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专利名称：异柠檬酸测定试剂(盒)及异柠檬酸浓度测定方法
技术领域：
本发明涉及一种异柠檬酸测定试剂(盒)，同时本发明还涉及测定异柠檬酸浓度
的方法，属于食品检验测定技术领域。
背景技术：
异拧檬酸isocitric acid是拧檬酸的异构体，虽然量少，但广泛存在于生物界。 在落地生根属(Bryophyllum)等多汁植物的叶、或悬钩子类中特别多，生物能够利用的是D 型。是三羧酸循环中的一个成分。柠檬酸在鸟头酸酶的作用下可逆地生成异柠檬酸和顺鸟 头酸。在异柠檬酸脱氢酶(EC 1. 1. 1.41 ;EC 1. 1. 1.42)的作用下变成a-酮戊二酸，在异 柠檬酸裂合酶(isocitrate lyase, EC4. 1. 3. 1)的作用下变成琥珀酸与乙醛酸。
中华人民共和国国家标准，GB T16771-1997，规定了橙、柑、桔汁及其饮料中D_异 柠檬酸的测定方法_紫外分光光度法。该方法适用于判定橙、柑、桔浓縮汁和果汁，以及果 汁含量不低于2. 5%的橙、柑、桔汁饮料的总D-异柠檬酸的测定。其测定原理异柠檬酸脱 氢酶isocitrate dehydrogenase有两种类型以NAD为辅酶的酶(EC1. 1. 1. 41)和要NADP 为辅酶的酶(EC1. 1. 1.42)，两者催化同一反应。
异柠檬酸+NAD(P)+# a-酮戊二酸+C02 + NAP(P)H + H+ 在异柠檬酸脱氢酶催化下，样品中的D-异柠檬酸盐与NAD或NADP作用，生成NADH 或NADPH的含量，相当于D-异柠檬酸盐的量。在波长340nm处测定吸光度，确定样品中总 D-异柠檬酸的含量。

发明内容
本发明要解决的技术问题是提出 一 种利用酶倍增法(Enzymatic DoublingMethod)、酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶(偶)联法 (CoupleReaction)技术，计量/连续监测还原型烟酰胺辅酶(还原型辅酶)在340nm波长处 吸光度的变化，得以测定异柠檬酸浓度的方法，同时，本发明还将给出用以实现该方法的异 柠檬酸测定试剂(盒)，采用该试剂不仅可以在紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析 仪上进行异柠檬酸浓度测定，而且测定速度快、准确度高，因而可以得到切实的推广应用。
本发明异柠檬酸浓度测定方法如下 异柠檬酸+辅酶异柠檬酸脱氡酶二氧化碳+酮戊二酸+还原型辅酶 二氧化碳+乙酰_辅酶A+还原型铁氧还蛋白丙酮酸合成酶丙酮酸+辅酶A+氧
化型铁氧还蛋白 辅酶A+3-甲酰乙酸+辅酶丙二酸_半醛脱氡酶二氧化碳+乙酰_辅酶A+还原 型辅酶 这种方法应用异拧檬酸脱氢酶(isocitrate dehydrogenase ;EC 1.1.1.41; EC1. 1. 1. 42)酶(偶)联丙酮酸合成酶(pyruvate synthase ;EC 1. 2. 7. 1)、丙二酸—半醛脱氢酶(malonate-semialdehyde dehydrogenase ;EC 1. 2. 1. 18)酶促反应比色终点法。 异柠檬酸脱氢酶酶解异柠檬酸反应产生二氧化碳，再通过(偶)联合丙酮酸合成酶、丙二 酸-半醛脱氢酶的作用，最终二次将辅酶(在340nm处没有吸收峰)还原成为还原型辅酶 (在340nm处有吸收峰)，从而得以测定还原型辅酶在340nm处吸光度上升的程度，通过测 量340nm处吸光度上升的程度，可以测算异柠檬酸的浓度大小。 实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑，无论是单 剂、双剂还是三剂，如下成分关系的本发明异柠檬酸测定试剂(盒)较为理想缓冲液100,1/L稳定剂500,1/L辅酶3mmol/L异柠檬酸脱氢酶10000U/L丙酮酸合成酶12000U/L丙二酸_半醛脱氢酶12000U/L乙酰辅酶A7mmol/L还原型铁氧还蛋白12mmol/L3-甲酰乙酸12mmol/L本发明的异柠檬酸测定试剂(盒)可以是单剂，包括缓冲液、稳定剂、辅酶、异柠檬酸脱氢酶、丙酮酸合成酶、丙二酸_半醛脱氢酶、乙酰辅酶八、还原型铁氧还蛋白、3-甲酰乙酸c 也可以将上述单剂试剂配成如下双剂试剂
试剂1 缓冲液、稳定剂、辅酶、乙酰辅酶八、还原型铁氧还蛋白、3_甲酰乙酸。
试剂2 缓冲液、稳定剂、异柠檬酸脱氢酶、丙酮酸合成酶、丙二酸_半醛脱氢酶。 辅酶、异柠檬酸脱氢酶、丙酮酸合成酶、丙二酸-半醛脱氢酶、乙酰辅酶A、还原型
铁氧还蛋白、3-甲酰乙酸在试剂l或试剂2中的位置可以不限。试剂(盒)可以是干粉状
态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。 还可以将上述单剂试剂配成如下三剂试剂 试剂1 缓冲液、稳定剂、辅酶、乙酰辅酶八、还原型铁氧还蛋白、3_甲酰乙酸。
试剂2 缓冲液、稳定剂、丙酮酸合成酶、丙二酸_半醛脱氢酶。
试剂3 缓冲液、稳定剂、异柠檬酸脱氢酶。 辅酶、异柠檬酸脱氢酶、丙酮酸合成酶、丙二酸-半醛脱氢酶、乙酰辅酶A、还原型 铁氧还蛋白、3-甲酰乙酸在试剂l、试剂2或试剂3中的位置可以不限。试剂(盒)可以是 干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
无论是单剂、双剂还是三剂，本发明测定异柠檬酸浓度的方法，其辅酶可以是 NADP+、 NAD+或thio- NAD+中的一种。
具体实施例方式下面结合实施例子对本发明作进一步的说明。
实施例一本实施例的异柠檬酸测定试剂为单试剂，包括三(羧甲基)氨基甲烷_盐酸缓冲液 100mmol/L稳定剂500,1/L辅酶3mmol/L异柠檬酸脱氢酶10000U/L丙酮酸合成酶12000U/L丙二酸_半醛脱氢酶12000U/L乙酰辅酶A7mmol/L还原型铁氧还蛋白12mmol/L3-甲酰乙酸12mmol/L试剂全部溶解配好后，分装入瓶，进行冷冻干燥，制成干粉试剂；使用前，加入纯净水，复溶后使用。 在全自动生化分析仪上设定温度37t:，反应时间10分钟，起始吸光度《0. l，测 试主波长340nm，测试副波长405nm，被测异柠檬酸样品与试剂的体积比例为1/25，反应方 向为正反应(上升反应)，延迟时间大约0分钟左右，检测时间5分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测 主波长340nm吸光度上升的程度，从而测算出异柠檬酸的浓度大小。实施例二本实施例的异柠檬酸测:定试剂为双试剂，包括试剂i三(羧甲基)氨基甲烷_盐酸缓冲液 100mmol/L稳定剂50mmol/L辅酶3mmol/L乙酰辅酶A7mmol/L还原型铁氧还蛋白12mmol/L3-甲酰乙酸12mmol/L试剂2三(羧甲基)氨基甲烷_盐酸缓冲液 100mmol/L稳定剂50mmol/L异柠檬酸脱氢酶10000U/L丙酮酸合成酶12000U/L丙二酸_半醛脱氢酶12000U/L试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体双试剂，可以直接使用
在全自动生化分析仪上设定温度37°C，反应时间10分钟，起始吸光度《0. 1， 测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测异柠檬酸样品与试剂1、试剂2的体积比例为 2/20/5，反应方向为正反应(上升反应)，延迟时间大约0分钟左右，检测时间5分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测 主波长340nm吸光度上升的程度，从而测算出异柠檬酸的浓度大小。
实施例三 本实施例的异柠檬酸测定试剂为三试剂，包括
试剂1三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液 10Ommol/L
稳定剂 50mmol/L
辅酶 3mmol/L
乙酰辅酶A 7mmol/L
还原型铁氧还蛋白 12mmol/L
3-甲酰乙酸 12mmol/L
试剂2三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液 100mmol/L
稳定剂 500mmol/L
丙酮酸合成酶 12000U/L
丙二酸-半醛脱氢酶 12000U/L
试剂3三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液 100mmol/L 稳定剂 500mmol/L 异柠檬酸脱氢酶 10000U/L 试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体三试剂，可以直接使用。 测定异柠檬酸浓度时，在全自动生化分析仪上设定温度37t:，反应时间IO分钟，
起始吸光度《0. 1，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测异柠檬酸样品与试剂1、试剂
2、试剂3的体积比例为4/40/5/5，反应方向为正反应(上升反应)，延迟时间大约0分钟左
右，检测时间5分钟左右。 加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测 主波长340nm吸光度上升的程度，从而测算出异柠檬酸的浓度大小。 申请人:经过实验验证，采用以上发明内容中记载的其他测定方法均能达到本发明 的目的，鉴于测定步骤等情况与以上实施例类同，不另一一例举。 总之，实验证明采用本发明的测定方法完全可以通过一般生化分析仪器得出所 需的测定结果——空白试剂吸光度变化(AA/min)《0. 0009 ;吸光度时间反应曲线应呈上 升曲线直至终点；试剂可测有效(R > 0. 99)线形范围可达20mmol/L ;试剂测试的不准确 度，其相对偏差不超过±3% ;试剂测试的精密度(重复性)的变异系数(CV)《2% ;试剂 的灵敏度可达O. 024±0. 012 AA/mmol/L ;试剂在2-8"下保存，活性可以稳定一年；——本 发明灵敏度高、精确度好，线形范围宽广，稳定期长，足以便于推广应用。
权利要求
一种酶倍增法、酶比色法及酶联法的异柠檬酸的浓度测定方法，其方法如下异柠檬酸+辅酶 异柠檬酸脱氢酶 二氧化碳+酮戊二酸+还原型辅酶二氧化碳+乙酰辅酶A+还原型铁氧还蛋白丙酮酸合成酶 丙酮酸+辅酶A+氧化型铁氧还蛋白辅酶A+3-甲酰乙酸+辅酶丙二酸-半醛脱氢酶二氧化碳+ 乙酰-辅酶A+还原型辅酶将最终反应物置于紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度上升的程度，测算出异柠檬酸的浓度大小测定结果。
2. —种异柠檬酸测定试剂(盒)，主要成分包括试剂成分的浓度不一定只限于上述范围；在此范围内效果较好，在此范围外，试剂仍会 反应作用。其特征在于试剂(盒)可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液 体试剂，直接使用。
3. 根据权利要求2所述异柠檬酸测定试剂(盒)，其特征在于由缓冲液、稳定剂、辅酶、异柠檬酸脱氢酶、丙酮酸合成酶、丙二酸-半醛脱氢酶、乙酰 辅酶八、还原型铁氧还蛋白、3_甲酰乙酸组成单剂试剂。
4. 根据权利要求2所述异柠檬酸测定试剂(盒)，其特征在于由缓冲液、稳定剂、辅酶、异柠檬酸脱氢酶、丙酮酸合成酶、丙二酸-半醛脱氢酶、乙酰 辅酶八、还原型铁氧还蛋白、3_甲酰乙酸组成双剂试剂；试剂1，由缓冲液、稳定剂、辅酶、乙 酰辅酶八、还原型铁氧还蛋白、3_甲酰乙酸组成；试剂2，由缓冲液、稳定剂、异柠檬酸脱氢 酶、丙酮酸合成酶、丙二酸_半醛脱氢酶组成。辅酶、异柠檬酸脱氢酶、丙酮酸合成酶、丙二酸_半醛脱氢酶、乙酰辅酶八、还原型铁氧还蛋白、3-甲酰乙酸在试剂1或试剂2中的位置可以不限。
5. 根据权利要求2所述异柠檬酸测定试剂(盒)，其特征在于由缓冲液、稳定剂、辅酶、异柠檬酸脱氢酶、丙酮酸合成酶、丙二酸-半醛脱氢酶、乙酰辅酶八、还原型铁氧还蛋白、3_甲酰乙酸组成多剂试剂；试剂1，由缓冲液、稳定剂、辅酶、乙 酰辅酶八、还原型铁氧还蛋白、3-甲酰乙酸组成；试剂2，由缓冲液、稳定剂、丙酮酸合成酶、 丙二酸_半醛脱氢酶组成；试剂3，由缓冲液、稳定剂、异柠檬酸脱氢酶组成。辅酶、异柠檬 酸脱氢酶、丙酮酸合成酶、丙二酸-半醛脱氢酶、乙酰辅酶八、还原型铁氧还蛋白、3_甲酰乙 酸在试剂1、试剂2或试剂3中的位置可以不限。辅酶八+3-甲酰乙酸+辅酶丙酮酸+辅酶A+氧化型铁氧还蛋白 t -辅脱,纖 二氧化碳+乙酰_辅酶A+还原型辅酶缓冲液 稳定剂 辅酶异柠檬酸脱氢酶 丙酮酸合成酶 丙二酸_半醛脱氢酶 乙酰辅酶A 还原型铁氧还蛋 3-甲酰乙酸
6.根据权利要求2所述异柠檬酸测定试剂(盒)，其特征在于还包括稳定剂l-4000mmol/L或0. 1% _100%体积比。所述稳定剂为硫酸铵(A,niaSulfate)、甘油 (Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethylene glycol)及防腐剂中的至少一 种。
全文摘要
本发明涉及一种利用酶倍增法、酶比色法及酶联法技术的异柠檬酸测定试剂(盒)，同时本发明还涉及测定异柠檬酸浓度的方法、试剂的组成及成分，属于食品检验测定技术领域。本发明的试剂(盒)主要成分包括缓冲液、辅酶、乙酰辅酶A、还原型铁氧还蛋白、3-甲酰乙酸、异柠檬酸脱氢酶、丙酮酸合成酶、丙二酸-半醛脱氢酶及稳定剂；通过将样品与试剂按一定的体积比混合，使之发生一系列的酶促反应，再将反应物置于紫外/可见光分析仪下，检测主波长340nm处吸光度上升的程度，从而测算出异柠檬酸的浓度大小。
文档编号G01N35/00GK101793772SQ20091002853
公开日2010年8月4日 申请日期2009年2月4日 优先权日2009年2月4日
发明者王尔中 申请人:苏州艾杰生物科技有限公司