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一种用于atp检测的方法及其配套的光学适配子传感器的制造方法
【专利摘要】本发明公开了一种用于ATP检测的方法及其配套的光学适配子传感器。将完整的ATP适配子被分成单链DNA，即S1和S2。S1被固定在带孔DNA结合板表面；S2和用于产生信号的核酸链S3被固定在以PNS/AuNPs纳米复合物为信号放大载体的表面，在被检测物ATP存在时，S1和S2通过ATP分子而连接，从而将信号放大载体固定在带孔DNA结合板表面，然后负载在PNS/AuNPs纳米复合物表面的S3与加入的钾离子和血红素形成四链体结构DNA酶，催化底物，得到可用于检测的光学信号。本发明具有很高的灵敏度和特异性，对ATP的响应范围为0.01–1nmol·L-1，检测限为1.35pmol·L-1。
【专利说明】—种用于ATP检测的方法及其配套的光学适配子传感器
【技术领域】
[0001]本发明属于生物分析检测【技术领域】，具体涉及一种用于ATP检测的方法及其配套的光学适配子传感器。
【背景技术】
[0002]三磷酸腺苷(ATP)是体内组织细胞所需能量的主要来源，在细胞的多种代谢过程中扮演者重要的角色，是维持生物体正常机能无可替代的物质，并且细胞中ATP的含量还和许多疾病如贫血、低血糖、心血管疾病以及癌症等有着密切的关系，因此发展一种闻效灵敏的方法去检测ATP分子有着非常重要的意义。
[0003]传统上，有大量的方法可以检测ATP分子，如色谱法(J.Chromatogr.，Biomed.Appl.，1994，662，15 - 20)、生物发光法(Cancer, 1993，71，1613 - 1620)、电化学方法(Talanta, 2009，78，954 - 958)以及荧光法(Chem.Commun.，2011，47, 6066 - 6068)等。但是这些方法或多或少存在有操作麻烦、检测时间长、性能不稳定以及灵敏度较低等问题。
[0004]近年来，适配子传感器因其对目标分子的高亲合力以及良好的特异性而受到科研工作者的广泛研究，而基于光学方法发展的超灵敏适配子传感器更是因为低成本以及高灵敏度而备受青睐。自组装寡肽纳米球因其良好的生物相容性、高的均相度以及表面易于修饰等优点而引起人们的关注，但是将自组装寡肽纳米球作为信号放大载体用于构建超灵敏光学适配子传感器还未见报道。

【发明内容】

[0005]本发明的目的就是基于上述不足，提供一种基于自组装寡肽纳米球构建的光学适配子传感器及其用于ATP检测的方法，该光学适配子传感器设计简单、成本低廉且稳定性好，更重要的是具有高的灵敏度。本发明的目的是通过以下方式实现的:
[0006]一种用于ATP检测的方法，包括以下步骤:
[0007](I)将设计合成的含巯基的寡肽自组装成寡肽纳米球；
[0008](2)将制备的金纳米粒子通过Au - S键固定到寡肽纳米球的表面，得到用于信号放大的PNS/AuNPs纳米复合物载体；
[0009](3)将用于产生信号的核酸链S3和ATP单链适配体S2固定到PNS/AuNPs纳米复合物上，ATP单链适配体SI固定在带孔DNA结合板上，板表面空隙位置用牛血清蛋白封闭；
[0010](4)通过加入不同浓度的ATP分子将负载有S3和S2的PNS/AuNPs纳米复合物连接到带孔DNA结合板上；
[0011](5)往上述带孔DNA结合板中加入钾离子和血红素后，PNS/AuNPs纳米复合物表面的S3与钾离子和血红素形成四链体结构的DNA酶，从而可催化底物反应得到具有光学信号产物。
[0012](6)制作标准曲线后，用于检测ATP样品。
[0013]所用寡肽序列为含有半胱氨酸或蛋氨酸，和苯丙氨酸的短肽单元，序列通式为:Cys-Phe-AniBn,或者 Met-Phe-AniBn, A 为 Phe, Trp 及 His 中的任何一种，其中 m=l 或 2 ;B 为Gly、Leu、Val、Ala及Met中的任何一种，其中n=0,1或2。
[0014]所述寡肽纳米球是将0.5?10mg/mL的寡肽溶液放置在室温条件下，反应12?48h。
[0015]所述金纳米粒子的粒径范围为2.5_15nm，金纳米粒子溶液的浓度范围为0.01?lg/L。
[0016]所述PNS/AuNPs纳米复合物是将0.1?IOmL制备的0.01?lg/L金纳米粒子溶液加入到I?20mL制备的0.5?10mg/mL的寡肽纳米球溶液中，震荡条件下反应I?6h。
[0017]所述S2和S3的浓度分别为0.5?5μ M和2?ΙΟμΜ，往制备的PNS/AuNPs纳米复合物表面固定时，所加入的S2和S3溶液体积比为1:1?1:10，所用S2和S3溶液，与PNS/AuNPs纳米复合物溶液体积比例为1:0.5?1:5。
[0018]S2和S3固定在PNS/AuNPs纳米复合物的表面，结合时间为6?24h，离心将未反应的S2和S3移除。
[0019]步骤(4)中向各孔中加入10-30 μ L的待检测的ATP和80-120 μ L修饰有S2和S3的PNS/AuNPs纳米复合物溶液。
[0020]完整的ATP适配子被分成两段单链DNA，其序列分别为:S1:5' -NH2-TTT TTT ACCTGG GGG AGTAT-3'和S2:5/ -HS-TTT TTT TGC GGA GGA AGG T-3/，用于产生信号的核酸链为 S3:5' -HS-TTT TTT GGTTGG TGT GGT TGG-3'。
[0021]所述的用于ATP检测的方法及其配套的光学适配子传感器，包括:含巯基的寡肽自组装成的寡肽纳米球、金纳米粒子、用于产生信号的核酸链S3、ATP单链适配体S2、ATP单链适配体S1、带孔DNA结合板、钾离子、血红素、底物、牛血清蛋白。
[0022]本发明是将完整的ATP适配子分成两段单链DNA，即SI和S2。SI被固定在带孔DNA结合板表面，板表面空隙位置用牛血清蛋白(BSA)封闭；S2和S3被固定在以PNS/AuNPs纳米复合物为信号放大载体的表面，在被检测物ATP存在时，SI和S2可以通过ATP分子而连接起来，从而将信号放大载体固定在带孔DNA结合板表面，然后负载在PNS/AuNPs纳米复合物表面用于产生信号的核酸链S3与加入的钾离子和血红素形成具有过氧化氢酶的功能的四链体结构DNA酶。该DNA酶可以催化过氧化氢去氧化底物3，3'，5，5'-四甲基联苯胺(TMB)，从而得到可用于检测的光学信号。
[0023]本发明所述寡肽纳米球(PNS)是将0.5?10mg/mL冻干的Cys-Phe-AmBn,或者Met-Phe-AmBn, (A 为 Phe> Trp 及 His 中的任何一种，其中 m=l 或 2 ;B 为 Gly、Leu、Val、Ala及Met中的任何一种，其中n=0，I或2)寡肽溶液放置在室温条件下，反应12?48h。优选的寡肽浓度为2mg/mL。优选的反应时间为24h。
[0024]本发明所述金纳米粒子(AuNPs)粒径范围为2.5_15nm，金纳米粒子溶液的浓度范围为0.01?lg/L。具体配制可以是将0.1?5mLl%的氯金酸溶液加入到50mL双蒸水中，剧烈搅拌5?lOmin，再加入0.5mLl%的柠檬酸钠溶液，混匀后，加入0.5mL0.05?0.15%的硼氢化钠溶液，剧烈搅拌5?lOmin，后放于4°C下保存备用。优选的加入1%的氯金酸溶液的量为0.5mL，优选的硼氢化钠溶液浓度为0.075%。
[0025]本发明所述PNS/AuNPs纳米复合物是将0.1?IOmL制备的0.01?lg/L金纳米粒子溶液加入到I?20mL制备的0.5?10mg/mL的寡肽纳米球溶液中，震荡条件下反应I?6h。优选的加入AuNPs溶液的量为0.5?2mL。优选的PNS溶液体积为I?5mL。优选的反应时间为2?4h。
[0026]本发明所述S2和S3的浓度分别为0.5?5 μ M和2?10 μ M，往上述制备的PNS/AuNPs纳米复合物表面固定时，所加入的两者体积比为1:1?1:10，所用S2和S3溶液，与PNS/AuNPs纳米复合物溶液体积比例为1:0.5?1:5。优选的S2和S3的浓度分别为I μ M和5 μ Μ。优选的加入的S2和S3体积比为1:4?1:6。优选的S2和S3溶液，与PNS/AuNPs纳米复合物溶液体积比例为1:1?1:3。
[0027]本发明所述SI的浓度为0.1?5 μ M。封闭用的BSA浓度为0.5%?10%。优选的SI的浓度为0.5 μ Μ。优选的BSA浓度为2%。
[0028]本发明SI的固定过程可以是:在96孔DNA结合板的各孔中加入100 μ LSI (0.5 μ Μ), 37°C下放置lh，将溶液移除后用PBS清洗两次；再加入300 μ Ll%的BSA，37 °C下放置Ih,将溶液移除后用PBS清洗三次。
[0029]本发明制作标准曲线的过程可以是:向各孔中加入10-30 μ L的不同浓度的ATP和80-120 μ L修饰有S2和S3的PNS/AuNPs纳米复合物溶液，室温下放置lh，将溶液移除后用PBS清洗三次。加入50 μ L0.1%的KCl溶液和50 μ LI μ M的血红素，室温下放置Ih后加入100 μ L800 μ M 的 TMB 和 10 μ Ll% 的 H2O2,反应约 15min 后加入 10 μ L 的 HCl (200 μ Μ)，然后在450nm下测定紫外吸光度。以450nm处吸光度值对ATP浓度的自然对数作图。ATP浓度在0.01 -1nM范围内时，两者之间呈现良好的线性关系，可实现该浓度范围内ATP分子的定量检测。
[0030]本发明的优点在于:
[0031]I)本发明检测ATP分子时具有高的灵敏度和优异的选择性，对ATP的检测浓度范围为0.01 -1nM，检测限为1.35pM ；
[0032]2)本发明的制作工艺简单、成本低且性能稳定；
[0033]3)本发明基于PNS/AuNPs纳米复合物构建的适配子传感器有望成为一种通用的构建适配子传感器的方法。
【专利附图】

【附图说明】
[0034]图1为本发明的ATP检测方法原理示意图；
[0035]图2㈧为实施例1中寡肽自组装得到的PNS原子力显微镜图，图2 (B)为实施例1中AuNPs负载到PNS表面后Au的XPS图谱；
[0036]图3为实施例2中构建的光学适配子传感器对ATP检测的标准曲线图，从左到右，ATP浓度分别为0.01,0.025、0.05,0.1,0.5、Inmol.L—1，横坐标为ATP浓度取自然对数，纵坐标为吸光度；
[0037]图4为实施例2中构建的光学适配子传感器对ATP的选择性。
【具体实施方式】:
[0038]以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
[0039]实施例1:PNS/AuNPs纳米复合物的制备
[0040]2mg/mL的Cys-Phe-Phe寡肽溶液放置于室温下，反应24h,得到PNS。[0041]将0.5mLl%的氯金酸溶液加入到50mL双蒸水中，剧烈搅拌5min，再加入0.5mLl%的柠檬酸钠溶液，混匀后，加入0.5mL0.075%的硼氢化钠溶液，剧烈搅拌5min，得到AuNPs。
[0042]将ImL制备的AuNPs溶液加入到2mL制备的PNS溶液中，震荡条件下反应4h后，离心将未反应的AuNPs移除，得到PNS/AuNPs纳米复合物。
[0043]实施例2:光学适配子传感器构建及用于检测ATP分子
[0044]50 μ L S2 (I μ Μ)和 200 μ L S3 (5 μ Μ)同时加入到 400 μ L 上述制得的 PNS/AuNPs纳米复合物溶液中，反应12h后，在8000rpm的条件下离心lOmin，移除未反应的S2和S3，重复三次，得到修饰有S2和S3的PNS/AuNPs纳米复合物。
[0045]在96孔DNA结合板的各孔中加入IOOyL SI (0.5 μ M)，37°C下放置lh，将溶液移除后用PBS清洗两次；再加入300 μ Ll%的BSA，37°C下放置lh，将溶液移除后用PBS清洗三次。然后向各孔中加入20 μ L的不同浓度的ATP和100 μ L修饰有S2和S3的PNS/AuNPs纳米复合物溶液，室温下放置lh，将溶液移除后用PBS清洗三次。加入50 μ L0.1%的KCl溶液和50 μ LI μ M的血红素，室温下放置Ih后加入100 μ L800 μ M的TMB和10 μ Ll%的H2O2,反应约15min后加入IOyL的Ηα(200μΜ)，然后在450nm下测定紫外吸光度。以450nm处吸光度值对ATP浓度的自然对数作图，ATP浓度在0.01 -1nM范围内时，两者之间呈现良好的线性关系，可实现该浓度范围内ATP分子的定量检测。并且在检测ATP分子时不受其他一些ATP类似物的干扰，如:GTP、CTP及UTP等。在上述ATP类似物存在的条件下，该光学适配子传感器对ATP分子仍具有良好的选择性和灵敏度(图4)。
【权利要求】
1.一种用于ATP检测的方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)将设计合成的含巯基的寡肽自组装成寡肽纳米球； (2)将制备的金纳米粒子通过Au- S键固定到寡肽纳米球的表面，得到用于信号放大的PNS/AuNPs纳米复合物载体； (3)将用于产生信号的核酸链S3和ATP单链适配体S2固定到PNS/AuNPs纳米复合物上，ATP单链适配体SI固定在带孔DNA结合板上，板表面空隙位置用牛血清蛋白封闭； (4)通过加入不同浓度的ATP分子将负载有S3和S2的PNS/AuNPs纳米复合物连接到带孔DNA结合板上； (5)往上述带孔DNA结合板中加入钾离子和血红素后，PNS/AuNPs纳米复合物表面的S3与钾离子和血红素形成四链体结构的DNA酶，从而可催化底物反应得到具有光学信号产物； (6)制作标准曲线后，用于检测ATP样品。
2.如权利要求1所述的用于ATP检测的方法，其特征在于，所用寡肽序列为含有半胱氨酸或蛋氨酸，和苯丙氨酸的短肽单元，序列通式为=Cys-Phe-AniBn，或者Met-Phe-AniBn, A为Phe、Trp及His中的任何一种，其中m=l或2 ;B为Gly、Leu、Val、Ala及Met中的任何一种，其中η=0，1或2。
3.如权利要求2所述的用于ATP检测的方法，其特征在于，所述寡肽纳米球是将0.5?10mg/mL的寡肽溶液放置在室温条件下,反应12?48h。
4.如权利要求1所述的用于ATP检测的方法，其特征在于， 所述金纳米粒子的粒径范围为2.5-15nm，金纳米粒子溶液的浓度范围为0.01?lg/L。
5.如权利要求1所述的用于ATP检测的方法，其特征在于， 所述PNS/AuNPs纳米复合物是将0.1?IOmL制备的0.01?lg/L金纳米粒子溶液加入到I?20mL制备的0.5?10mg/mL的寡肽纳米球溶液中，震荡条件下反应I?6h。
6.如权利要求5所述的用于ATP检测的方法，其特征在于， 所述S2和S3的浓度分别为0.5?5 μ M和2?10 μ M，往制备的PNS/AuNPs纳米复合物表面固定时，所加入的S2和S3溶液体积比为1:1?1:10，所用S2和S3溶液，与PNS/AuNPs纳米复合物溶液体积比例为1:0.5?1:5。
7.如权利要求1所述的用于ATP检测的方法，其特征在于，S2和S3固定在PNS/AuNPs纳米复合物的表面，结合时间为6?24h，离心将未反应的S2和S3移除。
8.如权利要求6所述的用于ATP检测的方法，其特征在于，步骤(4)中向各孔中加入10-30 μ L的待检测的ATP和80-120 μ L修饰有S2和S3的PNS/AuNPs纳米复合物溶液。
9.如权利要求1所述的用于ATP检测的方法，其特征在于，完整的ATP适配子被分成两段单链 DNA，其序列分别为:S1:5' -NH2-TTT TTT ACC TGG GGG AGT AT-3'和 S2:5' -HS-TTT TTT TGC GGA GGA AGGT-3'，用于产生信号的核酸链为 S3:5' -HS-TTT TTTGGT TGG TGT GGT TGG-3'。
10.权利要求1-9任一项所述的用于ATP检测的方法及其配套的光学适配子传感器，其特征在于，包括:含巯基的寡肽自组装成的寡肽纳米球、金纳米粒子、用于产生信号的核酸链S3、ATP单链适配体S2、ATP单链适配体S1、带孔DNA结合板、钾离子、血红素、底物、牛血清蛋白。
【文档编号】G01N21/33GK103822890SQ201410068710
【公开日】2014年5月28日 申请日期:2014年2月27日 优先权日:2014年2月27日
【发明者】刘又年, 邓留, 黎世鹏, 郝远强, 李娟
申请人:中南大学