一种基于纳米对电极的单分子核酸测序器件的制作方法
【专利摘要】本发明是涉及的是一种基于纳米对电极的单分子核酸测序器件，是一种单分子核酸测序器件，通过检测核酸聚合酶的导电特性实现单分子核酸分子的快速测序，该发明属于第三代DNA测序器件。一种基于纳米对电极的单分子核酸测序器件，其特征在于：制备纳米对电极，纳米对电极为一对纳米间隙的电极，电极之间的间隙为5至50纳米；两电极尖端相对处连接同一个蛋白质或蛋白质复合体；电极对置于水溶液中，电极与水溶液接触部分的表面覆盖有一层电绝缘层；在溶液中放置一电极，作为电化学检测的参考电极。本发明将单个DNA聚合酶分子固定于一对纳米电极之间，在溶液中检测单个DNA聚合酶分子在合成测序时导电率的变化，实现对单分子DNA模板上四种碱基序列的检测。
【专利说明】—种基于纳米对电极的单分子核酸测序器件
【技术领域】
[0001]本发明是涉及的是一种基于纳米对电极的单分子核酸测序器件，是一种单分子核酸测序器件，通过检测核酸聚合酶的导电特性实现单分子核酸分子的快速测序，该发明属于第三代DNA测序器件。
【背景技术】
[0002]DNA测序技术是近代生命科学发展的重要里程碑之一。近十年来，低成本、高通量DNA测序技术的出现，引起了生命这一高度复杂系统中最为庞大、最为核心的核酸序列信息爆发性地增长，使生命科学和医学面临前所未有的机遇和挑战。生命遗传密码的彻底破译即将成为可能，遗传信息大数据的普及将正在惠及到人类社会每一个普通成员的生存和健康。
[0003]目前大量使用的新一代DNA测序技术是所谓的第二代测序技术。该测序技术通过对被测目标核酸进行平行扩增，构建测序文库，克隆出上百万种固相化单链核酸片段模板，进行高通量并行序列测定。第二代测序技术存在下列不足:(I ) DNA测序文库制备需要较大量的起始DNA样本；(2 )样本的平行扩增还可能导致测序文库制备的偏性；(3 )制备测序文库需要大量的分子生物学操作，文库制备时间较长，成本高；(4 )通过DNA生物合成反应在DNA测序模板上进行逐个碱基阅读，一次生化反应仅能阅读一个碱基，这也导致了测序速度和通量提升的瓶颈，因此虽然第二代测序技术比第一代的桑格测序技术在测序通量方面取得了巨大成功，在不到十年时间内使人类个体基因组的测序成本下降了近万倍，但是与未来应用于实际的需求相比，第二代测序技术仍然是一项昂贵的技术，不利于推广应用，同时它还存在测序结果报告周期长，测序的准确性还不高，读长较短以及测序偏性等问题。
[0004]第三代测序技术是目前国际学术界和产业界追捧的对象。第三代测序技术有如下三个特点:(I)实现单分子DNA测序。无需对测序对象进行扩增和放大，能够克服由基因扩增引起的测序偏向性；(2)实现连续测序。也就是DNA链上碱基的阅读是不间断的，这一特性不仅能够大幅度提高测序速度，也会使DNA的读长大幅度增加；(3)更低的测序成本。因为三代测序技术在测序反应中无需不断加入生化试剂，在DNA测序过程中没有试剂成本。由上述三个特征可以看出，第三代测序技术的实现将会是生命科学和医学发展史上的又一重要里程碑，人们可以随时随地、实时、低成本地获取人体、环境的各种各样的核酸信息，随时掌控生命体中遗传与变异、表达与调控、感染和防卫等事件，真正促进实现4P和精准的医疗。
[0005]到目前为止，第三代测序技术的原理可以分为三类。
[0006](I)成像测序法
通过高分辨率成像技术进行核酸序列的鉴定，是最早报导的单分子DNA测序技术。早在1977年Cole等通过锇等配位化合物与核酸上的碱基进行特异性结合，电子显微镜上观察到Os点阵，获得了单链DNA的影像。近二十多年来，有许多关于用扫描探针显微镜对核酸分子进行显微成像和碱基识别的报导，不过其识别的准确性和速度还远远达不到DNA测序的要求。
[0007](2)合成测序法
本世纪初，美国加州理工发表了单分子合成测序的结果。在玻片上构建单分子DNA测序文库，采用与可切除封闭基团的荧光标记碱基进行测序，但是该方法测序通量低、读长短、错误率高，产品成熟度差，并没有形成销售。PicB1等公司通过在核苷酸的磷酸基团上修饰荧光基团，在合成测序时能够自动切除的荧光基团，实现了单分子DNA上碱基的连续阅读。为了提高单分子荧光检测的灵敏度，其芯片采用Z波导腔。该技术能够自动快速并行地实现单分子DNA的测序，其测序速度快，读长较长，但测序成本高、通量低，准确性较差。
[0008](3)纳米孔测序法
纳米孔测序方法是单链DNA分子在电场驱动下穿过纳米尺度的微孔，通过实时检测过孔电导的变化，识别过孔DNA单链上的碱基。制备纳米孔的材料可以采用天然的或经过改造过的蛋白质分子(如α溶血素、Mps蛋白)，也可以是用微加工制备的固态纳米孔(如氮化硅、石墨烯)。生物纳米孔能够识别单个碱基，但对在单链DNA分子上碱基的准确识别还存在技术瓶颈。固态纳米孔由于孔径的可控性和稳定性、单链过孔速度、纳米孔长度等因素，尚未达DNA链单个碱基的识别能力。一些公司通过在纳米孔上构建场效应器件、引入可检测横向隧道电流的对电极、组装具有分子识别功能的分子基团、增加荧光标记分子等方法，试图提闻对单喊基识别能力。
[0009]生命系统中存在着多种能够闻效精准识别核酸中喊基序列的蛋白质分子，蛋白质分子在识别碱基时其分子构象差生的微小变化转换成电信号，并进行放大和快速测定，无疑是一种理想的测序方法。本发明就是针对目前单分子DNA测序存在的问题，通过检测DNA聚合酶或RNA聚合酶等蛋白质分子在核酸合成过程中导电率的波动情况，推断单链核酸上的碱基序列，发展一种低成本、快速核酸测序器件。
【发明内容】
[0010]本发明目的是针对上述不足之处提供一种基于纳米对电极的单分子核酸测序器件。
[0011]生命系统中存在着多种能够闻效精准识别核酸中喊基序列的蛋白质分子，蛋白质分子在识别碱基时其分子构象产生的微小变化转换成电信号，并进行放大和快速测定，无疑是一种理想的测序方法。本发明就是针对目前单分子DNA测序存在的问题，通过检测DNA聚合酶或RNA聚合酶等蛋白质分子在核酸合成过程中导电率的波动情况，推断单链核酸上的碱基序列，发展一种低成本、快速核酸测序器件。
[0012]本发明一种基于纳米对电极的单分子核酸测序器件是采取以下技述方案实现:
一种基于纳米对电极的单分子核酸测序器件，制备纳米对电极，纳米对电极为一对纳米间隙的电极，电极之间的间隙为5至50纳米；两电极尖端相对处连接同一个蛋白质或蛋白质复合体；电极对置于水溶液中，电极与水溶液接触部分的表面覆盖有一层电绝缘层；在溶液中放置一电极，作为电化学检测的参考电极。
[0013]在所述纳米对电极尖端固定的是同一个蛋白质分子或蛋白质复合物分子，电极与蛋白质分子保持良好的电接触。
[0014]所述的在所述纳米对电极之间固定蛋白质分子或蛋白质复合物分子为DNA聚合酶、RNA聚合酶、或DNA外切酶等及其与其他生物分子组成的复合物。
[0015]所述的纳米对电极材料为金、钼、钯等材料，或者为这些材料的合金。
[0016]所述的纳米对电极材料为碳纳米管、导电高分子等材料。
[0017]蛋白质复合物是指一种或一种以上生物大分子(包括其他蛋白质、核酸、糖、脂以及其他生物高分子材料等)与DNA聚合酶、RNA聚合酶、或DNA外切酶中的一种蛋白质进行交联，构建成的多功能的蛋白质复合体。
[0018]根据通过单个蛋白质分子或蛋白质复合物分子的电阻值变化，确定单个蛋白质分子构象的动力学特征，获得生物酶相关的生化反应信息。
[0019]根据通过单个DNA聚合酶、RNA聚合酶或DNA外切酶的电流值变化，确定其分子构象的动力学特征，获得DNA聚合酶、RNA聚合酶、或DNA外切酶在模板上合成和降解碱基的序列信息。
本发明提出了一种能够对长片段单链核酸模板进行快速、低成本测序的方法。当生物酶与底物反应时，其构象涨落的动力学特性会产生微小变化，这种由水合蛋白质构象涨落现象可引起单个蛋白质电特性的微小变化。对于DNA聚合酶，当四种不同碱基沿单链核酸模板进行合成时核酸聚合酶的构象会因被合成碱基的种类产生微小的差异，并引起相应的电导率差异。因此通过检测在溶液中单个核酸聚合酶导电率的测定，实现单个核酸分子的合成测序。
[0020]本发明提出一种基于纳米对电极的单分子核酸测序器件，通过检测溶液中单个核酸聚合酶等蛋白质分子的电导率来表征其构象在溶液中涨落的动力学特征，从而检测蛋白质的活性及其与底物分子的生化反应过程。该器件将核酸聚合酶等蛋白质分子对单个核酸链上碱基识别的特异性和纳米对电极上单个DNA聚合酶的电流测定相结合，通过将功能蛋白质分子组装在纳米对电极上，检测通过纳米对电极的电流，构建成单个蛋白质分子的电子器件；通过检测核酸聚合酶在合成测序时导电率的变化，实现单个核酸分子链上四种碱基序列的检测。
[0021]当生物酶与底物结合和反应时其蛋白质构象涨落的动力学特性将产生微小的变化，并引起单个DNA聚合酶电流的变化，实现单个蛋白质分子的活性和生化反应过程。
[0022]一种基于纳米对电极的单分子核酸测序器件有益效果:
本发明作为一种极具发展潜力的第三代核酸器件及其测序方法，具有纳米对电极的蛋白质分子电子器件具有具备如下优点:无需制备特殊的DNA测序文库，无需对核酸进行标记，可进行超长、连续、快速、精准的碱基阅读、可制备成高通量平行的分子器件，可实现超低成本的DNA测序等，具体描述如下:
(I)本发明将单个核酸聚合酶分子固定于一对电极之间，通过检测蛋白质的电导率的变化，实现核苷等单分子底物生化反应过程，可直接对单链核酸分子进行测序，无需对测序对象进行扩增和放大，能够克服由基因扩增引起的测序偏向性。如果采用RNA聚合酶，则可直接对RNA链进行测序，无需对RNA进行逆转录。
[0023](2)本发明提出的单个DNA聚合酶或RNA聚合酶分子的电特性检测是在DNA或RNA合成过程中同时实现的，也就是通过纳米对电极实时检测核酸聚合酶的每个单体核苷酸的合成过程，因此，该器件可以实现连续、不间断的测序，这一特性不仅能够大幅度提高测序速度，也会使DNA或RNA的读长大幅度增加。
[0024](3)本发明提出的核酸测序器件，在测序过程中除了一次性加入普通核苷酸单体(四种dNTP )外，无需加入其他生化试剂，在核酸测序过程中基本上没有试剂的成本,使用试剂成本仅仅需要几美元。
[0025](4)本发明提出的核酸测序器件还可以作为研究单个生物酶活性的研究平台，目前还没有任何方法研究单个酶分子在生化反应过程中的动力学行为，同时，通过固定不同的生物酶蛋白，可以检测相应的底物分子，用于超高灵敏度的生物传感器，可以为极微量底物浓度检测方面提供新的技术。
【专利附图】
【附图说明】
[0026]以下将结合附图对本发明作进一步说明:
图1是本发明一种基于纳米对电极的单分子核酸测序器件的结构及检测电路示意图。
【具体实施方式】
[0027]参照附1，一种基于纳米对电极的单分子核酸测序器件，制备纳米对电极，纳米对电极为一对纳米间隙的电极，电极之间的间隙为5至50纳米；两电极尖端相对处连接同一个蛋白质或蛋白质复合体；电极对置于水溶液中，电极与水溶液接触部分的表面覆盖有一层电绝缘层；在溶液中放置一电极，作为电化学检测的参考电极。
[0028]在所述纳米对电极尖端固定的是同一个蛋白质分子或蛋白质复合物分子，电极与蛋白质分子保持良好的电接触。
[0029]所述的在所述纳米对电极之间固定蛋白质分子或蛋白质复合物分子为DNA聚合酶、RNA聚合酶、或DNA外切酶等及其与其他生物分子组成的复合物。
[0030]所述的纳米对电极材料为金、钼、钯等材料，或者为这些材料的合金。
[0031]所述的纳米对电极材料为碳纳米管、导电高分子等材料。
[0032]蛋白质复合物是指一种或一种以上生物大分子(包括其他蛋白质、核酸、糖、脂以及其他生物高分子材料等)与DNA聚合酶、RNA聚合酶、或DNA外切酶中的一种蛋白质进行交联，构建成的多功能的蛋白质复合体。
[0033]根据通过单个蛋白质分子或蛋白质复合物分子的电阻值变化，确定单个蛋白质分子构象的动力学特征，获得生物酶相关的生化反应信息在模板上合成碱基的序列信息。
[0034]根据通过单个DNA聚合酶、RNA聚合酶或DNA外切酶的电流值变化，确定其分子构象的动力学特征，获得DNA聚合酶、RNA聚合酶、或DNA外切酶在模板上合成和降解碱基的序列信息。
本发明将单个DNA聚合酶分子固定于一对纳米电极之间，在溶液中检测单个DNA聚合酶分子在合成测序时导电率的变化，实现对单分子DNA模板上四种碱基序列的检测。本发明可对长片段单链DNA模板进行快速、低成本地测序。
[0035]实施方案一:基于纳米对电极的单分子核酸测序器件
(I)金纳米对电极的制备:采用常规的光刻工艺在硅芯片上制备纳米电极对芯片，加工流程包括氧化、涂胶、电子束曝光、金属沉积、PR清洗、BOE刻蚀，以及再次涂胶、电子束曝光制备出尖端暴露的纳米金电极对。加工指标为:电极宽为50纳米，间隙10纳米；Si02层为150纳米。
[0036](2)金纳米电极表面的绝缘修饰:应用巯基乙酸水溶液/十六烷硫醇乙醇溶液对金电极表面进行修饰，在电极表面构建一层绝缘层，具体加工流程为:将电极芯片在食人鱼溶液中浸泡5分钟；去离子水浸泡5分钟；浸泡在无水乙醇中短时间保存；自然干燥或氮气吹干；在10毫摩巯基化合物溶液浸泡，室温避光反应4至6小时；去离子水浸泡30分钟。
[0037](3)蛋白质复合体的化学交联法制备:选用双功能的交联剂，对选用的DNA聚合酶分子和葡萄糖氧化酶进行异源交联剂(分子间交联)，该化学交联剂带有两个不同功能基团，可分别与两个蛋白质的基团交联，可保证方向性，该蛋白质复合体具有DNA生物合成和分解葡萄糖分子的功能。
[0038](4)将纳米对电极放置与一个微型溶液槽中，将DNA聚合酶分子和葡萄糖氧化酶异源交联的蛋白质复合物固定在纳米对电极之间，在溶液槽中注入纯水溶液，在溶液槽的的溶液中放置一个银氯化银电极，通过图1所示的检测电路对蛋白质的导电率进行检测，整个检测电路置于电学信号检测屏蔽箱内。
[0039](5)在溶液中加入适量的单链DNA模板序列和引物，同时监测蛋白质复合物的电导率变化，当加入DNA模板序列和引物后，通过调整参考电极的电位使蛋白质复合物的电导在0.01纳西门子左右。
[0040](6)在溶液中加入相应的四种dNTP，在DNA聚合酶合成时监测纳米对电极间的电流。DNA合成速度约为I至10微秒/碱基。纳米对电极间电流的波动值可以表示DNA聚合酶合成碱基种类，用于鉴别对应合成的碱基。
[0041](7)记录蛋白质分子电子器件的纳米对电极间的电流波动谱，就可以分析DNA模板的序列。
[0042]实施方案二:基于纳米对电极的单分子核酸测序器件
(I)钼纳米对电极的制备:采用常规的光刻工艺在硅芯片上制备纳米电极对芯片，加工流程包括氧化、涂胶、电子束曝光、金属沉积、PR清洗、BOE刻蚀，以及再次涂胶、电子束曝光制备出暴露的纳米金电极对，进一步在纳米金电极对上沉积一数纳米的钼层。加工指标为:电极宽为50纳米，间隙10纳米；Si02层为150纳米。
[0043](2)钼纳米电极表面的绝缘修饰:应用巯基乙酸水溶液/十六烷硫醇乙醇溶液对金电极表面进行修饰，在电极表面构建一层绝缘层。具体加工流程为:将电极芯片在食人鱼溶液中浸泡5分钟；去离子水浸泡5分钟；浸泡在无水乙醇中短时间保存；自然干燥或氮气吹干；在10毫摩巯基化合物溶液浸泡，室温避光反应4至6小时；去离子水浸泡30分钟。
[0044](3)蛋白质复合体的化学交联法制备:选用双功能的交联剂，对选用的RNA聚合酶分子和葡萄糖氧化酶进行异源交联剂(分子间交联)，该化学交联剂带有两个不同功能基团，可分别与两个蛋白质的基团交联，可保证方向性，该蛋白质复合体具有DNA生物合成和分解葡萄糖分子的功能。
[0045](4)将纳米对电极放置与一个微型溶液槽中，将RNA聚合酶分子和葡萄糖氧化酶异源交联的蛋白质复合物固定在纳米对电极之间，在溶液槽中注入纯水溶液，在溶液槽的的溶液中放置一个银氯化银电极，通过图1所示的检测电路对蛋白质的导电率进行检测。整个检测电路置于电学信号检测屏蔽箱内。
[0046](5)在溶液中加入适量的RNA模板序列和引物，同时监测蛋白质复合物的电导率变化。当加入RNA模板序列和引物后，通过调整参考电极的电位使蛋白质复合物的电导在
0.01纳西门子左右。
[0047](6)在溶液中加入相应的四种dNTP，在RNA聚合酶合成时监测纳米对电极间的电流。DNA合成速度约为I至10微秒/碱基。纳米对电极间电流的波动值可以表示RNA聚合酶合成碱基种类，用于鉴别对应合成的碱基。
[0048](7)记录蛋白质分子电子器件的纳米对电极间的电流波动谱，就可以分析RNA模板的序列。
[0049]实施方案三:基于纳米对电极的单分子核酸测序器件
(I)钯纳米对电极的制备:采用常规的光刻工艺在硅芯片上制备纳米电极对芯片，加工流程包括氧化、涂胶、电子束曝光、金属沉积、PR清洗、BOE刻蚀，以及再次涂胶、电子束曝光制备出暴露的纳米金电极对。进一步在纳米金电极对上沉积一数纳米的钯层。加工指标为:电极宽为50纳米，间隙10纳米；Si02层为150纳米。
[0050](2)钯纳米电极表面的绝缘修饰:应用巯基乙酸水溶液/十六烷硫醇乙醇溶液对金电极表面进行修饰，在电极表面构建一层绝缘层。具体加工流程为:将电极芯片在食人鱼溶液中浸泡5分钟；去离子水浸泡5分钟；浸泡在无水乙醇中短时间保存；自然干燥或氮气吹干；在10毫摩巯基化合物溶液浸泡，室温避光反应4至6小时；去离子水浸泡30分钟。
[0051](3)蛋白质复合体的化学交联法制备:选用双功能的交联剂，对选用的DNA外切酶分子和葡萄糖氧化酶进行异源交联剂(分子间交联)，该化学交联剂带有两个不同功能基团，可分别与两个蛋白质的基团交联，可保证方向性，该蛋白质复合体具有DNA外切活性和分解葡萄糖分子的功能；
(4)将纳米对电极放置与一个微型溶液槽中，将DNA外切酶分子和葡萄糖氧化酶异源交联的蛋白质复合物固定在纳米对电极之间，在溶液槽中注入纯水溶液，在溶液槽的的溶液中放置一个银氯化银电极，通过图1所示的检测电路对蛋白质的导电率进行检测。整个检测电路置于电学信号检测屏蔽箱内，监测蛋白质复合物的电导率变化，通过调整参考电极的电位使蛋白质复合物的电导在0.01纳西门子左右。
[0052](5)在溶液中加入适量的双链DNA模板序列，在DNA外切酶沿着双链DNA链逐个切除其中一条DNA链上的碱基时，纳米对电极间电流会产生波动，其波动值可以表示DNA链上被切除的碱基种类，记录蛋白质分子电子器件的纳米对电极间的电流波动谱，就可以分析DNA模板的序列。
[0053]实施方案四:基于纳米对电极的单分子核酸测序器件
(I)碳纳米管对电极的制备:在单壁碳纳米管中间制备一个断点，断点的二端分别结合一个5纳米的纳米金球。
[0054](2)纳米金抗体的制备:通过免疫法制备5纳米胶体金的抗体，该抗体可以同时结合二个纳米金颗粒。
[0055](3)将纳米金抗体蛋白与修饰有纳米金球的单壁碳纳米管结合，形成纳米碳管/纳米金/纳米金抗体蛋白/纳米金/纳米碳管的电极结构。
[0056](4)选用双功能的交联剂,将DNA聚合酶分子组装固定在纳米金抗体蛋白，构成DNA聚合酶和纳米金抗体的复合物。
[0057](5)通过微探针台将二端的纳米碳管分别连接到检测电路中，构建纳米碳管对电极器件。
[0058](6)将纳米碳管对电极器件放置与一个微型溶液槽中，在溶液槽中注入纯水溶液，检测电路对蛋白质的导电率进行检测，整个检测电路置于电学信号检测屏蔽箱内。
[0059]在溶液中加入单链DNA测序模板和引物及其相应的四种dNTP，在DNA聚合酶在单链DNA上合成碱基时监测碳纳米管对电极间的电流。碳纳米管对电极间电流的波动值可以表示DNA聚合酶合成碱基种类，用于鉴别对应合成的碱基。记录蛋白质分子电子器件的纳米对电极间的电流波动谱，就可以分析DNA模板的序列。
【权利要求】
1.一种基于纳米对电极的单分子核酸测序器件，其特征在于:制备纳米对电极，纳米对电极为一对纳米间隙的电极，电极之间的间隙为5至50纳米；两电极尖端相对处连接同一个蛋白质或蛋白质复合体；电极对置于水溶液中，电极与水溶液接触部分的表面覆盖有一层电绝缘层；在溶液中放置一电极，作为电化学检测的参考电极。
2.根据权利要求1所述的一种基于纳米对电极的单分子核酸测序器件，其特征在于:在所述纳米对电极尖端固定的是同一个蛋白质分子或蛋白质复合物分子，电极与蛋白质分子保持良好的电接触。
3.根据权利要求1所述的一种基于纳米对电极的单分子核酸测序器件，其特征在于:所述的在所述纳米对电极之间固定蛋白质分子或蛋白质复合物分子为DNA聚合酶、RNA聚合酶、或DNA外切酶等及其与其他生物分子组成的复合物。
4.根据权利要求1所述的一种基于纳米对电极的单分子核酸测序器件，其特征在于:所述的纳米对电极材料为金、钼、钯等材料，或者为这些材料的合金。
5.根据权利要求1所述的一种基于纳米对电极的单分子核酸测序器件，其特征在于:所述的纳米对电极材料为碳纳米管、导电高分子材料。
6.根据权利要求1、2或3所述的一种基于纳米对电极的单分子核酸测序器件，其特征在于:蛋白质复合物是指一种或一种以上生物大分子(包括其他蛋白质、核酸、糖、脂以及其他生物高分子材料等)与DNA聚合酶、RNA聚合酶、或DNA外切酶中的一种蛋白质进行交联，构建成的多功能的蛋白质复合体。
7.根据权利要求1所述的一种基于纳米对电极的单分子核酸测序器件，其特征在于:根据通过单个蛋白质分子或蛋白质复合物分子的电阻值变化，确定单个蛋白质分子构象的动力学特征，获得生物酶相关的生化反应信息，以及在模板上合成碱基的序列信息。
8.根据权利要求1或7所述的一种基于纳米对电极的单分子核酸测序器件，其特征在于:根据通过单个DNA聚合酶、RNA聚合酶或DNA外切酶的电流值变化，确定其分子构象的动力学特征，获得DNA聚合酶、RNA聚合酶、或DNA外切酶在模板上合成和降解碱基的序列信息。
【文档编号】G01N27/04GK104359946SQ201410569691
【公开日】2015年2月18日 申请日期:2014年10月23日 优先权日:2014年10月23日
【发明者】陆祖宏, 李清宁, 李志宏, 胡广, 丁长松, 贾忠伟, 万成, 康玉麟, 丁韬力 申请人:北京大学
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