亚星游戏官网-www.yaxin868.com

VcLp15变体在基于TpN17的检测抗密螺旋体抗体的免疫测定中作为抗干扰添加剂的制作方法
【专利摘要】本发明涉及用于检测分离的样品中的抗苍白密螺旋体的TpN17抗原的抗体的方法，其中用霍乱弧菌脂蛋白15(VcLp15)的肽序列或其部分序列作为用于减少干扰(即用于最少化假阳性结果)的试剂。此外，本发明涉及包含VcLp15肽序列和分子伴侣的融合多肽，它们在免疫测定中作为用于减少干扰和用于最少化假阳性结果的添加剂的用途，及包含TpN17抗原和该VcLp15分子伴侣融合多肽的用于检测分离的样品中的抗苍白密螺旋体抗原的抗体的试剂盒。
【专利说明】VcLp15变体在基于TpN17的检测抗密螺旋体抗体的免疫测 定中作为抗干扰添加剂

【技术领域】
[0001] 本发明涉及用于检测分离的样品中的抗苍白密螺旋体（Treponema pallidum)的 TpN17抗原的抗体的方法，其中用霍乱弧菌脂蛋白15(VcLpl5)的肽序列作为用于减少干扰 和用于最少化假阳性结果的试剂。此外，本发明涉及包含VcLpl5肽序列和分子伴侣的融合 多肽，它们在免疫测定中作为用于减少干扰和用于最少化假阳性结果的添加剂的用途，及 包含TpN17抗原和该VcLpl5分子伴侣融合多肽的用于检测分离的样品中的抗苍白密螺旋 体抗原的抗体的试剂盒。

【背景技术】
[0002] 梅毒（Syphilis，又名Lues)是由隶属于螺旋体细菌家族的苍白密螺旋体引起的 严重感染性疾病。它主要通过性接触传播，但也可以在妊娠期间从孕妇传至胎儿。该疾病 表征为不同的临床阶段和长的潜伏、无症状感染期。许多感染个体未注意到症状，因此多年 未意识到其梅毒感染。初次感染有限，且通常引起小的无痛溃疡（第一阶段，"梅毒I (Lues I)"）。如果不进行青霉素治疗，则该疾病进展至第二阶段梅毒II (Lues II)(感染后约8 周），其产生流感样症状、非发痒性皮疹和肿胀淋巴结。几年后，在梅毒IlKLues III)阶 段，全身出现梅毒结节（syphilitic node)。最后的阶段（梅毒IV(Lues IV))表征为中枢 神经系统的破坏，最终导致神经和心脏障碍、全身麻搏（general paralysis)、共济失调、痴 呆和失明。
[0003] 虽然由于在20世纪中叶引入了青霉素而有有效的疗法可用，但梅毒仍是重要的 全球性健康问题，估计全世界每年有一千二百万例新的感染。必须可靠地鉴别密螺旋体感 染患者，以起始抗生素疗法，从而预防梅毒的进一步传播。因此，有必要提供可靠的诊断工 具（如免疫测定）来检测抗苍白密螺旋体的抗体。但是，为了在血清学应用中用作特异性 化合物，重组衍生的蛋白质必须满足几点要求，如溶解性、稳定性和抗原性。
[0004] TpN17(苍白密螺旋体菌株Nichols，17KDa)(其成熟形式是由134个氨基酸残基组 成的小蛋白质）是苍白密螺旋体（梅毒的病原体）的免疫显性抗原（1(：1111.1^1^11111111111〇1· (1998)，50, 27-44 ;Folia Microbial. (2003)48(4)，549-553)。抗 TpN17 的抗体在密螺旋体 感染的个体中常见且丰富，有必要在旨在敏感和可靠地检测密螺旋体感染的免疫测定中使 用 TpN17。
[0005] 但是，我们观察到，用TpN17作为抗原的免疫测定倾向于显示假阳性结果，即它提 供表面看来为阳性的信号，但实际上样品中不存在抗密螺旋体的抗体。这些干扰是罕见但 显著的现象。它们损害了免疫测定的特异性，且它们显然是由梅毒免疫测定中实际上不可 或缺的苍白密螺旋体抗原TpN17的使用引起。
[0006] 因此，本发明潜在的问题可以视为提供用于检测抗密螺旋体抗体时避免假阳性结 果和提高基于TpN17的免疫测定的特异性的工具和方法。
[0007] 发明概述
[0008] 通过权利要求所表征的本发明来解决该问题。具体而言，本发明涉及用于检 测分离的样品中抗苍白密螺旋体的TpN 17抗原的抗体的方法，其中用霍乱弧菌脂蛋白 15 (VcLpl5)的肽序列或其部分序列作为用于减少干扰，即用于最少化假阳性结果的试剂。 该VcLpl5多肽序列的部分序列可以包含SEQ ID NO. 1的氨基酸26-163。在另一实施方案 中，该VcLpl5肽序列或其部分序列与分子伴侣融合。
[0009] 本发明还涉及包含SEQ ID NO. 1的VcLpl5肽序列或其部分序列和分子伴侣的融 合多肽。在优选实施方案中，与VcLpl5肽序列融合的分子伴侣选自SlyD、SlpA、FkpA和 Skp〇
[0010] 在另一优选实施方案中，该融合多肽包含SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO. 3是大肠杆菌 (E. coli) SlyD 和 VcLpl5 的融合多肽（EcSlyD-VcLpl5)。
[0011] 本发明还涵盖包含VcLpl5肽和可选的分子伴侣的融合多肽作为添加剂在免疫测 定中减少干扰和最少化假阳性结果中的用途。
[0012] 在另一实施方案中，本发明涉及用于通过免疫测定检测分离的样品中抗苍白密螺 旋体抗原的抗体的试剂盒，其包含TpN17抗原、及含有VcLpl5肽和可选的分子伴侣的融合 多肽。
[0013] 本发明还涉及用于检测分离的样品中抗苍白密螺旋体的TpN17抗原的抗体的方 法，该方法包括 ：
[0014] a)通过将体液样品与存在于该样品中的该抗体可以特异性结合的特异性结合配 偶体混合来形成免疫反应混合物；
[0015] b)在向该样品加入该特异性结合配偶体之前、同时或之后向该免疫反应混合物加 入包含VcLpl5肽和可选的分子伴侣的融合多肽；
[0016] c)维持该免疫反应混合物足以使存在于该体液样品中的抗体与该特异性结合配 偶体进行免疫反应，以形成免疫反应产物的时期；和
[0017] d)检测该免疫反应产物中的任一种的存在和/或浓度。
[0018] 附图、附表和SEQ ID N0简述
[0019] 图1显示本发明的融合多肽EcSlyD-VcLpl5的近UV⑶光谱（紫外圆二色谱）；更 多细节见实施例4,实施例4描述通过⑶光谱监测的热诱导的EcSlyD-VcLpl5的解折叠。
[0020] 图2显示通过近UV区中的⑶光谱监测的本发明的融合多肽EcSlyD-VcLpl5的熔 解曲线。细节见实施例4。 图3显示具有与它的N端符合读框地融合的两个SlyD分子伴侣单位的密螺旋体TpN17 全长抗原23-156的示意图。为了表示该SlyD融合配偶体的大肠杆菌来源，将所示融合多 肽命名为 EcSlyD-EcSlyD-TpN17(23-156);还见 SEQ ID N0.8。
[0021] 表1显示用于本研究（实施例2)的融合多肽变体的蛋白质参数。
[0022] 表2至5显示按照实施例5对霍乱弧菌Lpl5在梅毒免疫测定中的抗干扰活性进 行的实验的结果。
[0023] 表2显示寡聚TpN17作为密螺旋体特异性抗原的结果，其中加入单体VcLpl5(与 作为分子伴侣的SlyD融合）来减少干扰。
[0024] 表3显示单体TpN17作为密螺旋体特异性抗原的结果，其中加入单体VcLpl5(与 作为分子伴侣的SlyD融合）来减少干扰。
[0025] 表4显示寡聚TpN17作为密螺旋体特异性抗原的结果，其中加入寡聚VcLpl5(与 作为分子伴侣的Skp融合）来减少干扰。
[0026] 表5显示单体TpN17作为密螺旋体特异性抗原的结果，其中加入寡聚VcLpl5(与 作为分子伴侣的Skp融合）来减少干扰。
[0027] SEQ ID NO. 1显示可从公共数据库UniProt检索号Q9KQN6检索到的霍乱弧菌脂 蛋白15 (VcLpl5)的完整氨基酸序列（163个残基）。氨基酸残基1-25组成信号序列；成熟 VcLpl5包含氨基酸残基26-163 (下划线）。
[0028] MMKKSIFALS ALTLILVGCD NQQDAKVEVE KVVDVAAAPA EQSAAQPSTA
[0029] SVDAAHNAQN SLDffAGIYQG TLPCADCGGI ETELTLNADG TYALTEKYLD
[0030] KEGEPFASQG TFVWNEAGNI VTLQTCDQTG RQFMVGENTL· SHLDMEGKVI
[0031] EGELAEFYVL SKQ
[0032] SEQ ID NO. 2显示用于与不同分子伴侣组件融合的VcLpl5序列（26-163)。成熟 VcLpl5序列（氨基酸残基26-163)缺乏N端信号序列（氨基酸残基1-25)，且缺乏半胱氨 酸残基。用丙氨酸残基（下划线）取代VcLpl5的74和77位（前体蛋白的编号）的两个 真实的半胱氨酸残基，以便于重折叠过程，并抑制二硫键加合物形成。VcLpl5在C端具有六 组氨酸标记（下划线），以便于纯化，并使得能够通过金属柱（Ni、Zn、Cu)进行基质偶联的 重折叠。
[0033] KVEVEKVVDV AAAPAEQSAA QPSTASVDAA HNAQNSLDWA GIYQGTLPAA
[0034] DAGGIETELT LNADGTYALT EKYLDKEGEP FASQGTFVWN EAGNIVTLQT
[0035] ⑶QTGRQFMV GENTLSHLDM EGKVIEGELA EFYVLSKQLE HHHHHH
[0036] SEQ ID N0. 3显示本发明的融合多肽EcSlyD_VcLpl5,其包含作为分子伴侣的一分 子大肠杆菌SlyD和成熟VcLpl5序列（26-163,下划线）。
[0037] MKVAKDLVVS LAYQVRTEDG VLVDESPVSA PLDYLHGHGS LISGLETALE GHEVGDKFDV
[0038] AVGANDAYGQ YDENLVQRVP KDVFMGVDEL QVGMRFLAET DQGPVPVEIT AVEDDHVVVD
[0039] GNHMLAGQNL KFNVEVVAIR EATEEELAHG HVHGAHDHHH DHDHDGGGSG GGSGGGSGGG
[0040] SGGGSGGGKV EVEKVVDVAA APAEQSAAQP STASVDAAHN AQNSLDffAGI YQGTLPAADA
[0041] GGIETELTLN ADGTYALTEK YLDKEGEPFA SQGTFVWNEA GNIVTLQTCD QTGRQFMVGE
[0042] NTLSHLDMEG KVIEGELAEF YVLSKQLEHH HHHH
[0043] SEQ ID NO. 4显示本发明的融合多肽EcSkp-VcLpl5,其包含作为分子伴侣的一分 子大肠杆菌Skp和成熟VcLpl5序列（26-163,下划线）。
[0044] MADKIAIVNM GSLFQQVAQK TGVSNTLENE FRGRASELQR METDLQAKMK KLQSMKAGSD
[0045] RTKLEKDVMA QRQTFAQKAQ AFEQDRARRS NEERGKLVTR IQTAVKSVAN SQDIDLVVDA
[0046] NAVAYNSSDV KDITADVLKQ VKGGGSGGGS GGGSGGGSGG GSGGGKVEVE KVVDVAAAPA
[0047] EQSAAQPSTA SVDAAHNAQN SLDffAGIYQG TLPAADAGGI ETELTLNADG TYALTEKYLD
[0048] KEGEPFASQG TFVWNEAGNI VTLQTCDQTG RQFMVGENTL· SHLDMEGKVI EGELAEFYVL
[0049] SKQLEHHHHH H
[0050] SEQ ID NO. 5显示从公共数据库UniProt检索号UniProt ID P29722下检索的苍 白密螺旋体抗原的完整TpN17序列（氨基酸残基1-156)。
[0051] MKGSVRALCA FLGVGALGSA LCVSCTTVCP HAGKAKAEKV ECALKGGIFR
[0052] GTLPAADCPG IDTTVTFNAD GTAQKVELAL EKKSAPSPLT YRGTWMVRED
[0053] GIVELSLVSS EQSKAPHEKE LYELIDSNSV RYMGAPGAGK PSKEMAPFYV
[0054] LKKTKK
[0055] SEQ ID NO. 6显示实施例5中所用的TpN17序列。对于此免疫测定，使用了缺乏信 号序列（氨基酸残基1-22)的成熟TpN17蛋白质（氨基酸残基23-156)。我们发现，TpN17 的四个真实的半胱氨酸残基对蛋白质的抗原性而言可有可无（数据未显示）。因此，用丙氨 酸残基（下划线）取代了 25、29、42和58位（前体蛋白的编号）的半胱氨酸残基，以便于 重折叠过程，并抑制有害的副反应，如二硫键加合物形成。
[0056] VSATTVAPHA GKAKAEKVEA ALKGGIFRGT LPAADAPGID TTVTFNADGT
[0057] AQKVELALEK KSAPSPLTYR GTWMVREDGI VELSLVSSEQ SKAPHEKELY
[0058] ELIDSNSVRY MGAPGAGKPS KEMAPFYVLK KTKK
[0059] SEQ ID N0. 7显示用于与不同分子伴侣组件融合的TpN17序列氨基酸残基 23-156(还见SEQ ID N0. 6)。TpN17在C端具有六组氨酸标记（下划线），以便于纯化，并 使得能够通过金属柱（Ni、Zn、Cu)进行基质偶联的重折叠。省去了 TpN17的N端信号序列 (氨基酸残基1-22)，以获得处于其天然样构象的成熟（加工）形式的蛋白质。
[0060] VSATTVAPHA GKAKAEKVEA ALKGGIFRGT LPAADAPGID TTVTFNADGT
[0061] AQKVELALEK KSAPSPLTYR GTWMVREDGI VELSLVSSEQ SKAPHEKELY
[0062] ELIDSNSVRY MGAPGAGKPS KEMAPFYVLK KTKKLEHHHH HH
[0063] SEQ ID NO. 8显示已在N端融合了两分子大肠杆菌SlyD( "串联SlyD"）的TpN17 序列（下划线）；此分子也称为EcSlyD-EcSlyD-TpN17或EcSS-TpN17。
[0064] MKVAKDLVVS LAYQVRTEDG VLVDESPVSA PLDYLHGHGS LISGLETALE GHEVGDKFDV
[0065] AVGANDAYGQ YDENLVQRVP KDVFMGVDEL QVGMRFLAET DQGPVPVEIT AVEDDHVVVD
[0066] GNHMLAGQNL KFNVEVVAIR EATEEELAHG HVHGAHDHHH DHDHDGGGSG GGSGGGSGGG
[0067] SGGGSGGGKV AKDLVVSLAY QVRTEDGVLV DESPVSAPLD YLHGHGSLIS GLETALEGHE
[0068] VGDKFDVAVG ANDAYGQYDE NLVQRVPKDV FMGVDELQVG MRFLAETDQG PVPVEITAVE
[0069] DDHVVVDGNH MLAGQNLKFN VEVVAIREAT EEELAHGHVH GAHDHHHDHD HDGGGSGGGS
[0070] GGGSGGGSGG GSGGGVSATT VAPHAGKAKA EKVEAALKGG IFRGTLPAAD APGIDTTVTF
[0071] NADGTAQKVE LALEKKSAPS PLTYRGTWMV REDGIVELSL VSSEQSKAPH EKELYELIDS
[0072] NSVRYMGAPG AGKPSKEMAP FYVLKKTKKL EHHHHHH
[0073] SEQ ID NO. 9显不已在N端融合了两分子多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida)SlyD( "串联SlyD"）的TpN17序列（下划线）；此分子也称为 PmSlyD-PmSlyD-TpN17 或 PmSS-TpN17。
[0074] MKIAKNVVVS IAYQVRTEDG VLVDEAPVNQ PLEYLQGHNN LVIGLENALE GKAVGDKFEV
[0075] RVKPEEAYGE YNENMVQRVP KDVFQGVDEL VVGMRFIADT DIGPLPVVIT EVAENDVVVD
[0076] GNHMLAGQEL LFSVEVVATR EATLEEIAHG HIHQEGGGGS GGGSGGGGGS GGGSGGGKIA
[0077] KNVWSIAYQ VRTEDGVLVD EAPVNQPLEY LQGHNNLVIG LENALEGKAV ⑶KFEVRVKP
[0078] EEAYGEYNEN MVQRVPKDVF QGVDELVVGM RFIADTDIGP LPVVITEVAE NDVVVDGNHM
[0079] LAGQELLFSV EVVATREATL EEIAHGHIHQ EGGGGSGGGS GGGSGGGSGG GSGGGVSATT
[0080] VAPHAGKAKA EKVEAALKGG IFRGTLPAAD APGIDTTVTF NADGTAQKVE LALEKKSAPS
[0081] PLTYRGTWMV REDGIVELSL VSSEQSKAPH EKELYELIDS NSVRYMGAPG AGKPSKEMAP
[0082] FYVLKKTKKL EHHHHHH
[0083] SEQ ID NO. 10显示已在N端融合了一分子大肠杆菌FkpA的TpN17序列（下划 线）；此分子也称为EcFkpA-TpN17。
[0084] MAEAAKPATT ADSKAAFKND DQKSAYALGA SLGRYMENSL KEQEKLGIKL DKDQLIAGVQ
[0085] DAFADKSKLS DQEIEQTLQA FEARVKSSAQ AKMEKDAADN EAKGKEYREK FAKEKGVKTS
[0086] STGLVYQVVE AGKGEAPKDS DTVVVNYKGT LIDGKEFDNS YTRGEPLSFR LDGVIPGWTE
[0087] GLKNIKKGGK IKLVIPPELA YGKAGVPGIP PNSTLVFDVE LLDVKPAPKA DAKPEADAKA
[0088] ADSAKKGGGS GGGSGGGSGG GSGGGSGGGV SATTVAPHAG KAKAEKVEAA LKGGIFRGTL
[0089] PAADAPGIDT TVTFNADGTA QKVELALEKK SAPSPLTYRG TWMVREDGIV ELSLVSSEQS
[0090] KAPHEKELYE LIDSNSVRYM GAPGAGKPSK EMAPFYVLKK TKKLEHHHHH Η
[0091] SEQ ID NO. 11显示已在Ν端融合了一分子大肠杆菌Skp的ΤρΝ17序列（下划线）； 此分子也称为EcSkp-TpN17。
[0092] MADKIAIVNM GSLFQQVAQK TGVSNTLENE FRGRASELQR METDLQAKMK KLQSMKAGSD
[0093] RTKLEKDVMA QRQTFAQKAQ AFEQDRARRS NEERGKLVTR IQTAVKSVAN SQDIDLVVDA
[0094] NAVAYNSSDV KDITADVLKQ VKGGGSGGGS GGGSGGGSGG GSGGGVSATT VAPHAGKAKA
[0095] EKVEAALKGG IFRGTLPAAD APGIDTTVTF NADGTAQKVE LALEKKSAPS PLTYRGTWMV
[0096] REDGIVELSL VSSEQSKAPH EKELYELIDS NSVRYMGAPG AGKPSKEMAP FYVLKKTKKL
[0097] EHHHHHH
[0098] SEQ ID NO. 12显示可以用作几个分子伴侣部分之间的柔性、可溶和蛋白酶抗性间 隔区或接头的富含甘氨酸的间隔区（包含由丝氨酸分开的三甘氨酸单位）的氨基酸序列。
[0099] GGGSGGGSGG GSGGGSGGGS GGG
[0100] 发明详述
[0101] 如本发明人可以证明，用于检测抗苍白密螺旋体的抗体的免疫测定倾向于显示假 阳性结果。具体而言，在使用密螺旋体抗原TpN17时，假阳性信号的数目显著提高。已用明 确表征为抗密螺旋体阴性的人血清观察到了这种现象：在使用TpN17抗原时，发现了显著 数目的假阳性（见实施例5)。但是，TpN17是密螺旋体感染中极其重要的免疫原和梅毒血 清学中最重要的抗原。因此，通过简单地舍弃TpN17抗原来避免此干扰问题不是可行的选 择。
[0102] 我们因此开始设计能够可靠和灵敏地检测抗TpN17抗体的重组TpN17变体。更确 切地说，我们通过富含甘氨酸和丝氨酸残基的柔性接头将TpN17与赋予溶解性的分子伴侣 (串联SlyD，即EcSlyD-EcSlyD和PmSlyD-PmSlyD)融合。由于所融合的助折叠蛋白的有益 作用，得到的融合多肽符合用于血清学目的（即用于免疫测定）良好抗原的所有物理化学 和免疫学要求。
[0103] 我们设计用于自动梅毒免疫测定的分子伴侣-TpN17融合蛋白质具有高度可溶和 反应性，并有利地用于双抗原夹心形式。如上文所提到，在梅毒免疫测定的可行性研究期 间，结果证明TpN17确实是具有杰出诊断意义的免疫显性密螺旋体抗原。换言之，为了保证 所希望的灵敏度，有必要在梅毒免疫测定中使用TpN17变体。但是，当在双抗原夹心（DAGS) 形式中使用TpN17的分子伴侣多肽融合构建体时，此问题变得明显：即使已以不对称方式 (即通过在生物素一侧和钌一侧使用不同的融合配偶体来有意地去除DAGS形式的对称性） 设计了 TpN17融合构建体，且尽管用分子伴侣聚合物作为抗干扰添加剂，在一系列良好表 征的抗密螺旋体阴性人血清中还是出现了相当多的阳性结果，导致测定特异性的实质性恶 化。显然，一些抗密螺旋体阴性人血清包含至少一种能够与TpN17抗原特异性相互作用的 未知因子。
[0104] 令我们惊奇的是，如在实施例5和表2-5中可见，结果证明，向免疫测定混合物中 加入重组衍生的来自人病原体霍乱弧菌（尽管存在某些序列同源性，但其是与苍白密螺旋 体极不相关的生物）的蛋白质Lpl5(VcLpl5)将提高的假阳性信号降低至阴性血清的信号 水平。我们得出结论，VcLpl5(在以非标记形式加入时）能够识别、结合和猝灭（quench)抗 TpN17的一种或多种未知的干扰因子。结果确实证明，VcLpl5是用于减少基于密螺旋体抗 原TpN17的梅毒免疫测定的假阳性结果和改善其特异性的非常宝贵的工具。
[0105] 具体而言，本发明涉及用于检测分离的样品中抗苍白密螺旋体的TpN17抗原的抗 体的方法，其中用霍乱弧菌脂蛋白15(VcLpl5)的肽序列或其部分序列作为用于减少干扰 和用于最少化假阳性结果的试剂。
[0106] 可以使用任意TpN17抗原或其变体，只要该抗原的构象足够像天然构象，以被存 在于样品中的抗体识别。在其天然宿主苍白密螺旋体中，TpN17的N端信号序列（残基 1-22)从前体蛋白切下，以允许成熟TpN17部分折叠为其天然构象。换言之，在诸如大肠杆 菌的原核宿主中重组产生TpN17时，信号序列可有可无。它反而妨碍靶分子的正确折叠，因 此将它省去。优选地，使用UniProt ID P29722(SEQ ID N0. 5)或SEQ ID N0. 6的肽序列或 SEQ ID NO. 5或6的部分序列。该部分序列包含SEQ ID NO. 5或6的至少约100个氨基酸。 最优选的是包含SEQ ID N0. 5的氨基酸残基23-156或SEQ ID N0. 6的氨基酸残基1-134 的氨基酸序列。
[0107] 优选的TpN17抗原是SEQ ID N0. 7至11的多肽，其中已将TpN17与多种分子伴侣 肽序列融合。为了便于纯化后的重折叠过程，并抑制二硫键加合物形成，可以用其他氨基酸 残基（如丙氨酸或丝氨酸）取代所设想的所有TpN17抗体中的半胱氨酸残基。这些残基取 代半胱氨酸侧链的对氧化敏感的巯基部分，但大小与半胱氨酸残基几乎相同。因此，它们通 常适于嵌入整体三维蛋白质结构而不严重损害无半胱氨酸的蛋白质变体的折叠和稳定性。
[0108] 根据本发明的方法，用霍乱弧菌脂蛋白15(VcLpl5)的肽序列或其部分序列作为 用于减少干扰，即用于最少化假阳性结果的试剂。优选地，该VcLpl5的部分序列包含SEQ ID NO. 1或2的氨基酸残基26-163。包含SEQ ID NO. 1的残基1-25的N端信号序列可有 可无。在本发明的另一模式中，SEQ ID NO. 1或2的氨基酸残基26-163的该VcLpl5部分 序列可以在其N端或C端或两端截短1至5个氨基酸。在另一实施方案中，可以以这样的 方式修饰SEQ ID NO. 1或2的氨基酸残基26-163的该VcLpl5部分序列，使得可以引入保 守氨基酸取代，如，例如用丝氨酸残基或半胱氨酸取代丙氨酸残基。可以用另外两种氨基酸 取代这三种氨基酸中的任一种。本领域技术人员已知的保守氨基酸取代的其他实例是丝氨 酸/半胱氨酸/丙氨酸、异亮氨酸/缬氨酸或苯丙氨酸/酪氨酸。对于这些修饰中的任一 种，保持霍乱弧菌脂蛋白15(VcLpl5)的三维结构不变很重要。
[0109] 优选地，将用于上述方法中的VcLpl5肽序列或其部分序列与分子伴侣融合来提 供高表达产率和便于纯化后的重折叠过程。
[0110] 本发明的另一方面是包含SEQ ID NO. 1或2的VcLp 15肽序列或SEQ ID NO. 1或 2的部分序列和分子伴侣的融合多肽。
[0111] 通过将分子伴侣与难溶的靶抗原序列融合来使其增溶并变得更为良性的多肽融 合蛋白质的用途为本领域公知，并在之前详细描述于如国际专利申请W0 2003/000878中。 有用的融合分子伴侣的已知和充分记载的实例是SlyD、FkpA、Skp和SlpA，还见欧洲专利申 请EP2127678A1。
[0112] 因此，本发明的另一方面是包含VcLpl5肽序列和分子伴侣的融合多肽。在优选实 施方案中，该分子伴侣选自SlyD、SlpA、FkpA和Skp。这些分子伴侣可以源自多种生物，优 选衍生自大肠杆菌的分子伴侣序列。
[0113] 在本发明的另一实施方案中，该包含VcLpl5肽序列的融合多肽含有SEQ ID NO. 3(EcSlyD-VcLpl5) 〇
[0114] 包含VcLpl5肽序列和分子伴侣的融合多肽作为免疫测定中的添加剂在减少干扰 和最少化假阳性结果中的用途也是本发明的一个方面。
[0115] 本发明的另一方面是用于通过免疫测定来检测分离的样品中抗苍白密螺旋体抗 原的抗体的试剂盒，其包含TpN17抗原及上文进一步详述的含有VcLpl5肽序列和分子伴侣 的融合多肽。
[0116] 此外，本发明涵盖用于检测分离的样品中抗苍白密螺旋体的TpN17抗原的抗体的 方法，该方法包括步骤：
[0117] a)通过将体液样品与存在于该样品中的该抗体可以特异性结合的特异性结合配 偶体混合来形成免疫反应混合物；
[0118] b)在向该样品加入该特异性结合配偶体之前、同时或之后向该免疫反应混合物加 入上文定义的包含VcLp 15肽序列的融合多肽；
[0119] c)维持该免疫反应混合物足以使存在于该体液样品中的抗体与该特异性结合配 偶体免疫反应，以形成免疫反应产物的时期；和
[0120] d)检测该免疫反应产物中的任一种的存在和/或浓度。
[0121] 可以在向该样品加入该特异性结合配偶体之前、同时或之后向该免疫测定混合物 (包含样品和特异性结合该样品中的分析物抗体的结合配偶体）加入本发明的融合多肽。 优选地，在使包含分析物抗体的体液样品与该特异性结合配偶体接触之前向该测试试剂加 入该融合多肽。
[0122] 在本发明的一个实施方案中，按照所谓的双抗原夹心概念（DAGS)进行用于检测 分离的样品中的抗密螺旋体抗体的免疫测定。此测定概念有时也称为双抗原桥概念，因为 两种抗原通过抗体分析物桥接。在这种测定中，需要和使用抗体用它的两个（IgG、IgE)、四 个（IgA)或十/十二个（IgM)抗体配位结合给定抗原的至少两个不同分子的能力。
[0123] 更具体而言，通过将包含抗密螺旋体抗体的样品与两种不同的TpN17抗原（即第 一（"固相"）TpN17抗原和第二（"检测"）TpN17抗原）孵育来进行按照双抗原桥形式测 定抗密螺旋体抗体的免疫测定，其中该抗原中的每一种特异性结合该抗密螺旋体抗体。该 第一抗原与固相直接或间接结合或可以直接或间接结合，且通常携带效应基团，该效应基 团是如生物素/抗生物素蛋白的生物亲和性（bioaffine)结合对。例如，如果该第一抗原缀 合至生物素，则用抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白包被固相。该第二抗原携带可检测标 记。然后形成包含第一抗原、样品抗体和第二抗原的免疫反应混合物。然后在向该抗原加 入样品之前或在形成免疫反应混合物之后加入该第一抗原可以与之结合的固相。维持此免 疫反应混合物足以使体液样品中抗该TpN17抗原的抗密螺旋体抗体与该TpN17抗原免疫反 应形成免疫反应产物的时期。下一步是分离步骤，其中将液相从固相分离。最后，在固相或 液相或二者中检测该免疫反应产物中的任一种的存在。
[0124] 在该DAGS免疫测定中，"固相抗原"和"检测抗原"的基本结构相同。还可能使用 相似但不同的TpN17抗原，该抗原在双抗原桥测定中在免疫学上交叉反应。进行这类测定 的基本要求是两种抗原上存在一个或多个相关表位。根据本发明，希望将不同的融合部分 用于各TpN17抗原（例如，EcFkpA与固相一侧的TpN17融合，EcSkp与检测一侧的TpN17融 合），因为这类区别打破了 DAGS形式的对称性，从而减少了抗体介导的融合分子伴侣桥接 的问题，该问题可以导致免疫测定的假阳性结果。简言之，在DAGS形式的两侧使用结构上 差距大的融合配偶体减少了不想要的免疫学交叉反应，从而改善特异性。
[0125] 因此，本发明涉及用于检测分离的样品中抗苍白密螺旋体的TpN17抗原的抗体的 方法，其中用VcLpl5的肽序列作为用于减少干扰和用于最少化假阳性结果的试剂。该方 法进一步表征为以双抗原夹心形式（DAGS)进行该测定。此外，该测定使用两种TpN17抗原 融合多肽（第一和第二TpN17抗原），其中两种TpN17抗原相同、或至少在免疫学上与同一 抗体交叉反应，使得可能通过存在于样品中的抗体来在两种抗原之间桥接。此外，如前一段 落中所述，该第一和第二抗原与不同分子伴侣融合。
[0126] 此外，如Skp和FkpA的特异性分子伴侣融合配偶体的使用可以便于显著改善的 IgM识别和检测。由于其结合的亲合力模式，IgM分子仅可以与具有中至高表位密度的聚合 抗原反应。Skp和FkpA都是在革兰氏阴性菌的周质（periplasm)中作为助折叠物发挥作 用的寡聚分子伴侣。令我们惊奇地，我们发现，在将大的靶分子与分子伴侣的C端融合时， 保持了 Skp和FkpA的四级结构。因此，FkpA-TpN17和Skp-TpN17融合蛋白质可再现地形 成具有足以检测IgM分子的确定的表位密度的天然寡聚物。灵敏和特异的IgM检测是保 证早期和原发性梅毒感染的可靠检测的非常重要的特征。由于我们旨在发展用于全免疫 球蛋白检测（即检测IgG和IgM二者）的免疫测定，可以将寡聚抗原组件FkpA-TpN17和 Skp-TpN17有利地用作DAGS形式两侧的指定成分（specifier)(例如FkpA-TpN17-生物素和 Skp-TpN17-钌）。由于FkpA和Skp就结构而言彼此非常不同，不想要的免疫学交叉反应和 通过融合配偶体桥接的风险非常低。通过向该测定加入化学聚合的FkpA和Skp抗干扰添 加剂来进一步降低该风险。
[0127] 用于检测分析物的多种其他形式和原理的免疫测定及不同的检测模式已被广泛 描述，且为本领域技术人员所熟知。
[0128] 根据本发明，可以使用可能检测到其中的密螺旋体抗体的任意分离的生物样品。 具体而言，人血液、血清、血浆或唾液适合作为样品材料。
[0129] 在实施例部分中进一步说明本发明。
[0130] 实施例1
[0131] TpN17和VcLpl5分子伴侣融合多肽的克隆和纯化
[0132] 表达盒的克隆
[0133] 以Novagen (Madison, WI,美国）的pET24a表达质粒为基础，基本上按Scholz, C. 等，J. Mol. Biol. (2005) 345, 1229-1241 所述获得 了编码 TpN17 和 VcLpl5 融合蛋白的 表达盒。TpN17和VcLpl5抗原的序列检索自SwissProt数据库（分别为SwissProt ID P29722和Q9KQN6)。编码具有符合读框地与N端融合的富含甘氨酸的接头区域 的成熟TpN17 aa23-156(省去了跨越氨基酸残基1-22的信号肽）的合成基因购自 Medigenomix(Martinsried,德国）。将TpN17的25、29、42和58位的半胱氨酸残基变为丙 氨酸残基，以防止不想要的副作用，如氧化或分子间二硫键桥接。BamHI和Xhol限制位点分 别位于TpN17编码区的5'和3'端。另一编码通过富含甘氨酸的接头区连接的两个EcSlyD 单位（SEQ ID NO. 1的残基1-165, SwissProt检索号P0A9K9)且在C端包含另一接头区部 分的合成基因同样购自Medigenomix。Ndel和BamHI限制位点分别位于此表达盒的5'和 3'端。设计基因和限制位点来使得能够通过简单的连接来符合读框地融合分子伴侣部分 EcSlyD-EcSlyD和TpN17抗原部分。为了避免无意的重组过程和提高表达盒在大肠杆菌宿 主中的遗传稳定性，简并化编码EcSlyD单位的核苷酸序列，同样对编码延长的接头区的核 苷酸序列进行简并，即用不同的密码子组合来编码相同的氨基酸序列。
[0134] 用Ndel和Xhol消化pET24a载体，并插入包含与密螺旋体TpN1723_156符合读框 地融合的串联SlyD的表达盒。相应地构建包含多杀性巴氏杆菌SlyD (1-156, SwissProt ID Q9CKP2)或大肠杆菌 Skp (21-161，SwissProt ID P0AEU7)或 FkpA (26-270, SwissProt ID P45523)的表达盒，以及包含不同于TpN17的靶多肽，尤其是霍乱弧菌脂蛋白Lpl5 (26-163， SwissProt ID Q9KQN6)的表达盒。与 TpN17-样，将 VcLpl5 的 74 和 77 位（前体 Lpl5 编 号）的真实的半胱氨酸残基变为丙氨酸残基，以防止不想要的副作用，如氧化或分子间二 硫键桥接。所有重组融合多肽变体都包含C端六组氨酸标记，以便于Ni-NTA辅助的纯化和 重折叠。用QuikChange(Stratagene，La ]〇1]^，04，1134)和标准？0?技术来在各表达盒中 产生点突变、缺失、插入和延长变体或限制位点。
[0135] 图3显示具有与它的N端符合读框地融合的两个SlyD分子伴侣单位的密螺旋体 TpN17全长抗原23-156的示意图。为了表示该SlyD融合配偶体的大肠杆菌来源，将所示融 合多肽命名为 EcSlyD-EcSlyD-TpN17(23-156);还见 SEQ ID N0.8。
[0136]
[0137] 对所得到的质粒的插入片段进行测序，发现它编码希望的融合蛋白质。SEQ ID NO. 2至4(VcLpl5)和7至11(ΤρΝ17)中显示TpN17和VcLpl5融合多肽的完整氨基酸序列。 SEQ ID N0. 12中显示接头L的氨基酸序列。
[0138] 包含TpN17或VcLpl5的融合蛋白的纯化
[0139] 通过使用基本相同的流程来纯化所有TpN17和VcLpl5融合蛋白变体。在加入了 卡那霉素（30μ g/ml)的LB培养基中37°C培养包含具体的pET24a表达质粒的大肠杆菌 BL21 (DE3)细胞至0D6(?为1. 5,通过加入ImM异丙基-β -D-硫代半乳糖苷来诱导胞质过表 达。诱导3小时后，通过离心（5000g20分钟）收集细胞，冷冻，并保存在-20°C。对于细胞 裂解，将冷冻的沉淀重悬在预冷的50mM磷酸钠 pH8. 0、7. 0M GdmCl、5mM咪唑中，冰上搅拌 悬液2小时至细胞完全裂解。离心和过滤（0. 45 μ m/0. 2 μ m)后，将粗裂解物上样至用含 5. OmM TCEP的裂解缓冲液平衡的Ni-NTA柱上。随后的洗涤步骤调整适应于各靶蛋白，且在 5至15mM咪唑（在50mM磷酸钠 ρΗ8· 0、7· 0M GdmCl、5. OmM TCEP中）的范围内。应用至少 10-15体积的洗涤缓冲液。然后，用50mM磷酸钾pH8. 0、100mM KCl、10mM咪唑、5. OmM TCEP 替换GdmCl溶液来诱导基质结合的蛋白质的构象重折叠。为了避免共纯化的蛋白酶的再激 活，在重折叠缓冲液中包含蛋白酶抑制剂混合物（Complete#无 EDTA，Roche)。在过夜反 应中应用了总计15-20柱体积的重折叠缓冲液。然后，通过用3-5个柱体积的50mM磷酸钾 pH8·0、100mMKCl、10mM咪唑洗涤来去除TCEP和Comp丨ete?.无 EDTA抑制剂混合物二者。 随后，将咪唑浓度（仍然在50mM磷酸钾pH8. 0、100mM KC1中）升高至25-50mM(取决于各靶 蛋白），以去除非特异性结合的蛋白质污染物。然后通过含500mM咪唑的相同缓冲液来洗脱 天然蛋白质。通过N-[三（羟甲基）甲基]甘氨酸-SDS-PAGE来评估含蛋白质的级分的纯 度，并混合。最后，对蛋白质进行大小排阻层析（Superdex HiLoad，Amersham Pharmacia), 混合含蛋白质的级分，并在Amicon池（YM10)中浓缩至10-20mg/ml。
[0140] 经过偶联的纯化和重折叠流程之后，取决于各靶蛋白，可以从lg大肠杆菌湿细胞 获得大约10_30mg的蛋白质产率。
[0141] 实施例2
[0142] 光谱测量
[0143] 用Uvikon XL双光束分光光度计进行蛋白质浓度测量。通过使用 Pace(1995)，Protein Sci. 4, 2411-2423所述的方法来测定摩尔消光系数（ε28。）。用于不 同融合多肽的摩尔消光系数（ε 28(|)在表1中指出。
[0144] 表1 :用于本研究的融合多肽变体的蛋白质参数。所有参数都指各蛋白质单体。
[0145]

【权利要求】
1. 用于检测分离的样品中抗苍白密螺旋体的TpN17抗原的抗体的方法，其中用霍乱弧 菌脂蛋白15 (VcLpl5)的肽序列作为用于减少干扰和用于最少化假阳性结果的试剂。
2. 权利要求 1 的方法，其中使用 UniProt ID Q9KQN6(SEQ ID NO. 1)或 SEQ ID NO. 2、 或SEQ ID NO. 1或2的部分序列的肽序列。
3. 权利要求2的方法，其中VcLpl5的部分序列包含SEQ ID NO. 1或2的氨基酸26-163。
4. 权利要求1至3中任一项的方法，其中VcLpl5肽序列或其部分序列与分子伴侣融 合。
5. 融合多肽，其包含SEQ ID NO. 1或2的VcLpl5肽序列或SEQ ID NO. 1或2的部分序 列和分子伴侣。
6. 权利要求5的融合多肽，其中分子伴侣选自SlyD、SlpA、FkpA和Skp。
7. 权利要求5或6的融合多肽，其包含SEQ ID NO. 3。
8. 权利要求5至7的融合多肽作为免疫测定中的添加剂的用途，用于减少干扰和用于 最少化假阳性结果。
9. 用于通过免疫测定检测分离的样品中抗苍白密螺旋体抗原的抗体的试剂盒，其包含 TpN17抗原和权利要求5至7的融合多肽。
10. 用于检测分离的样品中抗苍白密螺旋体的TpN17抗原的抗体的方法，所述方法包 括： a) 通过将体液样品与存在于所述样品中的所述抗体可以特异性结合的特异性结合配 偶体混合来形成免疫反应混合物； b) 在向所述样品加入所述特异性结合配偶体之前、同时或之后向所述免疫反应混合物 加入权利要求5至7中任一项的融合多肽； c) 维持所述免疫反应混合物足以使存在于所述体液样品中的抗体与所述特异性结合 配偶体免疫反应形成免疫反应产物的时期；和 d) 检测所述免疫反应产物中的任一种的存在和/或浓度。
11. 权利要求10的方法，其中用两种TpN17抗原作为将要在所述分离的样品中检测的 抗体的特异性结合配偶体： 包含TpN17序列和第一分子伴侣的第一 TpN17抗原，其中第一 TpN17抗原可以与固相 结合； 包含TpN17序列和第二分子伴侣的第二TpN17抗原，其中第二TpN17抗原携带可检测 标记； 其中两种TpN17抗原相同或在免疫学上交叉反应，使得存在于所述样品中的抗体可以 特异性结合它们；且 其中第一和第二分子伴侣不同。
12. 权利要求11的方法，其中第一 TpN17抗原包含大肠杆菌FkpA作为分子伴侣，第二 TpN17抗原包含大肠杆菌Skp作为分子伴侣。
【文档编号】G01N33/536GK104297477SQ201410344742
【公开日】2015年1月21日 申请日期:2014年7月18日 优先权日:2013年7月18日
【发明者】E·法特兹, P·沙尔施密特, U·施密特, C·舒尔茨 申请人:弗·哈夫曼-拉罗切有限公司