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一种牛樟芝保健食品中腺甘含量测定的方法
【专利摘要】本发明涉及一种牛樟芝保健食品中腺甘含量测定的方法。所述的测定方法包括以下步骤：称取腺苷标准品配制腺甘标准溶液，将其稀释成不同浓度的校准曲线溶液，取样品适量并加溶剂进行超声波提�。频醚诽崛∫海俳诽崛∫航谐煸炔⒐酥频么庋啡芤海詈蠖圆煌ǘ鹊男Ｗ记呷芤杭按庋啡芤悍直鸩捎肏PLC进行测定，并计算腺甘含量。本发明对标准品及待测样品统一采用一种溶剂进行配制，且将流动相限定为乙腈-磷酸二氢钾体系，在对待测样品进行腺甘提取时采用15%-20%的甲醇，均可使样品中主成分分离效果好，色谱图可呈现对称峰形，杂质峰影响�。擅飨蕴岣呒觳饨峁淖既范燃傲槊舳�。
【专利说明】一种牛樟芝保健食品中腺甘含量测定的方法

【技术领域】
[0001] 本发明属于生物检测领域，具体涉及一种牛樟芝保健食品中腺甘含量测定的方 法。

【背景技术】
[0002] 牛樟芝（Taiwanofungus camphorates)，又名牛樟燕或樟芝，是一种原产于我 国台湾省的珍稀药用菌。牛樟芝主要存在于我国台湾省的名贵树木牛樟树cinnamomum kanehirae hayata的树干空洞内。现代研究表明樟芝含有多种生理活性物质，如维生素、 固醇类、麦角留醇、多糖、三萜类、超氧化物歧化酶S0D、腺苷、小分子蛋白质等 。其中腺甘是一种嘌呤核苷，是核酸的基本结构单位之一，由糖苷键连接腺嘌呤和核糖 而成，它是机体代谢的一种中间产物，具有多种生理功能，如扩张血管、降低窦房结的自 律性、减慢房室传导、抑制肾素分泌、降低体外循环后肺缺血一再灌注损伤，有效改善右心 功能，对再灌注心脏具有保护作等作用。因此，有许多厂商开始投注大量研究资源开发牛樟 芝相关医药品或保健品。为了进一步严格控制市售牛樟芝保健品的质量，确保其保健功效， 急需寻找一种可以对牛樟芝保健产品中腺甘进行检测的方法，以期为牛樟芝保健产品的质 量控制提供保障，也能更好的保障消费者的合法权益。目前，对于保健产品中腺甘的测定主 要依据《保健食品检验与评价技术规范》2003年 版中规定的HPLC法，但采用该法测定牛樟芝保健品中的腺甘，灵敏度及准确度较差。 为此，本发明对传统的HPLC法进行了改进，可明显提高测定结果的准确度与灵敏度。


【发明内容】

[0003] 针对上述现有技术的不足，本发明提供一种可对牛樟芝保健食品中腺甘含量进行 准确测定的方法。
[0004] 本发明的技术方案如下： 一种牛樟芝保健食品中腺甘含量测定的方法，包括以下步骤： (1) 配制腺甘标准溶液：准确称取腺苷标准品10_30mg加至25ml试管中，向试管中加 溶剂，配制成浓度为0. 4-1. 2mg/ml的腺甘标准溶液； (2) 腺甘校准曲线溶液配制：将步骤（1)中配制的腺甘标准溶液进一步稀释成不同浓 度的校准曲线溶液； (3) 样品提�。喝〈庋�50-100mg进行粉碎，准确称取粉碎后的样品20-50mg置入 25ml试管中，加入溶剂进行超声提�。频么庋诽崛∫海� (4) 配制待测样品溶液：将步骤（3)中制得的样品提取液5-10ml加入25ml的试管中， 加入溶剂定容至刻度，超声混匀，离心，〇. 45um微孔滤膜过滤，制得待测样品溶液； (5) HPLC测定：将步骤（2)中配制的不同浓度的校准曲线溶液及步骤（4)中配的待测 样品溶液分别采用HPLC进行测定，并绘制标准工作曲线，计算腺甘含量。
[0005] 步骤（2)中所述的不同浓度的校准曲线溶液其浓度分别为0. 4yg/ml，2. Oyg/ ml, 4. Ο μ g/ml, 20. 0 μ g/ml, 80. 0 μ g/ml 〇
[0006] 步骤（1)、（2)、（4)中所加入的溶剂选自50%-100%的甲醇或去离子水中的一种 步骤（3)中中所述的样品提取时加入的溶剂为15%_20%的甲醇。
[0007] 步骤（3)中所述的超声提取时间为5-10min，步骤（4)中所述的超声混匀时间为 5-10min〇
[0008] 步骤（4)中所述的离心时间为20_30min，离心速度为3000-5000r/min。
[0009] 步骤（5)中所述的HPLC的参数为：Diamonsil C18色谱柱，4· 6X 150) mm, 5um;柱 温：25°C ;流速：l.Oml/min;进样量：10μ 1紫外检测器：波长254nm;流动相：10% 乙腈，90%磷酸二氢钾水溶液。
[0010] 所述的磷酸二氢钾水溶液的浓度为0. 005-0. 02 mol/L。
[0011] 步骤（5)中所述的腺甘含量计算具体公式为：X=(CXV)/mX1000; X:待测样品中 腺甘含量（mg/g) ;C :从标准工作曲线得到的待测样品溶液中腺甘浓度（ug/ml) ;V :待测样 品定容体积；m :待测样品的质量。
[0012] 本发明与现有技术相比，有益效果体现在以下几点： 1.对于保健产品中腺甘的测定主要依据《保健食品检验与评价技术规范》2003年版中 规定的HPLC法，但在《保健食品检验与评价技术规范》中，规定标准溶液以纯水配制，样品 提取溶剂为60%乙醇，二者进样溶剂不一致，导致检测结果准确度低。研究表明，50%以上的 甲醇做为溶剂，对腺甘的提取效果好，且在HPLC测定含量时，其色谱峰为有尖峰的对称波 形，因此，可提高方法灵敏度，有利于腺甘与样品中其他成分的分离。
[0013] 2.本发明中将校准曲线溶液浓度分别配制为0.4 μ g/ml，2.0 μ g/ml，4.0 μ g/ ml，20. 0 μ g/ml，80. 0 μ g/ml，适合牛樟芝保健品中腺甘的定量检测，多次测定结果线性相 关系数达0.999。
[0014] 3. HPLC法测定腺甘含量多以甲醇-磷酸二氢钾体系为流动相，但分析时间较少， 本发明将流动相限定为乙腈-磷酸二氢钾体系，且将磷酸二氢钾浓度限定为〇. 005-0. 02 mol/L，分离效果最好，分析时间也最短。
[0015] 4.本发明中在定容时选择的溶剂为50%以上的甲醇，这样使得形成的色谱峰有尖 峰且对称，而在样品提取时，溶剂选择的为15%-20%的甲醇，样品中腺甘提取效果最好，色 谱图中杂质峰影响最小。

【具体实施方式】
[0016] 下面结合实施例对本发明做进一步说明。
[0017] 实施例1 一种牛樟芝保健食品中腺甘含量测定的方法，包括以下步骤： (1)配制腺甘标准溶液：准确称取腺苷标准品10_30mg加至25ml试管中，向试管中加 入50%的甲醇，配制成浓度为0. 4mg/ml的腺甘标准溶液； (2 )腺甘校准曲线溶液配制：将步骤（1)中配制的腺甘标准溶液进一步稀释成0. 4 μ g/ ml, 2· 0 μ g/ml, 4· 0 μ g/ml, 20. 0 μ g/ml, 80. 0 μ g/ml 不同浓度的校准曲线溶液； (3)样品提�。喝〈庋�50mg进行粉碎，准确称取粉碎后的样品20mg置入25ml试 管中，加入15%的甲醇进行超声提取5min，制得待测样品提取液； (4) 配制待测样品溶液：将步骤（3)中制得的样品提取液5-10ml加入25ml的试管中， 加入50%的甲醇定容至刻度，超声混勻5min，以3000r/min的离心速度离心20min，，0. 45um 微孔滤膜过滤，制得待测样品溶液； (5) 册1^：测定：册^：的参数为：0丨3111〇118丨1(：18色谱柱，4.6\150)_，511111 ;柱 温：25°C ;流速：l.Oml/min;进样量：10μ 1紫外检测器：波长254nm;流动相：10% 乙腈，90%浓度为0. 005mol/L的磷酸二氢钾水溶液；将步骤（2)中配制的不同浓度的校准曲 线溶液及步骤（4)中配的待测样品溶液分别采用HPLC进行测定，并绘制标准工作曲线，计 算腺甘含量。
[0018] 实施例1 一种牛樟芝保健食品中腺甘含量测定的方法，包括以下步骤： (1) 配制腺甘标准溶液：准确称取腺苷标准品30mg加至25ml试管中，向试管中加入 100%的甲醇，配制成浓度为1. 2mg/ml的腺甘标准溶液； (2) 腺甘校准曲线溶液配制：将步骤（1)中配制的腺甘标准溶液进一步稀释成0.4yg/ ml, 2· Ο μ g/ml, 4· Ο μ g/ml, 20. Ο μ g/ml, 80. Ο μ g/ml 不同浓度的校准曲线溶液； (3) 样品提�。喝〈庋穕OOmg进行粉碎，准确称取粉碎后的样品50mg置入25ml试 管中，加入20%的甲醇进行超声提取lOmin，制得待测样品提取液； (4) 配制待测样品溶液：将步骤（3)中制得的样品提取液5-10ml加入25ml的试管中， 加入100%的甲醇定容至刻度，超声混勻lOmin，以3000-5000r/min的离心速度离心30min， 0. 45um微孔滤膜过滤，制得待测样品溶液； (5) 册1^：测定：册^：的参数为：0丨3111〇118丨1(：18色谱柱，4.6\150)_，511111 ;柱 温：25°C ;流速：l.Oml/min;进样量：10μ 1紫外检测器：波长254nm;流动相：10% 乙腈，90%浓度为0.02 mol/L的磷酸二氢钾水溶液；将步骤（2)中配制的不同浓度的校准曲 线溶液及步骤（4)中配的待测样品溶液分别采用HPLC进行测定，并绘制标准工作曲线，计 算腺甘含量。
[0019] 实施例3 一种牛樟芝保健食品中腺甘含量测定的方法，包括以下步骤： (1)配制腺甘标准溶液：准确称取腺苷标准品20mg加至25ml试管中，向试管中加入去 离子水，配制成浓度为0. 8mg/ml的腺甘标准溶液； (2 )腺甘校准曲线溶液配制：将步骤（1)中配制的腺甘标准溶液进一步稀释成0. 4 μ g/ ml, 2· 0 μ g/ml, 4· 0 μ g/ml, 20. 0 μ g/ml, 80. 0 μ g/ml 不同浓度的校准曲线溶液； (3) 样品提�。喝〈庋�80mg进行粉碎，准确称取粉碎后的样品40mg置入25ml试 管中，加入18%的甲醇进行超声提取8min，制得待测样品提取液； (4) 配制待测样品溶液：将步骤（3)中制得的样品提取液5-10ml加入25ml的试管 中，加入去离子水定容至刻度，超声混勻5-10min，以4000r/min的离心速度离心25min，， 0. 45um微孔滤膜过滤，制得待测样品溶液； (5) 册1^：测定：册^：的参数为：0丨3111〇118丨1(：18色谱柱，4.6\150)_，511111 ;柱 温：25°C ;流速：l.Oml/min;进样量：10μ 1紫外检测器：波长254nm;流动相：10% 乙腈，90%浓度为0.01 mol/L的磷酸二氢钾水溶液；将步骤（2)中配制的不同浓度的校准曲 线溶液及步骤（4)中配的待测样品溶液分别采用HPLC进行测定，并绘制标准工作曲线，计
【权利要求】
1. 一种牛樟芝保健食品中腺甘含量测定的方法，其特征在于，包括以下步骤： (1) 配制腺甘标准溶液：准确称取腺苷标准品10-30mg加至25ml试管中，向试管中加 溶剂，配制成浓度为0. 4-1. 2mg/ml的腺甘标准溶液； (2) 腺甘校准曲线溶液配制：将步骤（1)中配制的腺甘标准溶液进一步稀释成不同浓 度的校准曲线溶液； (3) 样品提�。喝〈庋�50-100mg进行粉碎，准确称取粉碎后的样品20-50mg置入 25ml试管中，加入溶剂进行超声提�。频么庋诽崛∫海� (4) 配制待测样品溶液：将步骤（3)中制得的样品提取液5-10ml加入25ml的试管中， 加入溶剂定容至刻度，超声混匀，离心，〇. 45um微孔滤膜过滤，制得待测样品溶液； (5) HPLC测定：将步骤（2)中配制的不同浓度的校准曲线溶液及步骤（4)中配的待测 样品溶液分别采用HPLC进行测定，并绘制标准工作曲线，计算腺甘含量。
2. 根据权利要求1所述的牛樟芝保健食品中腺甘含量测定的方法，其特征在于，步 骤（2)中所述的不同浓度的校准曲线溶液其浓度分别为0. 4μ g/ml，2. 0μ g/ml，4. 0μ g/ ml, 20. 0 μ g/ml, 80. 0 μ g/ml 〇
3. 根据权利要求1所述的牛樟芝保健食品中腺甘含量测定的方法，步骤（1)、（2)、（4) 中所加入的溶剂选自50%-100%的甲醇或去离子水中的一种。
4. 根据权利要求1所述的牛樟芝保健食品中腺甘含量测定的方法，其特征在于，步骤 (3)中中所述的样品提取时加入的溶剂为15%-20%的甲醇。
5. 根据权利要求1所述的牛樟芝保健食品中腺甘含量测定的方法，其特征在于，步骤 (3) 中所述的超声提取时间为5-10min，步骤（4)中所述的超声混匀时间为5-10min。
6. 根据权利要求1所述的牛樟芝保健食品中腺甘含量测定的方法，其特征在于，步骤 (4) 中所述的离心时间为20-30min，离心速度为3000-5000r/min。
7. 根据权利要求1所述的牛樟芝保健食品中腺甘含量测定的方法，其特征在于，步骤 (5) 中所述的HPLC的参数为：Diamonsil C18色谱柱，4.6X150) mm，5um;柱温：25°C;流 速：l.Oml/min;进样量：10μ1紫外检测器：波长254nm;流动相：10%乙腈，90%磷酸 二氢钾水溶液。
8. 根据权利要求1所述的牛樟芝保健食品中腺甘含量测定的方法，其特征在于，所述 的磷酸二氢钾水溶液的浓度为〇. 005-0. 02 mol/L。
9. 根据权利要求1所述的牛樟芝保健食品中腺甘含量测定的方法，其特征在于，步骤 (5)中所述的腺甘含量计算具体公式为：X=(CXV)/mX1000; X:待测样品中腺甘含量（mg/ g) ;C :从标准工作曲线得到的待测样品溶液中腺甘浓度（ug/ml) ;V :待测样品定容体积；m : 待测样品的质量。
【文档编号】G01N30/88GK104111302SQ201410396715
【公开日】2014年10月22日 申请日期:2014年8月13日 优先权日:2014年8月13日
【发明者】刘巴宁, 郑安乔 申请人:中山安荞生物科技有限公司