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特异性多肽修饰的比色传感器及其制备方法
【专利摘要】本发明涉及一种特异性多肽修饰的比色传感器及其制备方法，该比色传感器用于铜离子的检测。该传感器利用金-巯键使特异性多肽修饰到金纳米颗粒表面，加入待测铜离子后，铜离子使特异性多肽构象发生改变，由α螺旋变为β折叠，金纳米颗粒借助表面修饰特异性多肽形成的β折叠片段互相结合聚集，从而改变溶液的吸光度并产生颜色差异。本发明首次利用特异性多肽修饰的金纳米颗粒对铜离子进行检测，该特异性多肽修饰的金纳米颗粒比色传感器对铜离子有很高的灵敏性、简便性和专一性，检测范围较广，对饮用水、血清、河流、污水等溶液中铜离子含量的检测有潜在的应用价值，操作方便，灵敏度高，应用前景广泛。
【专利说明】特异性多肽修饰的比色传感器及其制备方法

【技术领域】
[0001]本发明涉及一种比色传感器及其制备方法，特别是一种特异性多肽修饰的比色传感器及其制备方法。

【背景技术】
[0002]铜是动植物体内必需的一种微量重金属元素。在机体中，适量的铜在能量代谢、氧气运输和信号转导等生理过程中具有重要的作用。但是，铜在机体内含量过高就会给生命带来危害，机体内过多的铜可能导致一系列神经退行性疾病，比如:緬克斯综合征、威尔森氏综合征和阿兹海默症等。美国环境保护局已规定饮用水中铜元素含量的安全界限为1.33ppm(约20μΜ)，我国国家标准委和卫生部于2007年联合发布的《生活饮用水卫生标准》中也规定了饮用水中铜离子含量不高于1.0mg/L (约15.625μΜ)。由此可见，如何快速高效的检测饮用水、污水、河流以及生物体中的铜离子就显得十分重要和迫切。
[0003]比色传感器是一类以吸光度改变或波峰位移加以测量并伴随产生颜色差异的传感器。比色传感器以特定物质在一定波长范围内对电磁波的吸收特性为依据而建立的定性及定量检测工具，它因具有操作简便、成本低廉、灵敏度高、特异性强和快速检测等优点而得到广泛应用。
[0004]近些年来，纳米材料技术迅速发展并被广泛应用于重金属离子检测、药物输送、疾病诊断等领域。纳米材料本身具有表面效应、微尺寸效应、量子效应和宏观量子隧道效应等优良特性，使其在发展新型高灵敏度、高稳定性、低成本生物传感器领域成为国内外研究热点。尤其是金纳米材料，因其在可见光范围内具有优异的光学性能，而成为研究的热点材料，有着广泛的应用价值，目前已有商业化的基于金纳米材料的传感器在市场销售，如早孕试纸。特异性多肽因其能够与其相对应的物质(如离子、小分子、蛋白质、核苷酸等)发生特异性的作用，同时又可以共价键形式(如金-巯键和酰胺键)修饰到其他材料上，而受到研究者的青睐，使得其在生物传感器领域具有极大的应用前景，目前研究者主要利用其特性去设计构建用于酶活检测和特定蛋白检测的比色检测体系，但在重金属离子特别是铜离子的检测方面还未见报道。


【发明内容】

[0005]本发明的目的之一在于提供一种特异性多肽修饰的比色传感器。用以实现对铜离子的检测。
[0006]本发明的目的之二在于提供该传感器的制备方法。
[0007]为达到上述目的，本发明采用如下机理:首先通过金-巯键将特异性多肽修饰到金纳米颗粒表面，在铜离子存在的条件下促使金纳米颗粒表面的特异性多肽的构象由α螺旋转变为β折叠，从而引起金纳米颗粒分散性的降低并直接致使金纳米颗粒之间发生聚集，表现为在520nm波长处体系吸光度的降低和颜色的改变。
[0008]一种特异性多肽修饰的比色传感器，其特征在于该比色传感器是在金纳米颗粒表面，通过金-巯键修饰有特异性多肽，所述的特异性多肽与金纳米颗粒的质量比为:1:180-1:200 ;所述的金纳米颗粒的粒径:12.5-13nm ;所述的特异性多肽的序列为:Ac - Cys-Gly-Gly-Gly-Ser-1Ie-Arg-Lys-Leu-Glu-Tyr-Glu-1Ie-Glu-Glu-Leu-Arg-Leu-Arg-1Ie-Gly。
[0009]一种制备上述的特异性多肽修饰的比色传感器的方法，其特征在于该方法的具体步骤为:将金纳米颗粒分散在去离子水中配制成浓度为2.3-3.0nM/L的悬浮液；按所述的特异性多肽与金纳米颗粒的质量比为:1:180-1:200的比，将浓度为0.02mg/mL的特异性多肽的溶液与所述的金纳米颗粒悬浮液混匀后室温孵育过夜；离心分离机离心20min后去除上清液，得到特异性多肽修饰的金纳米颗粒。
[0010]上述的金纳米颗粒的制备方法为:将质量浓度为0.01%的氯金酸溶液搅拌加热至回流2?3分钟后，加入质量浓度为I %的柠檬酸三钠溶液，当反应液颜色逐渐变为酒红色之后，停止加热并继续搅拌至室温；所述的氯金酸与柠檬酸三钠的质量比为1:0.3-1:0.5。
[0011]最后，将混合物再次离心(1000rpm 20min)，用HEPES溶液进行复溶，即得到ImL修饰特异性多肽的金纳米颗粒。用紫外分光光度计分别检测裸金纳米颗粒和修饰特异性多肽的金纳米颗粒的UV光谱。
[0012]不同浓度的铜离子存在下的UV光谱:取多个45μ?的修饰特异性多肽的金纳米颗粒，向其中分别加入5μ?不同浓度的铜离子溶液，混合均匀，孵育90min后用移液枪加入到比色皿内测量UV光谱。可以看到随着铜离子浓度的增大，在520nm处吸光度下降也越大，并且峰位偏移量增多，并且在铜离子浓度低于?μΜ时吸光度变化相对较小，当铜离子浓度大于150μΜ时拟合曲线趋于平缓。经过对铜离子浓度范围为10_150μΜ内的特异性多肽修饰的金纳米颗粒在520nm处的吸光度变化量进行线性拟合，得到检测铜离子的精确线性范围为10_150μΜ，相关系数R2为0.99853，说明特异性多肽修饰的金纳米颗粒可以对10_150μΜ浓度范围的铜离子进行检测。
[0013]本发明的优点和特点如下所述:
本发明第一次将特异性多肽修饰的金纳米颗粒应用于铜离子的检测，观察金纳米颗粒在修饰前后光学特性的变化，研究随时间推移铜离子引起特异性多肽修饰的金纳米颗粒的聚集情况，和不同浓度的铜离子引起特异性多肽修饰的金纳米颗粒的吸光度变化和颜色差异，同时观察未修饰特异性多肽的金纳米颗粒和修饰特异性多肽的金纳米颗粒在铜离子存在下的聚集反应引起吸光度和颜色差异的不同，以及特异性多肽修饰的金纳米颗粒比色传感器对铜离子检测的高选择性。结果表明，特异性多肽修饰的金纳米颗粒能够有效地检测铜离子，在铜离子浓度为10-150μΜ范围内有良好的线性关系，相关系数R2为0.99853。
[0014]本发明构建了一种用于铜离子检测的新型传感器，将特异性多肽修饰的金纳米颗粒应用于铜离子的比色检测，取得了满意的结果。同样的原理还可推广到其它物质的检测，应用前景广泛。
[0015]本发明方法制备的特异性多肽修饰的金纳米颗粒比色传感器应用于铜离子的检测，具有实验操作方便、灵敏性高、特异性强、检测范围广等优点。能够成功检测浓度范围为10_150μΜ的铜离子，可以检测的最低浓度为?μΜ。本发明首次将特异性多肽修饰的金纳米颗粒作为铜离子检测的比色传感器，对饮用水、血清、河流、污水等液体中铜离子含量的检测有潜在的应用价值，同样的原理可以用于其他离子的检测，应用前景广泛。

【专利附图】

【附图说明】
[0016]图1为不同浓度的铜离子与特异性多肽修饰的金纳米颗粒孵育90min后的UV光谱图。

【具体实施方式】
[0017]现将本发明的具体实施例叙述于后。
[0018]实施例1:
本实施例中特异性多肽修饰的金纳米颗粒与铜离子作用的UV光谱测定方法和步骤如下:
(I)特异性修饰多肽的金纳米颗粒的制备:首先，制备粒径为13nm的金纳米颗粒。将质量浓度为0.01%的氯金酸溶液加入到装有回流冷凝装置的圆底烧瓶中，加热并快速搅拌，当氯金酸溶液沸腾2-3分钟后，一次性快速加入3.5 mL质量浓度为I %的柠檬酸三钠溶液，再持续加热15分钟，当溶液颜色逐渐变为酒红色之后,停止加热并继续搅拌30min，使其冷却至室温，于4°C储存备用。然后，取20μ?浓度为lmg/mL的特异性多肽溶液加入到980μ? HEPES溶液中混合均匀，得到ImL金纳米颗粒的修饰溶液。取上述金纳米颗粒溶液ImL,用高速离心机进行离心(12000rpm 20min),除去上清液,然后加入等体积的多肽修饰液进行复溶，室温下孵育过夜。最后，将混合物再次离心(12000rpm 20min)，用HEPES溶液进行复溶，即得到ImL修饰特异性多肽的金纳米颗粒。用紫外分光光度计分别检测裸金纳米颗粒和修饰特异性多肽的金纳米颗粒的UV光谱。可以发现，金纳米颗粒在特异性多肽修饰前后的峰位发生了偏移，并且特异性多肽修饰的金纳米颗粒的粒径明显大于裸金纳米颗粒。
[0019](2)不同浓度的铜离子存在下的UV光谱:取多个45μ?的修饰特异性多肽的金纳米颗粒，向其中分别加入5PL不同浓度的铜离子溶液，混合均匀，孵育90min后用移液枪加入到比色皿内测量UV光谱。可以看到随着铜离子浓度的增大，在520nm处吸光度下降也越大，并且峰位偏移量增多，并且在铜离子浓度低于ιμΜ时吸光度变化相对较小，当铜离子浓度大于150μΜ时拟合曲线趋于平缓。经过对铜离子浓度范围为10_150μΜ内的特异性多肽修饰的金纳米颗粒在520nm处的吸光度变化量进行线性拟合，得到检测铜离子的精确线性范围为10-150μΜ，相关系数R2为0.99853，说明特异性多肽修饰的金纳米颗粒可以对10_150μΜ浓度范围的铜离子进行检测。
[0020]比色法测定铜离子:
采用铜离子浓度分别为:0 μΜ, I MM, 10 μΜ, 20 μΜ, 30 μΜ,50 μΜ，80 μΜ, 100 μΜ, 150 μΜ,200 μΜ。
[0021]测试条件:以波长为400-800nm的光为光源，以90min作为孵育时间，在室温条件下进行不同浓度铜离子作用下的UV光谱测定。
[0022]参见附图，图1为不同浓度的铜离子与特异性多肽修饰的金纳米颗粒孵育90min后的UV光谱图。
[0023]由图可见:随着铜离子浓度的增大(随箭头方向)，在520nm处吸光度下降也越大，并且峰位偏移量增多。
【权利要求】
1.一种特异性多肽修饰的比色传感器，其特征在于该比色传感器是在金纳米颗粒表面，通过金-巯键修饰有特异性多肽，所述的特异性多肽与金纳米颗粒的质量比为:1:180-1:200 ;所述的金纳米颗粒的粒径:12.5-13nm ;所述的特异性多肽的序列为:Ac - Cys-Gly-Gly-Gly-Ser-1Ie-Arg-Lys-Leu-Glu-Tyr-Glu-1Ie-Glu-Glu-Leu-Arg-Leu-Arg-1Ie-Gly。
2.一种制备根据权利要求1所述的特异性多肽修饰的比色传感器的方法，其特征在于该方法的具体步骤为:将金纳米颗粒分散在去离子水中配制成浓度为2.3-3.0nM/L的悬浮液；按所述的特异性多肽与金纳米颗粒的质量比为:1:180-1:200的比，将浓度为0.02mg/mL的特异性多肽的溶液与所述的金纳米颗粒悬浮液混匀后室温孵育过夜；离心分离机离心20min后去除上清液,得到特异性多肽修饰的金纳米颗粒。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述的金纳米颗粒的制备方法为:将质量浓度为0.01%的氯金酸溶液搅拌加热至回流2?3分钟后，加入质量浓度为I %的柠檬酸三钠溶液，当反应液颜色逐渐变为酒红色之后，停止加热并继续搅拌至室温；所述的氯金酸与柠檬酸三钠的质量比为1:0.3-1:0.5。
【文档编号】G01N21/33GK104165855SQ201410193866
【公开日】2014年11月26日 申请日期:2014年5月9日 优先权日:2014年5月9日
【发明者】李根喜, 陈红霞, 张江江, 祁方杰 申请人:上海大学