一种j亚群禽白血病免疫胶体金抗体检测试纸条的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种J亚群禽白血病免疫胶体金抗体检测试纸条，其中最主要的是采用了原核表达后纯化的J亚群禽白血病病毒表面蛋白偶联免疫胶体金，利用该胶体金可以快速检测血清中的J亚群禽白血病抗体，进而为鸡群J亚群禽白血病精准快速诊断提供技术保障。通过Western?Blot检测表达的gp85蛋白能够与JE9单抗和抗HIS标签抗体发生特异性反应，表明具有良好的特异性。
【专利说明】一种J亚群禽白血病免疫胶体金抗体检测试纸条
【技术领域】
[0001]本发明涉及预防兽医学检验领域，具体涉及了一种J亚群禽白血病免疫胶体金抗体检测试纸条。
【背景技术】
[0002]J亚群禽白血病是由J亚群禽白血病病毒(ALV-J)引起的一种肿瘤性疾�。俅采现饕运柘赴园籽《嗉芯糠⑾諮亚群禽白血病毒还能诱发淋巴细胞性白血病、成髓细胞性白血病、成红细胞性白血病等多种肿瘤性疾病。J亚群禽白血病已经从最初的感染肉鸡到现在的感染蛋鸡、火鸡及地方鸡品种。近几年，禽白血病的流行呈现高感染率、高发病率，早期感染普遍、发病日龄明显提前，混合感染促使病毒重组频率增高，宿主范围扩展、肿瘤趋于多样化等新特点。目前，与J亚群白血病密切相关的血管瘤病在蛋种鸡群及商品蛋鸡群中的爆发，给养禽业造成了巨大的损失。基于其病毒特性，一直未有行之有效的疫苗、药物防治此病。国外通过净化控制本病的发生。由于净化周期长、成本高，在我国目前还未能有效实施，只能通过淘汰感染鸡只进行大群净化，快速精准检测J亚群禽白血病的感染对于净化控制J亚群禽白血病具有极其重要的意义。
[0003](I) ALV-J表面蛋白(SU)的生物学功能
[0004]ALV-J属于反转录病毒。病毒囊膜蛋白可分为由gp85基因编码的表面蛋白(surface protein, SU)和 gp37 基因编码的跨膜蛋白(transm-embrane protein, TM), 二者在一起形成二聚体，病毒囊膜蛋白决定亚群的特异性。SU含有病毒一受体决定簇，负责识别靶细胞膜上的特异性受体，TM负责介导病毒与细胞的融合过程。SU刺激机体产生的中和抗体具有亚群特异性。ALV-J表面蛋白的核酸序列与其它ALV亚群同源性只有40%。ALV-J囊膜蛋白的SU可特异性识别J亚群禽白血病毒刺激机体产生的中和抗体，对于J亚群禽白血病的诊断具有重要意义。
[0005](2) J亚群禽白血病诊断方法研究现状
[0006]对于J亚群禽白血病的诊断方法国内外都有过许多报道，主要为病毒分离与鉴定、免疫学检测方法、核酸分子检测方法。病毒的分离与鉴定耗费时间过长且只适用于实验室诊断；免疫学检测方法如间接免疫荧光、ELISA方法等都需要一定的专业知识和设备，不适用于养殖场的现场检测；核酸分子检测方法如PCR等容易受到假阳性、假阴性及抗原变异的干扰，且上述检测方法均建立在实验室基础上并需要专业操作人员操作。因此研制快速精准并易于操作携带的J亚群禽白血病免疫胶体金抗体检测试纸条，对于我国鸡群J亚型禽白血病的净化防制具有重要的现实意义。
【发明内容】
[0007]针对现有存在的上述问题，本发明提供了一种J亚群禽白血病免疫胶体金抗体检测试纸条，其中最主要的是采用了原核表达后纯化的J亚群禽白血病病毒表面蛋白偶联免疫胶体金，利用该胶体金可以快速检测血清中的J亚群禽白血病抗体，进而为鸡群J亚群禽白血病精准快速诊断提供技术保障。通过Western Blot检测表达的gp85蛋白能够与JE9单抗和抗HIS标签抗体发生特异性反应，表明具有良好的特异性。
[0008]本发明所采用的具体技术方案是:
[0009]通过比对临床病例，特别是混合肿瘤、单纯髓细胞瘤、血管瘤、纤维肉瘤、组织肉瘤、成红细胞瘤、肾瘤等病例，通过抗体及PCR检测确定ALV-J感染，DF-1细胞培养并分离病毒，比对分析各病毒表面蛋白的关键保守基因序列，最终确定采用ALV-J gp85基因片段，并根据上述表面蛋白的关键保守基因序列设计引物扩增保守序列，最终原核表达的SU蛋白制备试纸条，所获得的试纸条可以完全实现J亚群禽白血病的精准诊断。
[0010]其具体过程如下:
[0011]根据现有的ALV-J设计特异性引物，所述的正向引物为5’-GCGGATCCATCAAGAACGGAACAACACG-3’，含BamH I酶切位点，其基因序列如SEQ ID N0.2所示；反向引物为5’-GCGCGCAAGCTTGTCCCCACAAATCAAGAAAATA-3’，含 Hind III 酶切位点，其基因序列如 SEQ ID N0.3所示。
[0012]利用上述一对引物以J亚群禽白血病病毒的DNA为模版进行PCR扩增，其中优选采用 NX0101 (ALV-J, DQl 15805.1)的 DNA 为模板；
[0013]PCR反应条件为:95°C 5min，充分变性后进入循环体系:95°C 40s，65°C lmin,72°C lmin，循环 35 次后 72°C延伸 IOmin0
[0014]扩增产物测序，其基因序列如SEQ ID N0.1所示；
[0015]利用该基因片段连接pET30a载体，得到了重组载体pET30a — gp85重组质粒，使用ImmoL IPTG诱导表达得到带有HIS标签的融合蛋白His-gp85，进而利用该蛋白与胶体金偶联后涂布于硝酸纤维素膜上，制成试纸条采用间接法测抗体。
[0016]本发明的这种试纸条适用于大规模批量生产，易于操作携带，可快速诊断J亚群禽白血�。觳馐奔渲恍�5分钟，一个中等养殖规模的鸡场，从制备血清到检测，只需在二十分钟内即可快速确定其鸡群J亚群禽白血病的感染状态，对于我国J亚群禽白血病及时发现和适时净化具有重要意义，且特异性强可以完全实现J亚群禽白血病的精准诊断。
[0017]与现有技术相比，如“ J亚群禽白血病抗体快速检测试纸卡及其应用”，其所用鼠抗鸡IgGFc片段单克隆抗体较多抗具有良好的特异性，但只能针对某一特定的抗原决定簇，用途单一；
[0018]而我们所用的多克隆抗体所使用的是SU蛋白，含有多个抗原位点，能够与不同的抗原决定簇进行结合，因而更加准确的检测到血清中的抗体从而确定鸡群的感染状况，较之现有的检测试纸能够更加有效准确的检测出鸡群感染状况
[0019]本发明所获得的试纸条具体结构如下:
[0020]一种J亚群禽白血病免疫胶体金抗体检测试纸条，包括支撑层和吸附层，吸附层固定在支撑层上，吸附层从测试端依次为样品吸附纤维层、金标SU蛋白纤维层、纤维素膜层及吸水材料层。在所述的纤维素膜层中部有一条包被J亚群禽白血病SU蛋白的检测线和一条包被SU蛋白兔多克隆抗体的质控线，所述的纤维素膜层一端嵌入金标SU蛋白纤维层，另一端嵌入吸水材料层中。
[0021]其中，所述的支撑层用不吸水的硬质塑料条制成；
[0022]所述的测试端的样品吸附纤维层用玻璃纤维制成；[0023]所述的金标SU蛋白纤维层吸附有胶体金标记的高纯度的SU蛋白；
[0024]所述的纤维素膜层用硝酸纤维素膜制成；
[0025]所述的吸水材料层用吸水纸制成；
[0026]所述的SU蛋白兔多克隆抗体为采用常规技术，利用多克隆抗体制备技术将SU蛋白免疫新西兰大白兔获得，为现有技术，在此不再赘述。
[0027]上述的各种材料均为市购。
[0028]本发明所述胶体金试纸条的制备方法如下:具体步骤:
[0029]I)在纤维素膜层的不同位置上分别包被SU蛋白和SU蛋白的多克隆抗体，分别形成检测线和质控线；具体步骤为:将包被浓度为2mg/ml的SU蛋白溶液按2ul/cm的速度喷于检测层上作为检测线，将包被浓度为2mg/ml的SU蛋白多克隆抗体按2ul/cm的速度喷于检测线下方的检测层上作为质控线，37°C下干燥30min，从而制备得到检测线和质控线；
[0030]其中所述的2mg/ml的SU蛋白溶液用pH为7.5,0.02M的PBS缓冲液稀释获得的；
[0031]2)金标抗体纤维层的制备，具体步骤为:以柠檬酸钠还原法制备金溶液，即在IOOml沸腾的0.02wt%氯金酸水溶液中加入Iml的lwt%柠檬酸三钠溶液，可获得直径在45nm左右的胶体金；
[0032]通过直接混合的方式以0.2mo 1/L的K2C03溶液调节上述获得的胶体金pH至7.0-8.5，以1:1000的标记比例将待标记的SU蛋白加入到上述调整pH之后的胶体金中，标记20min后，再向上述标记后的胶体金溶液中加入10wt%的PEG10000水溶液；至PEG10000的终浓度为0.lwt%, 4°C >3000rpm离心30min,除去未结合的胶体金颗粒,4°C、13000rpm离心30min,弃上清液,获得初步纯化的金标抗体；
[0033]其中所采用的10wt%的PEG10000水溶液是利用市售的PEG10000，用双蒸水把它稀释成10wt%的水溶液获得的；之后利用上述获得的10wt%的PEG10000溶液加入到标记后的胶体金溶液中，利用胶体金溶液对其进行稀释，使PEG10000的最终浓度变成0.lwt%即可；
[0034]按2mg/ml为1:100的的比例用含0.l_2wt%BSA的0.001-0.2mol/L磷酸盐缓冲液稀释胶体金标记的SU蛋白，将上述稀释后的金标抗体液按50ul/cm2的速度喷于玻璃纤维素膜中，4°C低温真空干燥；
[0035]3)采用现有工艺和设备组装支撑层、纤维素膜层、金标SU蛋白纤维层、吸水材料层和样品吸附纤维层既得目标试纸条。
[0036]综上所述，采用本发明的这种J亚群禽白血病免疫胶体金抗体检测试纸条,其中最主要的是采用了原核表达后纯化的J亚群禽白血病病毒表面蛋白偶联免疫胶体金，利用该胶体金可以快速检测血清中的J亚群禽白血病抗体，进而为鸡群J亚群禽白血病精准快速诊断提供技术保障。通过Western Blot检测表达的gp85蛋白能够与JE9单抗和抗HIS标签抗体发生特异性反应，表明具有良好的特异性，具有广泛的推广和应用价值。
【专利附图】
【附图说明】
[0037]图1为PCR扩增ALV-J gp85基因片段电泳图，
[0038]途中M 为 DL2500marker; I 为 ALV-J gp85 基因片段；
[0039]图2为pET30a_gp85重组质粒酶切鉴定结果电泳图；
[0040]图中M 为 DL5000marker ；1 为使用 BamH I 和 Hind III 酶切 pET30a_gp85 后获得的片段；
[0041]图3为pET30a_gp85重组质粒在BL21中诱导表达电泳图谱；
[0042]图中 M 为 170KD protein marker ； I 为加入 IPTGOh 后;2 为加入 IPTGlh 后；3 为加入IPTG2h后；4为加入IPTG3h后；
[0043]图4为SU蛋白纯化后的SDS-PAGE分析结果图，
[0044]图中M为170KD protein marker; I为SU蛋白纯化产物；
[0045]图5Western blot 法检测 SU 蛋白，
[0046]图中M为170KD protein marker; I为杂蛋白;2为目的蛋白；
[0047]图6ALV-J抗体检测试纸条检测结果示意图，
[0048]上方为阴性血清样品检测结果呈阴性，下方为阳性血清样品检测结果呈阳性。【具体实施方式】
[0049]本实施例中所采用的具体试剂和仪器为:
[0050](I)主要试剂
[0051]HRP酶标二抗为博奥森生物有限公司产品；
[0052]TMB单组份底物显色溶液，DAB显色试剂盒为天根公司产品；
[0053]Taq聚合酶，限制性内切酶Hind II1、BamH 1、T4连接酶、dNTP、DNA Marker为大连宝生物有限公司产品；
[0054]PCR产物纯化试剂盒、质粒抽提试剂盒为OMEGA公司产品；
[0055]蛋白预染Marker为北京全式金生物技术有限公司产品；
[0056]胰蛋白胨(Tryptone)及酵母抽提物(Yeast Extract)为Oxiod公司产品；
[0057]其余试剂为国产分析纯试剂。
[0058](2)主要仪器
[0059]PCR仪、分光光度计为Eppendorf公司产品；
[0060]低温高速离心机为湖北湘仪公司产品；
[0061]凝胶成像系统为北京君意公司产品；
[0062]酶标仪为Thermo公司产品；
[0063]恒温摇床为上海申能博彩公司产品；
[0064]恒温培养箱、超净工作台为上海博迅公司产品；
[0065]电泳仪、SDS-PAGE电泳槽、Western-blot膜转印装置为北京六一公司产品；
[0066]细胞超声波粉碎机为宁波新芝生物有限公司产品。
[0067]除上述列出内容外，本发明为提及的部分均采用现有技术。
[0068]实施例1ALV-J gp85基因的克隆及测序
[0069]根据现有ALV-J前病毒基因组DNA gp85囊膜蛋白基因设计引物，正向引物为5’-GCGGATCCATCAAGAACGGAACAACACG-3，,含BamH I酶切位点(下划线部分)其基因序列如SEQID N0.2 所示；反向引物为 5，-GCGCGCAAGCTTGTCCCCACAAATCAAGAAAATA-3，.含 Hind III 酶切位点(下划线部分)，其基因序列如SEQ ID N0.3所示。
[0070]利用上述一对引物以J亚群禽白血病病毒的DNA为模版进行PCR扩增，其中所选择的J亚群禽白血病病毒为NX0101 (ALV-J, DQl 15805.1)；[0071]PCR反应条件为:95°C 5min，充分变性后进入循环体系:95°C 40s，65°C lmin,72°C lmin，循环 35 次后 72°C延伸 IOmin0
[0072]将PCR产物于1%琼脂糖凝胶中电泳，结果见图1，获得了 504bp的片段。
[0073]扩增的片段采用常规方法连接于PTZ57R/T克隆载体进行基因测序，将对应的氨基酸序列与近三年我国分离得到的16株不同肿瘤型ALV-J氨基酸保守序列进行分析比对:与其中9株的同源性高于98%，最低同源性也可达87%，确保所制备的gp85蛋白可与我国ALV-J流行毒株感染鸡只产生抗原抗体反应。
[0074]将pET30a和连接了目的基因的PTZ57R/T克隆载体分别用限制性内切酶BamH I和Hind III进行双酶切lOmin，按照胶回收试剂盒说明书的要求分别回收大片段和目的基因片段；
[0075]将上述获得的目标物22°C过夜连接，其中连接体系为:pET30a载体0.5μ 1，gp85基因片段 1μ 1，(1Η2020μ 1，T4DNA连接酶 1μ l，10x buffer2.5 μ 1，总体积共 25 μ 1，获得连接产物pET30a — gp85重组质粒。
[0076]将连接产物pET30a — gp85重组质粒按照常规方法转入CaC12制备的感受态细菌BL21中，涂布于含有卡那霉素的LB平板中，370C过夜生长，次日挑取单菌落，摇菌，提取质粒进行双酶切鉴定后送去测序，确认其中具有如SEQ ID N0.3所示的序列，可见获得的gp85保守基因504bp的片段已经成功克隆入pET30a — gp85重组质粒中。
[0077]实施例2gp85蛋白的表达和纯化
[0078]将测序后含有重组质粒的阳性BL21菌接种于含Kan (终浓度为10 μ g/ml)的LB液体培养基中(市购常规培养基，其中含有l%(w/v) Tryptone, 0.5% (w/v) Yeast Extract,l%(w/v)NaCl,0.lmg/ml Kanamycin), 37°C振荡(200rpm),培养至 0D600=1.0,加入浓度为500mMol的IPTG至整个培养基中IPTG的终浓度为lmmol/L，37°C继续培养3h，同时设未诱导的重组质粒转化BL21菌作为对照。
[0079]经SDS-PAGE分析显示，检测步骤如下:收集培养的工程菌菌液，5000rpm，离心5min,弃上清,沉淀按照IOOml初始培养基加入标准PBS3ml的比例，向沉淀中加入标准的PBS获得重悬液，沉淀重悬后分装与5ml离心管中每管3ml。将离心管置于冰水混合物的烧杯内，用超声破菌仪超声破菌，120W，工作ls，间歇2s，超声2个循环；将超声破菌液转入50ml离心管中，配平,放入高速冷却离心机中，8000rpm,4°C,离心IOmin,然后用SDS-PAGE电泳检测；结果上清中无蛋白(未显示)，蛋白存在于沉淀中，说明目的蛋白gp85以包涵体形式表达，如图3所示，目的SU蛋白大小约为18KD ；
[0080]SU蛋白的纯化步骤如下:
[0081]将上述离心获得的沉淀用9倍体积的洗涤液I重悬沉淀，静置5min后，8000rpm，5min弃上清。用9倍体积的洗漆液II重悬沉淀，静置5min后,8000rpm, 5min,弃上清,保留沉淀。用9倍体积的洗漆液III重悬沉淀，静置5min后,8000rpm, 5min,弃上清,保留沉淀。按IOOml菌液加8ml溶解液，4°C过夜。8000rpm，离心5min。取上清，即为纯化蛋白。
[0082]包涵体纯化所述试剂配制方法:
[0083](I)细菌重悬液(250ml): PBS (NaCl2g, KC10.05g, Na2HPO40.36g KH2PO40.06g)，lmm/L EDTA.[0084](3)溶液 I (250ml):500mmol/L Tris-Cl (pH=6.0), 50mmo I /T, NaCl, 50mmo I /T,EDTA
[0085](3)溶液 II (250ml):溶液 I，IM 尿素
[0086](4)溶液 III (250ml):溶液 I，2M 尿素
[0087](5)包涵体溶解液(250ml):溶液I，4M尿素
[0088]SDS-PAGE法与Western Blot法检测纯化后的蛋白(附图4和5)。得到的蛋白经过Bradford法测定蛋白含量,稀释到0.5mg/mL来分装_8(TC保存备用。
[0089]上述使用的SDS-PAGE法为常规方法，未提及的试剂为常规方法规定使用的试剂，其具体操作步骤如下:
[0090]I)将玻璃板洗干净，用夹子固定，垂直放置，配置12%分尚胶,快速注入到两玻璃板之间，胶上部加蒸馏水封口，以保持胶面平整。待分离胶凝固后，倒去分离胶表面的蒸馏水，用滤纸吸去残留水。注入浓缩胶，快速插入梳子，并注意防止气泡的产生；
[0091]2)取纯化后的SU蛋白加入15-20 μ 14x SDS上样buffer，煮沸IOmin ；
[0092]3)往电泳槽加入I XTris-甘氨酸缓冲液，待浓缩胶凝固，小心拔掉梳子，用缓冲液冲洗加样孔，用微量进样器上样，10μ I/孔，正确连接电泳槽正负极，打开电源。120V电压电泳，电泳至溴酚蓝到达胶的底部时停止电泳；
[0093]4)染色:取下凝胶，用蒸馏水冲洗，放入考马斯亮蓝染色液中，染色4h以上；
[0094]5)脱色:将凝胶放入脱色液中，置于摇床上脱色，期间更换3次以上脱色液，待凝胶蓝色背景全部脱去停止，将凝胶放入蒸馏水中终止脱色；拍照保存，如图4所示，出现了大小约为18KD的目的SU蛋白条带；
[0095]6)剪一张与Western Blot凝胶大小相同的NC膜，用去离子水浸透，同时将与凝胶大小相同的两张滤纸及纤维垫用转印缓冲液浸透；
[0096]7)按三明治法安装转印装置，即负极夹-纤维垫-滤纸-凝胶-NC膜-滤纸-纤维垫-正极夹，使NC膜位于转印的正极面，凝胶位于负极面，其间无任何气泡间隙。将转印装置放入转移电泳仪中，加入转移缓冲液，140mA电泳2h。
[0097]8)转印结束后，将转移后的NC膜用去离子水漂洗一遍，将NC膜浸泡于封闭液中，4°C封闭过夜；
[0098]9)用PBST洗涤NC膜三遍，每次IOmin ；
[0099]10)使用免疫小鼠阳性血清为一抗，NC膜与一抗37°C反应lh，用PBST洗膜三次，IOmin/ 次；
[0100]11 )NC膜置于过HRP标记的羊抗鼠IgG中，37°C反应lh，用PBST洗膜三次，IOmin/次；
[0101]12)使用DAB显色试剂盒避光显色；此时应密切观察显色过程，并在较浅本底且达到适当显色强度时流水终止显色；拍照保存，如图5所示，出现了大小约为18KD的目的SU蛋白条带。
[0102]实施例3gp85蛋白的活性检测
[0103]使用上述纯化得到的Hi s-gp85蛋白包被ELISA板，使用酶联免疫吸附试验检测该蛋白的生物学活性。以IDEXX公司生产的ALV-J抗体检测试剂盒检测为阳性的鸡血清为阳性对照，健康SPF鸡血清为阴性对照，HRP标记羊抗鼠IgG酶标二抗按说明书使用。结果显示阳性对照与阴性对照的OD值比值大于2.1，说明该蛋白有良好的生物学活性和抗原性。[0104]ELISA具体步骤如下:
[0105]I)包被:取纯化的重组SU蛋白，以生理盐水稀释至最佳浓度，包被反应板，100 μ I/孔，4°C过夜；
[0106]2)洗涤:甩去酶标板中的包被液，用PBST (PBS，0.05%Tween-20)加满各孔，摇床震荡3min,弃去PBST，洗涤3次，3min/次，拍干；
[0107]3)封闭:各孔加入封闭液(3%脱脂乳)，350 μ I/孔，置37°C培养箱孵育0.5h，洗涤3次，3min/次,拍干；
[0108]4)加样:将待待检血清按梯度稀释后加入包被板，100 μ I/孔，同时设立阴阳性血清对照；置37°C培养箱孵育lh，洗涤3次，3min/次，拍干；
[0109]5)用封闭液将HRP羊抗鼠IgG酶标二抗按1:5000稀释，100 μ I/孔，置37°C培养箱孵育lh，洗涤3次，3min/次，拍干；
[0110]6)显色:使用TMB单组份显色试剂盒(TIANGEN公司产品)按100 μ I/孔加入包被板，室温下避光显色20min加终止液，2M H2S04终止显色；
[0111]7)用酶联免疫检测仪测其在波长450nm检测各个孔的OD值，阴性对照0D450值为N，阳性对照0D450值为P。若P/N>2.1判为阳性。
[0112]实施例4J亚群禽白血病免疫胶体金抗体检测试纸条的制备
[0113]I)在纤维素膜层的不同位置上分别包被SU蛋白和SU蛋白的多克隆抗体，分别形成检测线和质控线；具体步骤为:将包被浓度为2mg/ml的SU蛋白溶液按2ul/cm的速度喷于检测层上作为检测线，将包被浓度为2mg/ml的SU蛋白多克隆抗体按2ul/cm的速度喷于检测线下方的检测层上作为质控线，37°C下干燥30min，从而制备得到检测线和质控线；
[0114]其中所述的2mg/ml的SU蛋白溶液用pH为7.5,0.02M的PBS缓冲液稀释获得的；
[0115]2)金标抗体纤维层的制备，具体步骤为:以柠檬酸钠还原法制备金溶液，即在IOOml沸腾的0.02wt%氯金酸水溶液中加入Iml的lwt%柠檬酸三钠溶液，可获得直径在45nm左右的胶体金；
[0116]通过直接混合的方式以0.2moI/L的K2C03溶液调节上述获得的胶体金pH至
7.0-8.5，以1:1000的标记比例将待标记的SU蛋白加入到上述调整pH之后的胶体金中，标记20min后，再向上述标记后的胶体金溶液中加入10wt%的PEG10000水溶液；至PEG10000的终浓度为0.lwt%, 4°C >3000rpm离心30min,除去未结合的胶体金颗粒,4°C、13000rpm离心30min,弃上清液,获得初步纯化的金标抗体；
[0117]其中所采用的10wt%的PEG10000水溶液是利用市售的PEG10000，用双蒸水把它稀释成10wt%的水溶液获得的；之后利用上述获得的10wt%的PEG10000溶液加入到标记后的胶体金溶液中，利用胶体金溶液对其进行稀释，使PEG10000的最终浓度变成0.lwt%即可；
[0118]按2mg/ml为1:100的的比例用含0.l_2wt%BSA的0.001-0.2mol/L磷酸盐缓冲液稀释胶体金标记的SU蛋白，将上述稀释后的金标抗体液按50ul/cm2的速度喷于玻璃纤维素膜中，4°C低温真空干燥；
[0119]3)采用现有工艺和设备组装支撑层、纤维素膜层、金标SU蛋白纤维层、吸水材料层和样品吸附纤维层既得目标试纸条。
[0120]试验例I
[0121]2013年10月山东省潍坊市某养鸡场发生以病鸡主要表现为困倦、虚弱、鸡冠肉髯苍白、并有消瘦脱水等症状的传染�。蕉┮荡笱笛槭蚁晕⒕低计蚉CR方法检查诊断为J亚群禽白血病感染；
[0122]发明人采集鸡场病鸡的血清，利用本发明实施例4制备的试纸条逐条进行检测，检测结果均为阳性，与经山东农业大学实验室显微镜图片和PCR方法检查诊断完全一致，证明本发明所提供的试纸条不需要任何的设备，就可以进行临床样本的检测，且特异性强，操作简便、快速，结果显示直观、准确，能广泛应用于基层对于J亚群禽白血病的检测。
[0123]试验例2
[0124]2013年11月新泰市某养鸡场发生以病鸡鸡冠肉髯苍白、消瘦、脱水、腹部膨大、可触摸到肿大的肝脏为主要特征的疾�。蕉┮荡笱笛槭襊CR检测为J亚群禽白血病。
[0125]发明人采集活鸡的血清样本，利用本发明实施例4制备的试纸条逐条进行检测，检测结果均为阳性，与经山东农业大学实验室PCR方法检查诊断完全一致，证明本发明所提供的试纸条不需要任何的设备，就可以进行临床样本的检测，且特异性强，操作简便、快速，结果显示直观、准确，能广泛应用于基层对于J亚群禽白血病的检测。
【权利要求】
1.一种J亚群禽白血病免疫胶体金抗体检测试纸条，其特征在于:采用了原核表达后纯化的J亚群禽白血病病毒表面蛋白偶联免疫胶体金，其中所述的原核表达后纯化的J亚群禽白血病病毒表面蛋白为带有HIS标签的融合蛋白His-gp85，所述试纸条的制备方法如下: 根据现有的ALV-J设计特异性引物，所述的正向引物为5’-GCGGATCCATCAAGAACGGAACAACACG-3，，含BamH I酶切位点，其基因序列如SEQ ID N0.2所示；反向引物为5，-GCGCGCAAGCTTGTCCCCACAAATCAAGAAAATA-3’，含 Hind III 酶切位点，其基因序列如 SEQ ID N0.3 所示； 利用上述一对引物以J亚群禽白血病病毒的DNA为模版进行PCR扩增: PCR反应条件为:95 V 5min,充分变性后进入循环体系:95 V 40s, 65 V lmin,72°C lmin，循环 35 次后 72°C延伸 IOmin ； 扩增产物测序，其基因序列如SEQ ID N0.1所示； 利用该基因片段连接pET30a载体，得到了重组载体pET30a — gp85重组质粒，使用ImmoL IPTG诱导表达得到带有HIS标签的融合蛋白His-gp85，进而利用该蛋白与胶体金偶联后涂布于硝酸纤维素膜上，制成试纸条。
2.根据权利要求1所述的试纸条，其特征在于:以NXOlOl的DNA为模版进行PCR扩增。
3.—种J亚群禽白血病免疫胶体金抗体检测试纸条的制备方法，其特征在于:具体步骤如下: 根据现有的ALV-J设计特异性引物，所述的正向引物为5’-GCGGATCCATCAAGAACGGAACAACACG-3’，含BamH I酶切位点，其基因序列如SEQ ID N0.2所示；反向引物为5’ -GCGCGCAAGCTTGTCCCCACAAATCAAGAAAATA-3’，含 Hind III 酶切位点，其基因序列如 SEQ ID N0.3 所示； 利用上述一对引物以J亚群禽白血病病毒的DNA为模版进行PCR扩增: PCR反应条件为:95 V 5min,充分变性后进入循环体系:95 V 40s, 65 V lmin,72°C lmin，循环 35 次后 72°C延伸 IOmin ； 扩增产物测序，其基因序列如SEQ ID N0.1所示； 利用该基因片段连接pET30a载体，得到了重组载体pET30a — gp85重组质粒，使用ImmoL IPTG诱导表达得到带有HIS标签的融合蛋白His-gp85，进而利用该蛋白与胶体金偶联后涂布于硝酸纤维素膜上，制成试纸条； 所述的扩增模板DNA为NXOlOl的DNA。
【文档编号】G01N33/68GK103808945SQ201410088234
【公开日】2014年5月21日 申请日期:2014年3月12日 优先权日:2014年3月12日
【发明者】成子强, 王言明 申请人:山东农业大学
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