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专利名称：一种组织样品高分辨率断层光学显微成像装置的制作方法
技术领域：
本发明为一种基于机械切削实现组织样品断层显微成像的装置。
背景技术：
对组织样品进行高分辨率断层光学显微成像，再进行三维重建，可以获得亚细胞结构的三维空间分布，对于神经组织，则可以实现特定神经元树突和轴突的三维空间分布的追踪，从而了解神经元之间的相互连接关系。为了实现组织样品的断层光学显微成像，可以采用光学层析成像技术:共聚焦成像技术，通过使用共焦小孔阻挡聚焦面以外的信号，实现层析；双光子显微成像技术，利用非线性效应，有效的光学信号只来源于焦点位置，实现层析；另外，也有近年来受到较多关注的光片照明层析技术，将激发光整形为微米厚度的薄层光片，照明样品中垂直于探测光轴的一个面，实现层析。这些光学层析成像方法，首先于组织样品对光的散射和吸收，所能达到的成像深度限制在Imm以内，如果需要对更大的组织样品进行成像，则需要结合组织样品的光透明处理以及机械切片过程。机械切片结合光学显微成像方法理论上不会受制于组织样品的尺寸和光学特性。结合机械切片与光学显微成像有多种方式。最为传统和直接的方式是先对组织样品进行切片，再将切片转移到载玻片上进行光学成像。切片和切片的制备过程费时，并且因为很难保证不同切片固定和成像位置的一致性，需要对不同切片的图像进行空间位置的配准才能进行后续的三维图像重建。另一种方式是对组织样品的表面进行显微光学成像或者对组织样品的浅表的几百微米厚度进行光学成像，再去除(机械切削或激光消融)组织样品浅表已成像的部分。因为来自表面以下组织样品信号的干扰，需要借助光学层析成像技术。第三种方式是对组织样品进行塑性包埋，进行微米厚度的薄切片，同时在切片过程的同时，对切下并贴覆在切削刀具背面的组织样品切削条进行同步的成像。这种方式切下的组织样品薄切片与剩余的组织样品在空间上有一定的分离(取决于刀具的厚度)，但因为对塑性包埋的组织样品进行薄切片一般使用透明的金刚石刀，使得金刚石刀下方剩余的样品仍会透过金刚石刀而对光学成像结果造成影响，在图像中叠加上干扰背景。

发明内容
本发明所要解决的技术问题是提出一种通过机械切削方式和显微光学成像实现组织样品断层成像装置。为解决上述技术问题，本发明首先提出了一种组织样品高分辨率断层显微成像装置，包括组织样品切片模块和光学显微成像系统；所述组织样品切片模块包括三维电控移动平台，样品槽和切削刀具，所述样品槽安装在所述三维电控移动平台上，包埋的组织样品固定于所述样品槽中，所述切削刀具固定安装在所述样品槽上方，所述切削刀具的切削面与所述组织样品上表面成钝角相交，所述光学显微成像系统与所述切削刀具相对位置固定，且聚焦于所述切削刀具头；所述切削刀具进行不透明处理。
优选的，所述切削刀具的不透明处理包括，采用在激发或照明光波长范围内不透明的材质制作刀具，或者，对刀具表面进行硬质光学镀膜处理，通过镀膜实现激发或照明光波长范围内的低透过率或高反射率。所述刀具可以是可见光波段透明的硬质刀具，但对其进行光学镀膜处理，使其在照明或激发光波段呈现低透过率。为了得到微米厚度的薄组织切片，使用硬质刀具，如金刚石刀具。由于金刚石的透明特性，可以在刀具表面镀反射膜，使金刚石刀在成像系统所使用的照明光或激发光波长范围内呈现很低的透过率，从而阻挡切削过程中，对刀具下方组织样品的照明或激发，从而抑制下方组织样品对刀面上方组织切片的干扰。所述刀具也可使用其他非透明材质的刀具，从而无需镀膜处理。所述显微光学成像模块包括显微物镜和成像部分。显微物镜与刀具的相对位置固定，通过调节显微物镜使其光轴垂直于刀具表面，且焦点处于刀具表面。可以对切削过程中刀具表面的组织样品进行清晰成像。采用落射照明方式，显微物镜同时起到聚焦照明光或激发光于刀具表面组织切片，以及收集组织切片信号光的作用。优选的，所述光学显微成像系统采用扫描成像方式，扫描成像方式通过物镜将照明光或激发光聚焦于刀具表面的组织切片，结合光束扫描器件和光探测器实现组织切片的扫描成像。以电控三维移动平台的位置反馈信号为同步信号，同步扫描成像与切片过程，从而保证各断层图像相对位置的一致性。所述显微光学成像还可以采用的成像方式可以使用宽场照明结合阵列探测器进行成像。因为不透明刀具的使用，可以直接对样品进行宽场照明(面照明或更为集中的线照明)，同时使用阵列探测器实现显微图像的捕捉。因为切片过程中待成像的切片处于运动状态，需要通过电控三维移动平台的位置反馈信号逐行触发阵列探测器的曝光和读出。本发明的组织样品高分辨率断层显微成像装置的成像方法，包括以下步骤:步骤1、所述三维电控移动平台带动所述样品槽中的组织样品相对于所述切削刀具水平运动，所述组织样品被所述切削刀具切削形成微米厚度的组织样品切片，在所述组织样品切片短暂地贴覆于切削刀具上表面滑行的同时，所述光学显微成像系统对短暂贴覆在所述切削刀具上的组织样品切片进行显微光学成像。步骤2、所述三维电控移动平台带动所述样品槽中的组织样品相对于所述切削刀具水平运动到设定水平极限值后，所述三维电控移动平台带动所述样品槽中的组织样品退回初始水平位置，然后在垂直方向上向上步进一个切片厚度，再重复步骤I。逐层切削成像即可获得组织样品的完整高分辨率断层显微光学图像。有益效果:本发明将显微光学成像系统与组织样品切片系统结合，在切片的同时对贴覆在刀具表面的正在形成的组织切片进行同步的显微光学成像，实现组织样品的断层显微光学成像。在成像过程中，切片沿刀具表面滑动，滑动的速度与切削运动的速度相同。通过同步匹配图像采集与切削运动的时序，可以获得运动中的切片的高分辨率显微图像。同时，本发明采用不透明的刀具将切片与剩余的组织样品从空间和光信号上分离开来。使所述光学显微成像系统中的照明光或激发光，不能透过薄切片和刀具对刀具下方剩余组织样品进行照明或激发，消除正在切削的组织切片以外的组织样品对切片采样的干扰，从而得到无背景干扰的断层图像。


下面结合附图对本发明作进一步说明。图1为机械切削实现组织样品断层显微成像系统的示意图。图2为切削刀具与组织样品切片示意图。图3为时序及图像米集流程图。图4为实施例1的结构示意图。
具体实施例方式图1为机械切削实现组织样品断层显微成像系统的示意图。塑性包埋的组织样品I放置在样品槽2中。样品槽2固定于电控三维移动平台3上。组织样品1，样品槽2和电控三维移动平台3固定为一个整体。可以随电控三维移动平台3进行整体的三维移动。刀具4始终处于固定位置。当电控三维移动平台3沿方向5运动时，塑性包埋的组织样品块朝固定的刀具4做相对运动，从而实现切片过程。产生的微米厚度的组织样品切片6就短暂地贴覆于刀具4的上表面并随着切片运动沿刀具4的表面滑行。物镜7相对于刀具4固定，其光轴与刀具4上表面垂直。物镜7 —方面将激发光聚焦于组织样品切片6上,另一方面将切片6的后向散射光或发射光(对荧光样品)进行收集。如图2所示，组织样品块沿方向5相对刀具4的运动切片过程可以得到薄组织切片6。对于塑性包埋硬度到达要求的组织样品包埋块1，组织切片6在靠近刀锋的位置处会短暂地贴覆于刀具4的上表面，并随着切片过程的进行沿方向12顺着刀具4的上表面滑行一段距离后再逐渐脱离刀具4上表面。位置7附近样品切片6相对于刀具4处于比较稳定的贴覆和滑行的状态，对位置7附近的切片区域进行反复成像，则随着切片6的滑行运动，在切片过程完成的同时可以获得切片6的完整图像。在位置7附近，切片6相对于剩余的组织样品I在空间上有一定的距离。另一方面，可以对刀具4的上表面10或下表面11进行光学镀膜。光学镀膜的特性在于其在成像系统所使用的照明光或激发光波长范围内具有很低的透过率，沿光轴9方向传播的照明光或激发光无法透过刀具4照明或激发刀具4下方的组织样品I，使得位置7附近对组织切片6的成像不会受到组织样品I其余部分的干扰，达到图像的层析效果。也可通过选择刀具4的材质为在照明或激发光波长范围内具有低透过率的材料，实现切片6与组织样品I的光学隔离。图3所示为切片运动与图像采集的时序。切片过程由电控移动平台的两个运动阶段13组成:即样品朝向刀具运动的进刀过程，和样品原理刀具运动的退刀过程。在进刀过程实现切片。在电控移动平台的运动过程中给以产生与平台运动位置相关的触发信号14。平台每次运动指定的距离15之后开始给出位置触发信号。之后根据成像像素分辨率的需要，每运动距离16即产生一次触发信号。该触发信号用于触发图像的逐行采集过程17。距离16即决定了切片图像每行像素的尺寸。根据组织样品的大小，组织切片的图像由N行像素组成。N=L/S，其中L为切片的总长度，S为图像中一行像素的实际大小，也即为距离16的大小。在逐行图像采集的过程中对各行图像数据进行组合重建和图像数据的存储过程18，从而得到一个组织切片的断层显微光学图像。重复上述过程可以逐层得到组织样品的断层显微光学图像。
实施例1如图4所示为对绿色荧光蛋白(GFP)标记的组织样品的机械切削高分辨率断层光学显微成像系统。激光器19输出波长为488nm的激光,经过柱透镜20,将光束在柱透镜20的焦距位置聚焦为线光源。经过筒镜21和物镜8，在组织切片6上形成一条激发线。该激发线位置激发的样品荧光信号经物镜8和筒镜21成像于线阵列探测器24的光敏面上，得到切片6荧光图像中的一行。随切片运动的进行，切片6沿刀具4表面滑行，并被488nm的激发线逐行激发，电控平台沿方向5运动过程中，每运动切片6上一行的距离即产生一个触发信号，控制线阵探测器24的曝光和数据读出，从而逐行得到切片6的完整荧光图像。使用金刚石刀具4，为了实现满意的断层成像效果，在金刚石刀具下表面镀488nm的高反射膜25。在光路中二向色分束镜21用于实现488nm激发光和GFP荧光的分离，为了消除组织切片6、金刚石刀具4和高反射膜25三者反射的488nm激发光，在线阵探测器24之前放置488nm的截止片23。具体的，如果使用40x物镜8，成像像素大小设为0.5 μ m，则可以采用像素尺寸为20 μ m的线阵相机为探测器24。电控移动平台3配置光栅尺为位置传感器，使其每运动
0.5 μ m产生一个触发脉冲。塑性包埋的组织切片在方向5上的尺寸为10mm，则切片运动过程中，共产生10mm/0.5 μ m=20，000个触发脉冲，将这些触发脉冲作为线阵相机的曝光触发信号，则在切片过程中共进行20，000次曝光，每次曝光得到组织切片6的一行图像(行高为
0.5μπι)。20，000行图像的合成即得到组织切片6的完整图像。金刚石刀具4下表面的高反射膜，使488nm的激发光不能透过刀具4激发其下的组织样品4，因而组织切片6的图像不会受到组织样品其余部分荧光信号的干扰，实现断层效果的显微成像效果。实施例2成像系统结构如实施例1，如图4所示。其中刀具4使用不透敏的碳化钨硬质刀具或黑色金刚石刀具。因为刀具材料自身的不透明性，可以无需在刀具表面进行光学镀膜处理。成像过程的其他设置及步骤同实施例1，故不再赘述。
权利要求
1.一种组织样品高分辨率断层显微成像装置，其特征在于，包括组织样品切片模块和光学显微成像系统；所述组织样品切片模块包括三维电控移动平台，样品槽和切削刀具，所述样品槽安装在所述三维电控移动平台上，包埋的组织样品固定于所述样品槽中，所述切削刀具固定安装在所述样品槽上方，所述切削刀具的切削面与所述组织样品上表面成钝角相交，所述光学显微成像系统与所述切削刀具相对位置固定，且聚焦于所述切削刀具头；所述切削刀具进行不透明处理。
2.根据权利要求1所述的组织样品高分辨率断层显微成像装置，其特征在于，所述切削刀具的不透明处理包括，采用在激发或照明光波长范围内不透明的材质制作刀具，或者，对刀具表面进行硬质光学镀膜处理，通过镀膜实现激发或照明光波长范围内的低透过率或高反射率。
3.根据权利要求1或2所述的组织样品高分辨率断层显微成像装置，其特征在于，所述光学显微成像系统采用扫描成像方式，或宽场照明或结合阵列探测器方式实现成像。
全文摘要
本发明公开了一种基于机械切削、在对组织样品进行薄切片的同时对薄切片进行显微光学成像，实现组织样品的高分辨率断层显微成像的装置，该装置包括组织样品切片模块和光学显微成像系统，切削刀具进行不透明处理。本发明在切削过程切片和组织样品的物理分离的同时进行断层成像图像采集，同时，切削刀具进行不透明处理使所述光学显微成像系统中的照明光或激发光，不能透过薄切片和刀具对刀具下方剩余组织样品进行照明或激发，消除正在切削的组织切片以外的组织样品对切片采样的干扰。可用于对组织样品进行快速高分辨率的断层显微成像。
文档编号G01N1/06GK103207150SQ20131009351
公开日2013年7月17日 申请日期2013年3月21日 优先权日2013年3月21日
发明者曾绍群, 骆清铭, 龚辉, 吕晓华, 熊汗青 申请人:华中科技大学