL pH7.4的磷酸盐缓冲液，如此洗涤3次； 最后吸干； .3.2)向洗涤后的磁珠中加入120uL，含20%甘油，梯度稀释的抗体，室温条件下孵育40min ； .3.3)孵育结束后，用磁力架吸住磁珠，弃掉清液，再加入300uL的PBS洗涤液，漩涡震荡，再用磁力架吸住磁珠，如此洗涤5次，最后吸干液体； .3.4)向洗涤后的磁珠中加入100ng/mL的辣根过氧化物酶标记的二抗120uL，含20%甘油，室温条件下孵育40min ； .3.5)重复步骤3.3)； .3.6)向洗涤后的磁珠中加入1OOuL的TMB显色液，避光反应15min ； .3.7)避光反应后，向其中加入1OOuL 1moL/L的盐酸溶液，终止反应，并把液体转移到酶标板上； .3.8)用酶标仪读取吸光度值； .3.9)结果计算。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的磁珠的表面具有羧基、氨基或者无基团，粒径大小在100nnT3um。
7.一种根据权利要求1所述的方法的食物过敏原检测试剂盒，其特征在于，它包括但不限于已包被的水产类、奶类、蛋类、肉类、谷物类、坚果类、水果类、蔬菜类、豆类食物过敏原蛋白中的一种或多种的磁性纳米微球、人IgG标准液、辣根过氧化物酶标记二抗、TMB、样品稀释液、洗涤液和终止液，灵敏度范围不高于2pg/mL。
8.根据权利要 求7所述的试剂盒，其特征在于，适用于转基因食品的过敏原检测。
【文档编号】G01N33/68GK103616520SQ201310645509
【公开日】2014年3月5日 申请日期:2013年12月5日 优先权日:2013年12月5日
【发明者】沈晓亮, 钱兵, 刘意, 宋伟杰, 方序, 叶俊英, 董婧 申请人:浙江天科高新技术发展有限公司, 杭州赛恩生物技术有限公司
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