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专利名称：一种Micro RNA表达检测方法及其定量检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种Micro RNA表达检测方法及其定量检测试剂盒。
背景技术：
Micro RNA是近年来在多种真核细胞及病毒中发现的一类来源内源性染色体上的非编码单链RNA，长度为21 25nt的短序列，在进化上具有高度的保守性，能够通过与靶mRNA特异性的碱基互补配对，引起靶mRNA降解或者抑制其翻译，从而对基因进行转录后的表达调控(O'Donnell KA, Wentzel EA, Zeller KI, et al.e-Myc-regulated microRNAsmodulate E2F1 expression [J].Nature, 2005, 4 (7043): 839.) 由于 Micro RNA 序列在不同的生物中具有一定的保守性，目前普遍认为Micro RNA的功能是参与生命的一些基本过程，如发育过程中的细胞增殖、细胞死亡、应激反应和脂肪代谢等，越来越多的证据表明Micro RNA在细胞中起着调控基因表达的重要作用。最近的研究发现Micro RNA与细胞的癌变有着极为密切的关系，已经发现Micro RNA与肺癌、结直肠肿瘤、伯基特淋巴瘤和慢性淋巴细胞白血病等肿瘤疾病有关(M eltzer PS.Cancer genemics:Small RNAs with bigimpacts[J].Nature, 2005, 435(7043):745.)。由于Micro RNA分子只有20_25nt左右大小，检测较为困难。以前主要采用的方法是Northern blot等杂交的方法进行检测,方法繁琐,不易成功,且Micro RNA极易降解，对于结果影响也较大。为了克服之前检测方法的缺陷，Allawi等建立了 Invader Assay的方法(AllawiHT, Deahlberg JE, OlsonS, et al.Quantitation of Micro RNAs using a modifiedInvader assay.RNA, 2004, 10:1153-1161), Liu 等建立了寡核苷酸芯片方法(Liu C, CalmnGA, et al.An oligo nucleotide microchipfor genome-wide micro RNA profiling inhuman and mouse tissues.PNAS, 2004,101 (26):9740-9744),这种方法提高了检测的敏感性及实用性，但这种方法需要荧光标记和荧光仪或芯片检测仪，而且由于micro RNA分子太小，应用也受到一定的限制。如今,对Micro RNA前体的检测主要是采用RT-PCR的方法(Schmittgen TD, JiangJ, Liu Q, et al.A high-throughput method to monitor the expression of Micro RNAprecursors.Nucleic Acids Research.2004,32(4):e43),米用随机引物或与 Micro RNA前体互补的引物直接进行反转录，但是这仅仅只能针对特异的Micro RNA，而且半定量的方法不能准确地表现出Micro RNA的表达量，所以该方法已经渐渐退出了 Micro RNA分子的检测的行列。上述方法在反转录Micro RNA时都显得过于繁琐且效率不高，于是出现了一种“加尾法”，即在Micro RNA的3’末端进行延长并采用real-time PCR的方法对Micro RNA进行检测。常见的加尾法有两种:一种是通过末端转移酶在Micro RNA分子的3'末端加上Poly-A尾巴(Shi R, Chiang V L.Facile means for quantifying Micro RNA expressionby real-time PCR[J].BioTechniques, 2005，39 (4): 519-525.)，用 30 40 个核苷酸的Oligo-dT作为引物进行反转录得到被延长的cDNA，可以使用SYBR Green进行实时定量PCR检测；另一种是直接使用与Micro RNA末端配对的加长引物反转录成cDNA，而后使用LNA修饰的引物通过Real-time PCR法对Micro RNA的表达情况进行检测(RaymondC K, Roberts B S, Garrett—engele P.et al, Simple quantitative primer—extensionPCR for direct monitoring of Micro RNA and short-1nterfering RNAs[J].RNA, 2005.11(11):1737-1744.)。然而这两种方法中，随机加尾法合成出来的cDNA对于PCR而言相对过短，只适合使用探针的taq man法检测,而加特异性micro RNA末端配对尾部的方法，只能合成Micro RNA特异性的cDNA,无法与内参同时反转,可能造成较大的误差。为了更高效地检测Micro RNA的表达量，并提高准确性，Chen等(Chen C，RidzonD A, Broomer A J, et al.Realtime quantification of micro RNAs by stem-loopRT-PCR[J].Nucleic Acids Res, 2005，33(20): 179.)在特异性 micro RNA 末端配对的加长引物反转录的基础上，将r eal time PCR技术引入到micro RNA的检测当中，建立了名为莖环的反转录定量PCR技术(stem-loop RT-PCR)0他首先设计了一个具有莖环结构的反转录的探针，然后采用Taq man的探针技术，对Micro RNA进行检测，据报道这种结构大大提高了 Micro RNA反转录的效率和特异性。但是这样高特异性的同时也导致了一次反转只能反转录出特异的一条Micro RNA，对于检测整体的Micro RNA及其他小片段RNA的表达状况来说是一种极大的制约，同时使用Taqman探针的方法也大大提高了 Micro RNA的检测成本。

发明内容
因此，本发明要解决的技术问题就是针对Micro RNA分子表达检测较为困难，现有的检测方法步骤繁琐、不易成功，并且所得Micro RNA极易降解，对结果有较大影响的缺陷，提供一种Micro RNA表达检测方法以及一种Micro RNA定量检测试剂盒。为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案之一是:一种Micro RNA表达检测方法，其中所述方法包括:(I)提取样品的Micro RNA,将所得Micro RNA连接PolyA尾巴；(2)将三条具有茎环结构的引物混合后进行退火处理，所述具有茎环结构的引物的序列分别如序列表中SEQ ID NO: 1、SEQ ID N0:2和SEQ IDN0:3所示;(3)将步骤(I)所得连有Poly A尾巴的Micro RNA与步骤(2)所得具有茎环结构的引物退火连接；(4)以步骤(3)所得Micro RNA为模板反转录得到cDNA ；(5)以步骤(4)所得cDNA为模板，加入扩增目标Micro RNA的引物，通过荧光定量PCR方法检测目标Micro RNA的表达。其中步骤(I)所述提取样品Micro RNA的方法为本领域的常规方法。所述样品Micro RNA的提取可以利用各种市售试剂盒进行。所述Micro RNA连接PolyA尾巴的方法为本领域常规使用的加尾方法，本发明所述加Poly A尾巴的方法较佳地包括:加入Poly A聚合酶，加入ATP溶液，将该混合液35 37°C反应10 15min即得。其中步骤(2)所述的三条具有茎环结构的引物为本领域常规引物。所述的三条具有茎环结构的引物的序列较佳地分别如序列表中SEQ ID NO: 1、SEQ ID N0:2和SEQ IDNO:3所示。其中所述具有茎环结构的引物的制备方法为本领域常规的制备方法，本发明所述具有茎环结构的弓I物较佳地为通过人工全序列合成即得。其中步骤(2)所述退火处理为本领域常规的退火处理技术。本发明所述退火处理的程序较佳地为:(1)95°C反应2min，(2)每5 10秒下降0.1°C，降至35°C 15°C，(3)4°C保存，更佳地为(1)95°C反应2min，(2)每8秒下降0.1°C，降至25°C，(3)4°C保存。其中步骤(3)所述退火连接的程序较佳地为:60 70°C，反应5 lOmin，即得。其中步骤(4)所述反转录为本领域常规反转录技术，本发明所述反转录的程序较佳地为:(1) 30°C反应10 15分钟；(2) 42 V反应50 60分钟；(3) 50°C反应10 15分钟；
(4)95°C反应10 15分钟；(5)将所得cDNA样品于4°C保存。其中步骤(5)所述扩增目标Micro RNA的引物为:Micro RNA通用反向引物和Micro RNA检测正向引物。其中所述Micro RNA通用反向引物为本领域常规的Micro RNA通用反向引物，本发明所述Micro RNA通用反向引物序列较佳地为:5’ -CTGCAGTGGCGGACCA-3’，如序列表中SEQ ID NO:4 所示。其中所述Micro RNA检测正向引物为本领域常规的Micro RNA检测正向引物，本发明所述Micro RNA检测正向引物较佳地为:Has-MiR_365a检测正向引物:5’-TAATGCCCCTAAAAATCCTTAT-3’，该引物序列如序列表中SEQ ID NO: 5所示。所述扩增目标Micro RNA的引物的制备方法为本领域常规制备方法，较佳地为人工全序列合成即得。其中步骤(5)所述荧光定量PCR为本领域常规使用的荧光定量PCR技术(或称为real time PCR技术，简称为 qPCR或者qRT-PCR)。针对不同的目标Micro RNA可采用不同的荧光定量PCR程序进行检测。本发明所述荧光定量PCR的程序较佳地为:(I)预变性95。。，I分钟;(2)变性95°C，5S ;(3)退火延伸60°C,20S ;步骤(2) (3)共进行40个循环，每次在延伸阶段读取吸光值。为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案之二是:一种具有茎环结构的引物，所述具有茎环结构的引物的序列如序列表中SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 3所
/Jn ο其中所述具有茎环结构的引物为本领域常规的具有茎环结构的引物，本发明所述具有茎环结构的引物较佳地为:Oligol:5’ -GTCGGAGAGACTGCAGTGGCGGACCAATTCGCACTCTCTCCGACTTTTTTTTA-3’(如序列表中 SEQID NO:1 所示)；01igo2:5，-GTCGGAGAGACTGCAGTGGCGGACCAATTCGCACTCTCTCCGACTTTTTTTTC-3’(如序列表中 SEQID NO:2 所示)；01igo3:5’ -GTCGGAGAGACTGCAGTGGCGGACCAATTCGCACTCTCTCCGACTTTTTTTTG-3’(如序列表中 SEQID NO:3 所示)。其中所述具有茎环结构的引物的制备方法为常规制备方法，本发明所述具有茎环结构的引物较佳地为全序列人工合成即得。
为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案之三是:一种Micro RNA定量检测试剂盒，该Micro RNA定量检测试剂盒包括:SYBR Green I荧光染料、PCR缓冲液、dNTPs溶液、DNA聚合酶、无菌双蒸水、具有颈环结构的引物、通用反向引物和Micro RNA检测正向引物，其中所述具有颈环结构的引物的序列分别如序列表中SEQ ID NO: K SEQ ID N0:2和SEQID NO:3 所示。
其中所述SYBR Green I荧光染料、PCR缓冲液、dNTPs溶液、DNA聚合酶、无菌双蒸水均为本领域常规的市售实验试剂。其中所述通用反向引物为本领域常规的通用反向引物。本发明所述Micro RNA通用反向引物序列较佳地为:5’ -CTGCAGTGGCGGACCA-3’，如序列表中SEQ ID N0:4所示。其中所述Micro RNA检测正向引物为本领域常规的Micro RNA检测正向引物，本发明所述Micro RNA检测正向引物较佳地为Has_MiR-365a检测正向引物:5’ -TAATGCCCCTAAAAATCCTTAT-3’，其序列如序列表中 SEQ IDNO:5 所示。其中所述具有颈环结构的引物的序列较佳地分别如序列表中SEQ IDNO: USEQ IDN0:2和SEQ ID N0:3所示。其中所述引物的制备方法为本领域常规制备方法，较佳地为人工合成制备即得。其中所述Micro RNA定量检测试剂盒，较佳地还包括RNA提取试剂和/或反转录试剂。其中所述的RNA提取试剂较佳地为:Trizol试剂、RNA酶抑制剂。其中所述的反转录试剂较佳地为:逆转录酶(AMV)、AMV缓冲液。其中所述AMV缓冲液较佳地包括:dNTPs、随机引物、RNA酶抑制剂。所述试剂的制备方法为本领域常规制备方法，较佳地为市售所得。其中所述Micro RNA定量检测试剂盒较佳地还包括内参引物。本发明所述内参引物为本领域常规的内参引物，本发明所述内参引物较佳地为U6-F和U6-R引物，所述内参引物的序列如下所示:U6-F:5’ -CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，如序列表中 SEQ ID NO: 6 所示；U6-R:5’ -AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’，如序列表中 SEQ ID N0:7 所示。所述内参引物制备方法为本领域常规制备方法，较佳地为人工合成序列。本发明所用的原料或试剂除特别说明之外，均市售可得。相比于现有技术，本发明的有益效果如下:1、本发明提供的Micro RNA表达检测方法利用所述具有茎环结构的引物，通过一次反转录几乎可以得到待测样品中所有的Micro RNA样本，以及内参基因(U6基因，该基因为IOObp左右的mRNA)，大大提高了 Micro RNA的检测效率。2、本发明提供的具有茎环结构的引物，经过退火处理后，能够大幅降低引物二聚体及复杂发卡结构的生成，从而最大幅度地提高了该引物对于Micro RNA的反转效率。本发明所述Micro RNA定量检测试剂盒利用所述具有颈环结构的引物，可以通过一次反转录反应，完成包括内参以及待检Micro RNA在内的反转录,大大降低了分步反转Micro RNA及内参的小片段mRNA所产生的系统误差，该方法简单高效，从而大幅节省了时间和成本。


图1 (A)为Cal-27细胞qPCR内参基因(U6)扩增曲线；图1 (B)为Cal_27细胞qPCR内参基因(U6)熔解曲线图；图1 (C)为Cal-27细胞qPCR待检基因(MiR_365a)扩增曲线；图1 (D)为Cal-27细胞qPCR待检基因(MiR_365a)熔解曲线图。其中a为Cal_27细胞样本重复1，b为Cal-27细胞样本重复2，c为Cal-27细胞样本重复3。图2 (A)为H印-2细胞qPCR内参基因(U6)扩增曲线；图2 (B)为H印_2细胞qPCR内参基因(U6)熔解曲线图；图2 (C)为H印-2细胞qPCR待检基因(MiR_365a)扩增曲线；图2 (D)为H印-2细胞qPCR待检基因(MiR_365a)熔解曲线图。其中d为!fep-2细胞样本重复1，e为!fep-2细胞样本重复2，f为!fep-2细胞样本重复3。图3 (A)为LOVO细胞qPCR内参基因(U6)扩增曲线；图3 (B)为LOVO细胞qPCR内参基因(U6)熔解曲线图；图3 (C)为LOVO细胞qPCR待检基因(MiR_365a)扩增曲线；图3 (D)为LOVO细胞qPCR待检基因(MiR_365a)熔解曲线图。其中g为LOVO细胞样本重复1，h为LOVO细胞样本重复2，i为LOVO细胞样本重复3。图4 (A)为MCF-7细胞qPCR内参基因(U6)扩增曲线；图4 (B)为MCF-7细胞qPCR内参基因(U6)熔解曲线图；图4 (C)为MCF-7细胞qPCR待检基因(MiR_365a)扩增曲线；图4 (D)为MCF-7细胞qPCR待检基因(MiR-365a)熔解曲线图。其中j为MCF-7细胞样本重复1，k为MCF-7细胞样本重复2，I为MCF-7细胞样本重复3。图5为Cal-27、Hep-2, LOVO, MCF-7细胞系中Micro RNA365a基础表达检测结果图。图6为对比实施例1中四种细胞系(Cal-27、H印-2、L0V0、MCF-7)的Micro RNA365a表达量检测结果图。
具体实施例方式主要仪器为:5417R台式冷冻高速离心机，thermo公司，商品号cat#5417R ；PCR 仪，cat#2500 ;`ThermoForma310 系列直热式 CO2 培养箱，thermo 公司，cat#3111 ；酶标仪Biotek 公司，VE-186 ；主要试剂为:PrimerScript反转录酶，Takara公司，商品号:cat#U1240 ；E.coli Poly(A)聚合酶，NEB 公司，商品号:#M0276S ；5 X退火缓冲液,碧云天公司，商品号:D0251 ；GXD kit iqSYBR Green, Bio-Rad 公司，商品号:1708882AP ；Cal-27 细胞株，购自 ATCC，商品号:CRL_2095 ；H印2细胞株，购自中科院细胞库，商品号:TCHu21 ；L0V0细胞株，购自中科院细胞库，商品号:TCHu82 ；MCF-7细胞株，购自中科院细胞库，目录号:TCHu74 ；改良RPM1-1640 培养基，购自 Hyclone，货号:SH30809.0lB ；FBS，胎牛血清，购自普飞生物，货号:1101-500 ；Penicillin-Streptomycin solution SP 双抗，购自 Hyclone,货号:J121071 ;Micro RNA抽提试剂盒:Micro RNApure Mini kit,购自康为世纪公司，货号:CW0627。实施例1Micro RNA反转录检测引物
本发明针对Micro RNA提供3条具有茎环结构的引物，所述茎环引物名称和序列分别如下所示:Oligol:5’ -GTCGGAGAGACTGCAGTGGCGGACCAATTCGCACTCTCTCCGACTITITITTA-3’(如序列表中 SEQ ID NO:1 所示)；01igo2:5’ -GTCGGAGAGACTGCAGTGGCGGACCAATTCGCACTCTCTCCGACTTTTTTTTC-3’(如序列表中 SEQ ID NO:2 所示)；01igo3:
5’ -GTCGGAGAGACTGCAGTGGCGGACCAATTCGCACTCTCTCCGACTTTTTTTTG-3’(如序列表中 SEQ ID NO:3 所示)。上述引物由捷瑞生物合成制备。本发明还利用了 Micro RNA通用反向引物和Has_MiR-365a检测正向引物，所述引物分别如下所示:Micro RNA 通用反向引物序列:5’-CTGCAGTGGCGGACCA-3’(如序列表中 SEQ IDN0:4所示)；Has-MiR-365a 检测正向引物:5’ -TAATGCCCCTAAAAATCCTTAT-3’(如序列表中 SEQID NO:5 所示)。本发明使用的内参引物为U6-F和U6-R引物，所述引物如下所示:U6-F:5’ -CTCGCTTCGGCAGCACA-3’(如序列表中 SEQ ID NO:6 所示)；U6-R:5’ -AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’(如序列表中 SEQ ID NO:7 所示)。上述引物均由捷瑞生物合成制备，所述引物的浓度均为lOOnmol/μ I。实施例2实验用各细胞系的制备无菌37°C，5%C02条件下，使用1640+10%FBS+1%SP培养基进行细胞贴壁培养，分别培养Cal-27、Hep2, LOVO, MCF-7细胞，于6cm培养皿中，待细胞生长至80%左右后，即可进行抽提Micro RNA实验。实施例3Micro RNA样品的制备1.单层培养细胞:吸去培养液，加入Buffer RLM (Micro RNA抽提缓冲液，Lot:04911C ;购自康为世纪，包含于Micro RNA提取试剂盒内，Cat:CW0627)，每IOcm2加入Iml Buffer RLM02.样品中加入Buffer RLM后反复吹打几次，使其充分裂解。室温放置5分钟，使蛋白核酸复合物完全分离。3.以每Iml Buffer RLM加入200 μ I氯仿的比例加入氯仿，盖好管盖，剧烈振荡15秒，室温放置5分钟。4.40C 12，OOOrpm离心15分钟，样品分为三层:红色有机相，中间层和无色水相，将上层无色水相移到一个新的离心管中。5.向步骤4得到的溶液中加入1/3倍体积的无水乙醇，混匀，将得到的溶液和沉淀一起转入已装入收集管(Collection Tube2ml)的吸附柱RM (Spin Column RM)中。若一次不能将全部溶液加入吸附柱，请分多次转入。12，OOOrpm离心30秒，离心后弃掉吸附柱RM，保留流出液。6.向步骤5得到的溶液中加入2/3倍体积的无水乙醇，混匀。7.将上步所得溶液和沉淀一起转入已装入收集管(Collection Tube2ml)的吸附柱RS(Spin Column RS)中。若一次不能将全部溶液加入吸附柱，请分多次转入。12，OOOrpm离心30秒，倒掉收集管中废液，将吸附柱RS重新放回收集管中。8.向吸附柱RS中加入700 μ I Buffer RffT (使用前检查是否加入无水乙醇)，室温12，OOOrpm离心30秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱RS重新放回收集管中。9.向吸附柱RS中加入500 μ I Buffer RW2 (使用前检查是否加入无水乙醇)，室温12，OOOrpm离心30秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱RS重新放回收集管中。10.重复步骤9。11.12，OOOrpm离心I分钟，倒掉收集管中的废液。将吸附柱RS置于室温数分钟，以彻底晾干。注意:此步骤的目的是将吸附柱RS中残留的乙醇去除，乙醇的残留会影响后续的酶促反应(酶切、PCR等)。12.将吸附柱RS置于一个新的无RNA酶(RNase-free)离心管(CollectionTubel.5ml)中，向吸附柱中间部位加入30 μ I的不含RNA酶的水(RNase-Free Water)，室温放置I分钟，12，OOOrpm离心I分钟，收集RNA溶液，得到的RNA溶液保存在_70°C，防止降解。13.使用酶标仪检测所得RNA浓度，检测所得Micro RNA浓度如表I所示:表IMicro RNA 浓度
权利要求
1.一种Micro RNA表达检测方法,其特征在于,所述Micro RNA表达检测方法包括以下步骤: (1)提取样品的MicroRNA，将所得Micro RNA连接PolyA尾巴； (2)将三条具有茎环结构的引物混合后进行退火处理，所述具有茎环结构的引物的序列分别如序列表中SEQ ID NO: 1、SEQ ID N0:2和SEQ IDN0:3所示; (3)将步骤(I)所得连有PolyA尾巴的Micro RNA与步骤(2)所得具有茎环结构的引物退火连接； (4)以步骤(3)所得MicroRNA为模板反转录得到cDNA ； (5)以步骤(4)所得cDNA为模板，加入扩增目标MicroRNA的引物，通过荧光定量PCR方法检测目标Micro RNA的表达。
2.如权利要求1所述的MicroRNA表达检测方法，其特征在于，步骤(2)所述退火处理的程序为:(1)95°C反应2min，(2)每5 10秒下降0.1°C，降至35°C 15°C，(3) 4°C保存。
3.如权利要求1所述的MicroRNA表达检测方法,其特征在于,步骤(3)所述退火连接的程序为:60 70°C，反应5 lOmin。
4.如权利要求1所述的MicroRNA表达检测方法,其特征在于,步骤(4)所述反转录的程序为:(1) 30°C反应10 15分钟；(2) 42°C反应50 60分钟；(3) 50°C反应10 15分钟；(4) 95°C反应10 15分钟；(5)将所得cDNA样品于4°C保存。
5.如权利要求1所述的MicroRNA表达检测方法，其特征在于，步骤(5)所述扩增目标Micro RNA的引物为:Micro RNA通用反向引物和MicroRNA检测正向引物，所述Micro RNA检测正向引物的序列如序列表中SEQID N0:5所示。
6.一种具有茎环结构的引物，其特征在于，所述具有茎环结构的引物的序列如序列表中 SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO:2 或 SEQ ID NO:3 所示。
7.一种Micro RNA定量检测试剂盒，其特征在于，该Micro RNA定量检测试剂盒包括:SYBR Green I荧光染料、PCR缓冲液、dNTPs溶液、DNA聚合酶、无菌双蒸水、具有颈环结构的引物、通用反向引物和Micro RNA检测正向引物，其中所述具有颈环结构的引物的序列分别如序列表中 SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO:2 和 SEQ ID NO:3 所示。
8.如权利要求7所述的MicroRNA定量检测试剂盒，其特征在于，所述Micro RNA检测正向引物的序列如序列表中SEQ ID N0:5所示。
9.权利要求7 8任一项所述MicroRNA定量检测试剂盒在检测Micro RNA表达中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种MicroRNA表达检测方法及其定量检测试剂盒。该方法包括(1)提取样品的MicroRNA，将该MicroRNA连接PolyA尾巴；(2)将三条具有茎环结构的引物混合后退火处理，(3)将连有PolyA尾巴的MicroRNA与具有茎环结构的引物退火连接，(4)以该MicroRNA为模板反转录得到cDNA，(5)以该cDNA为模板，加入扩增目标MicroRNA的引物，通过荧光定量PCR方法检测目标MicroRNA表达。所述方法通过一次反转录可得到待测对象所有的MicroRNA及内参基因，大大降低了引物二聚体以及复杂发卡结构的生成，大幅度提高了对MicroRNA的检测效率。
文档编号G01N21/64GK103205489SQ201310036690
公开日2013年7月17日 申请日期2013年1月30日 优先权日2013年1月30日
发明者姚远颋, 王海峰, 费倩岚, 谈竹君, 劳昕元 申请人:上海黄离生物科技有限公司