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一种基于乳酸脱氢酶测定的电子烟烟液细胞毒性评价方法
【专利摘要】一种基于乳酸脱氢酶测定的电子烟烟液细胞毒性评价方法，包括以下步骤：1）配制实验试剂，2）细胞接种，3）电子烟烟液染毒，4）LDH测定，5）结果与分析。本发明针对大多数电子烟烟液样本密度大的特点，确立了采用质量称重配制电子烟染毒溶液的方法。本发明的评价方法通过细胞接种密度的优化、细胞裂解液的选择、LDH基质液反应时间的优化提高检测灵敏度，并通过电子烟烟液染毒浓度的优化，确定了最佳染毒浓度，以获得最佳剂量效应曲线。通过LDH的测定，可反映电子烟烟液对细胞膜的损伤程度，揭示电子烟的细胞毒性机理。此外，本测定方法还具有操作快速简便、灵敏性高、结果稳定的优点。
【专利说明】一种基于乳酸脱氢酶测定的电子烟烟液细胞毒性评价方法【技术领域】
[0001]本发明涉及电子烟烟液体外毒理学评价研究领域，具体说是一种基于乳酸脱氢酶测定的电子烟烟液细胞毒性的方法。
【背景技术】
[0002]随着人们对“吸烟有害健康”的了解，各国政府均在现行法律规定范围内积极采取和实行有效的立法、行政或其他措施，禁止在公共场所吸烟。2005年，中国签署了世界卫生组织《烟草控制框架公约》。2012年，中国政府发布《中国烟草控制规划(2012-2015年)》，提出创造无烟环境，实施公共场所全面禁烟。室内禁烟措施导致电子烟等新型产品在各国市场上得到迅速增长，消费群体不断扩大。电子烟又名电子尼古丁传送系统。世界卫生组织对电子尼古丁传送系统的官方定义为:电子尼古丁传送系统是一种消费产品，能够向肺传输尼古丁。电子烟一般都由三部分构成:烟杆、雾化器、烟液。近年来，电子烟以“保健”，“戒烟”，“清肺”等为宣传口号，以网络为主要营销途径，在中国地区销量大增。某些电子烟产品还宣称其比传统卷烟的危害性更小。然而目前对电子烟的毒性评价研究较少，相关研究仅使用3-(4，5- 二甲基噻唑-2)-2，5- 二苯基四氮唑溴盐法(MTT法)对电子烟烟液或烟雾的细胞毒性进行评价，结果表明不同电子烟烟液的细胞毒性相差很大。
[0003]检测化合物细胞毒性可通过多种生物学终点进行，例如通过测定酸性磷酸酶或其他蛋白活性来计算细胞数量、测定细胞代谢活性(例如MTT法)以及检测细胞膜的完整性等生物学终点进行评价。根据不同检测原理开展细胞毒性评价，可从不同角度揭示化合物细胞毒性的作用机理。
[0004]细胞凋亡或化合 物染毒而造成的细胞膜结构的破坏会导致细胞浆内的酶释放到培养液里，其中包括酶活性较为稳定的乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, LDH)。通过检测释放的乳酸脱氢酶的活性，可表征细胞膜的完整性，实现对化合物细胞毒性的定量分析。
[0005]目前，电子烟烟液染毒对细胞膜的完整性影响还未见文献报道，亟需建立基于LDH测定的电子烟烟液细胞毒性评价方法，考察电子烟烟液细胞毒性的作用机理，定量准确评价市售电子烟产品烟液的细胞毒性。

【发明内容】

[0006]本发明的目的是建立的一种LDH测定的电子烟烟液细胞毒性评价方法，为电子烟产品的细胞毒性评价提供方法学支持。LDH法的测定原理是基于在乳酸脱氢酶的作用下，氧化型辅酶I (NAD+)被反应生成的还原型辅酶I (NADH)，再与氧化型2-(4-碘苯)-3-(4-硝基苯)-5-苯四唑(INT)在硫辛酰胺脱氢酶(diaphorase)的催化下反应生成强生色物甲臜(formazan )，在490nm波长下产生吸收峰，从而确定释放的乳酸脱氢酶的活性，作为细胞膜完整性的标志，实现对细胞毒性的定量分析。
[0007]本发明的目的是通过以下技术方案来实现的: 一种基于乳酸脱氢酶测定的电子烟烟液细胞毒性评价方法，包括以下步骤:
I)配制实验试剂:有以下几种:
(1)LDH基质液的配制:用0.2 mol/L的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐-盐酸(TriS-HCl)缓冲液(PH8.2)配制LDH基质液，其中各成分及其终浓度分别为:乳酸锂5X IO-2 mol/L、硝基氯化四氮唑(INT) 6.6X10—4 mol/L、吩嗪二甲酯硫酸盐(PMS) 2.8X10—4 mol/L、氧化型辅酶I (NAD) 1.3X 10_3 mol/L, LDH基质液应在临用前配制；
(2)细胞裂解液:20%的曲拉通100(Triton-100)；
(3)终止液:4M的盐酸(HCl)溶液；
(4)细胞培养基:溶剂为RPM1-1640培养基，其中胎牛血清的体积百分比为10%，L-谷氨酰胺的浓度为2 mM,青霉素的浓度为100 IU/ml，链霉素的浓度为100 μ g/ml ；
(5)电子烟烟液染毒溶液:由于电子烟烟液的主要组成成分包括丙二醇、丙三醇等保润齐U，导致电子烟烟液溶液密度较大，无法准确移取体积进行染毒溶液的配制。因此，本发明中使用精度不小于万分之一的分析天平对电子烟烟弹液进行准确称量，然后使用细胞培养基溶液配制。电子烟烟液染毒浓度范围应覆盖为10mg/ml-120 mg/ml,应设置不少于7个非零染毒浓度。
[0008]2)细胞接种:本方法所用细胞系为中国仓鼠卵巢细胞CHO细胞。在考察电子烟烟液对CHO细胞系的细胞毒性时，需开展预实验，对细胞接种密度进行优化。向96孔板的每孔中加入100 μ L细胞悬液，按照优化好的细胞接种密度进行细胞接种，96孔板的最外周36个孔中每孔加入100 μ I生长培养液作为空白对照，其余每孔加入100 μ I细胞悬液，于37 0C >5% C02条件下培养24 h ；
3)电子烟烟液染毒:细胞培养至指数增长期后，吸去培养液，96孔板(除最外周36孔)每6孔为一组，分别设置正常对照组、7个不同剂量的电子烟烟液染毒组和LDH最大释放组(细胞中能释放出来的LDH最大量)，正常对照组和LDH最大释放组均每孔加入100 μ I的细胞培养基，电子烟烟液染毒组每孔加入100 μ I不同浓度的电子烟烟液染毒溶液，96孔板的最外周36个孔中选择其中6个孔作为培养基背景对照，再选择6个孔加入最高电子烟烟液染毒溶液作为染毒溶液背景对照，于37 °C、5% C02条件下培养24 h。
[0009]4)LDH测定:电子烟烟液对细胞染毒24h，染毒结束前15分钟，在最大释放量孔中加入5 μ I裂解液。染毒结束后使用250g离心力对细胞培养板离心5分钟，每孔移取50 μ I上清至透明96孔板，加入100 μ ILDH基质液，反应一段时间后，加入50 μ I终止液，使用酶标仪检测每孔在490 nm波长处的吸光值。
[0010]6)结果与分析
原始吸光值A:A = A490 nm A (染毒孔吸光度值)=6个平行孔的吸光度平均值 A (染毒溶液背景)=6个平行孔的吸光度平均值 A (培养基背景)=6个平行孔的吸光度平均值 A(空白对照组)=6个平行孔的吸光度平均值 A (最大释放组)=6个平行孔的吸光度平均值
【权利要求】
1.一种基于乳酸脱氢酶测定的电子烟烟液细胞毒性评价方法，其特征在于:包括以下步骤: 1)配制实验试剂: (1)LDH基质液的配制:用0.2mol/L的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐-盐酸(Tris-HCl)缓冲液(PH8.2)配制LDH基质液，其中各成分及其终浓度分别为:乳酸锂5 X IO-2 mol/L、硝基氯化四氮唑(INT) 6.6X10—4 mol/L、吩嗪二甲酯硫酸盐(PMS) 2.8X10—4 mol/L、氧化型辅酶I (NAD) 1.3X 10_3 mol/L, LDH基质液应在临用前配制； (2)细胞裂解液:20%的曲拉通100(Triton-100)； (3)终止液:4M的盐酸(HCl)溶液； (4)细胞培养基:溶剂为RPM1-1640培养基，其中胎牛血清的体积百分比为10%，L-谷氨酰胺的浓度为2 mM,青霉素的浓度为100 IU/ml，链霉素的浓度为100 μ g/ml ； (5)电子烟烟液染毒溶液:用分析天平对电子烟烟液进行准确称量，然后使用细胞培养基溶液配制，电子烟烟液染毒浓度范围10mg/mfl20 mg/ml，设置不少于7个非零染毒浓度； 2)细胞接种:所用细胞系为中国仓鼠卵巢细胞CHO细胞，向96孔板的每孔中加入100μ L细胞悬液，按照优化好的细胞接种密度进行细胞接种，96孔板的最外周36个孔中每孔加入100 μ I生长培养液作为空白对照，其余每孔加入100 μ I细胞悬液，于37 °C、5%C02条件下培养24 h ； 3)电子烟烟液染毒:细胞培养至指数增长期后，吸去培养液，96孔板(除最外周36孔)每6孔为一组，分别设置正常对照组、7个不同剂量的电子烟烟液染毒组和LDH最大释放组，正常对照组和LDH最大释放组均每孔加入100 μ I的细胞培养基，电子烟烟液染毒组每孔加入100 μ I不同浓度的电子烟烟液染毒溶液，96孔板的最外周36个孔中选择其中6个孔作为培养基背景对照，再选择6个孔加入7个剂量中的最高剂量电子烟烟液染毒溶液作为染毒溶液背景对照，于37 °C、5% CO2条件下培养24 h； 4)LDH测定:染毒结束前15分钟，在LDH最大释放量孔中加入5 μ I裂解液，染毒结束后使用250g离心力对细胞培养板离心5分钟，每孔移取50 μ I上清至透明96孔板，加入100 μ ILDH基质液，反应一段时间后，加入50 μ I终止液，使用酶标仪检测每孔在490 nm波长处的吸光值； 5)结果与分析 原始吸光值A:A = A490 nm A (染毒孔吸光度值)=6个平行孔的吸光度平均值 A (染毒溶液背景)=6个平行孔的吸光度平均值 A (培养基背景)=6个平行孔的吸光度平均值 A(空白对照组)=6个平行孔的吸光度平均值 A (最大释放组)=6个平行孔的吸光度平均值
2.根据权利要求1所述的基于乳酸脱氢酶测定的电子烟烟液细胞毒性评价方法，其特征在于:在开展细胞毒性评价前，需对染毒所用细胞株的细胞接种密度进行优化，选择LDH最大释放量与空白对照组吸光度值相差最大，且细胞处于指数增长期的细胞个数作为最优细胞接种密度，本发明中CHO细胞的最佳接种密度为10000个/孔。
3.根据权利要求1所述的基于乳酸脱氢酶测定的电子烟烟液细胞毒性评价方法，其特征在于:细胞裂解液使用时其终浓度为1%。
4.根据权利要求1所述的基于乳酸脱氢酶测定的电子烟烟液细胞毒性评价方法，其特征在于:LDH基质液的反 应时间为15min。
【文档编号】G01N33/00GK103808906SQ201410094851
【公开日】2014年5月21日 申请日期:2014年3月16日 优先权日:2014年3月16日
【发明者】陈欢, 杨进, 刘洋, 刘彤, 韩书磊, 吴帅宾, 付立伟, 侯宏卫, 胡清源 申请人:国家烟草质量监督检验中心