基于毛细管整体柱的表面增强拉曼基底的制备方法
【专利摘要】本发明基于毛细管整体柱的表面增强拉曼基底的制备方法，包括以下步骤：⑴毛细管的预处理；⑵整体柱的合成；⑶毛细管整体柱的功能化处理；⑷制备合成反应物；⑸修饰金属纳米粒子；⑹拉曼光谱的检测；本发明将毛细管色谱分离技术与表面增强拉曼光谱技术联用，构建了微型的纳米粒子修饰的整体柱SERS基底，方法简便，重复性好；在整体柱材料上修饰的金属纳米粒子具有良好的生物亲和力，构建的基底对于生物样品的富集、分离、检测具有优势：反应时间短、易于保存、重复性和稳定性极好，具有检测灵敏度高、检测进样量少、检测信号均一的优点，为实现整体柱上的分离检测奠定了基础。
【专利说明】基于毛细管整体柱的表面增强拉曼基底的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及分析化学【技术领域】，涉及毛细管色谱与拉曼光谱技术，具体地说，是一种基于毛细管整体柱的表面增强拉曼基底的制备方法。
【背景技术】
[0002]表面增强拉曼光谱(SERS)具有较高的表面物种的检测灵敏度，能从分子水平上获得物质的结构及化学组成信息，具有识别指纹的特征，其与红外、荧光等其它光谱手段相比具有不受水干扰、不易猝灭、可用红光激发、受生物样品自身荧光干扰小等优点，尤其适合于对生物体系的研究。所涉及的金属溶胶基底由于制备简单、增强效果好，是最常用的一种SERS活性基底。
[0003]金属纳米粒子能制备纳米级的SERS粗糙表面，在物理、化学很多领域得到了广泛应用。比较常用的纳米粒子有Ag、Au纳米颗粒,其粒径一般在10?IOOnm之间。当分析物分子加入至溶胶溶液之后，溶胶中的纳米颗粒得到一定程度的凝聚，这是溶胶作为SERS基底能增强SERS信号的必要条件:其中，银纳米粒子(AgNPs)制备简单、快速，SERS灵敏度高；金纳米粒子(GNPs)具有更好的稳定性、小尺寸效应、量子效应、表面效应和良好的生物亲和效应，可用于从复杂的基体中萃取和富集目标分析物。
[0004]在分析化学领域，“整体柱”又称“整体固定相”，是在柱管内原位聚合或固定化了的连续整体多孔结构，人们可根据需要对整体材料的表面作相应的衍生化，是一种新型的用于分离分析或作为反应器的多孔介质。整体柱材料是多孔性结构，是一种良好的SERS基底的支架结构。整体柱中的空间由聚合物颗粒中的孔和颗粒间的缝隙组成，具有极大的表面积，“分离”是在样品流经孔结构时发生的。目前，人们可通过控制聚合条件来得到具有理想孔径分布的整体柱。将整体柱材料与SERS联用可实现对于探针分子的微量超灵敏检测。同时，结合纳米粒子后的整体柱材料也具有良好的富集、分离特性。作为有机聚合整体柱的一类，基于甲基丙烯酸缩水甘油酯和硅胶整体柱在高效液相色谱中已得到了广泛应用。但是，传统的表面增强拉曼光谱基底在稳定性、均一性和重复性上存在一些不足，对表面增强拉曼光谱的研究与应用有一定的影响。
【发明内容】
[0005]本发明目的在于解决上述问题，提供一种基于毛细管整体柱的表面增强拉曼基底的制备方法，用其制备的表面增强拉曼基底具有测灵敏度高、检测进样量少、重复性和稳定性好的优点，能将毛细管色谱的分离、富集功能与表面增强拉曼光谱的在线检测相结合，实现在整体柱上的在线分离和富集检测。
[0006]为实现上述目的，本发明采取了以下技术方案。
[0007]—种基于毛细管整体柱的表面增强拉曼基底的制备方法，其特征是，包括以下步骤:
(I)毛细管的预处理 ①将毛细管依次用稀碱、水、稀酸、去离子水和无水乙醇冲洗，冲洗后用氮气吹干；
②通入硅烷化试剂，将毛细管两端封口在室温下放置24小时；
③洗净后用氮气吹干毛细管以备用；
(2)整体柱的合成
在步骤(I)预处理的毛细管内合成聚丙烯酸酯类、聚苯乙烯类和聚丙烯酰胺类整体柱材料，得到有多孔结构的毛细管整体柱；
(3)毛细管整体柱的功能化处理
利用功能化溶液对步骤(2)得到的毛细管整体柱进行处理，使毛细管整体柱的表面具有特定的功能基团，对金属纳米粒子具有键合或者吸附能力；
所述特定的功能化基团包括氨基或巯基；
(4)制备合成反应物
将硝酸银、氯金酸或者两者混合溶于超纯水中，另取柠檬酸三钠溶液:将硝酸银、氯金酸或者两者混合溶液加热至沸腾，边搅拌边将柠檬酸三钠溶液逐滴缓慢加入，待柠檬酸三钠溶液滴加完成后，继续不断搅拌并保持溶液沸腾状态10分钟，之后停止加热，让溶液自然冷却至室温，得到银溶胶、金溶胶或金银复合溶胶；
(5)修饰金属纳米粒子
利用步骤(4)的合成反应物以下面两种方法修饰金属纳米粒子:
①采用化学还原法在步骤(3)功能化处理后的毛细管整体柱内原位合成金属纳米粒
子;
②采用化学还原法合成金属纳米粒子，再通入步骤(3)功能化处理后的毛细管整体柱
内；
(6)拉曼光谱的检测
在步骤(5)修饰了金属纳米粒子基底的毛细管整体柱内引入检测样品进行表面增强拉曼光谱的检测。
[0008]进一步，步骤(I)使用的毛细管为石英毛细管，内径为530rtn,长度为I?30cm。
[0009]进一步，步骤(I)硅烷化试剂为甲基丙烯酸氧丙基三甲氧基硅烷(Y-MAPS)的丙酮溶液。
[0010]进一步，步骤(3)所述的功能化溶液包括氨水溶液、乙二胺溶液、硫酸溶液、半胱氨酸溶液或硫化钠-磷酸盐缓冲液。
[0011]进一步，步骤(3)功能化处理的多孔结构的毛细管整体柱表面具有活性基团，能被改性；改性的范围包括聚丙烯酸酯类、聚苯乙烯类或聚丙烯酰胺类整体柱。所述毛细管整体柱的材料具有富集与分离特性。
[0012]进一步，步骤(4)所述的金属纳米粒子包括银纳米粒子、金纳米粒子、金银复合纳米粒子，其粒径为IOnm?500nm。
[0013]进一步，在步骤(5)的拉曼光谱检测中，将毛细管整体柱截成长度为5?200mm的短管基底用于表面增强拉曼检测。
[0014]进一步，使用所述短管基底进行检测时，进样量在5?2000 I之间，在去除了涂层的检测窗口位置进行表面增强拉曼检测。[0015]进一步，步骤(5)所述的检测样品为常用的探针分子或者生物分子。
[0016]本发明基于毛细管整体柱的表面增强拉曼基底的制备方法的积极效果是:
(I)将毛细管色谱分离技术与表面增强拉曼光谱(SERS)技术联用，构建了微型的纳米粒子修饰的整体柱SERS基底，方法简便，重复性好。
[0017](2)利用功能化溶液处理毛细管整体柱后合成金属纳米粒子，构建的表面增强拉曼基底比现有的表面增强拉曼基底更加稳定。
[0018](3)本发明在整体柱材料上修饰的金属纳米粒子具有良好的生物亲和力，构建的基底对于生物样品的富集、分离、检测具有优势。
[0019](4)在毛细管整体柱内化学还原合成金属纳米粒子的方法与传统的方法相比，反应时间短，重复性更好。
[0020](5)将表面增强拉曼基底构建在毛细管内，与外界空气的接触面�。龌椎奈榷ㄐ约茫乙子诒４�。
[0021](6)本发明的基于毛细管整体柱的表面增强拉曼基底与现有常见的表面增强拉曼基底相比，具有检测灵敏度高、检测进样量少、检测信号均一和稳定性高的优点。
[0022](7)本发明将毛细管色谱的分离、富集功能与SERS在线检测相结合，为实现整体柱上的分离检测奠定了基础。
【专利附图】
【附图说明】
[0023]图1为本发明的用银纳米粒子修饰的整体柱的扫描电子显微镜照片。
[0024]图2为本发明的用金纳米粒子修饰的整体柱的扫描电子显微镜照片。
[0025]图3为10_9mol/L罗丹明6G分子在银纳米粒子修饰的整体柱表面(随机选取10个点)的拉曼光谱(SERS)谱图。
[0026]图4为10_7mol/L4-巯基吡啶分子在金银复合纳米粒子修饰的整体柱表面(随机选取10个点)的拉曼光谱(SERS)谱图。
[0027]图5为10_6 mo I/L 4_巯基吡啶分子在金纳米粒子修饰的整体柱表面(随机选取10个点)的SERS谱图。
【具体实施方式】
[0028]以下介绍本发明基于毛细管整体柱的表面增强拉曼基底的制备方法的【具体实施方式】，提供3个实施例。但是应该指出，本发明的实施不限于以下的实施方式。
[0029]本发明构建了基于毛细管整体柱和金纳米粒子的表面增强拉曼光谱(SERS)基底，以下实施例是以探针分子罗丹明6G (R6G)和4-巯基吡啶(4-Mpy)的具体实施方法，其中未注明具体条件的实验是按照通常的常规条件或者按照制造厂商建议的条件进行的；所述的“室温”是指实验室操作环境的温度，一般为25°C ;所用试剂未特别标注的均为本领域技术人员在一般实验室常用的试剂，所用原料和试剂除特别说明的之外均为从市场上可购得的原料和试剂。
[0030]实施例1
一种基于毛细管整体柱的表面增强拉曼基底的制备方法，包括以下步骤:
(I)毛细管的预处理 ①米用内径为530 llITi长度为Icm石英毛细管，依次用0.lmol/L NaOH、水、0.lmol/LHC1、去离子水和无水乙醇冲洗，对石英毛细管进行活化，冲洗后用氮气吹干。
[0031]②向干燥的石英毛细管内注入50% (v/v)甲基丙烯酸氧丙基三甲氧基硅烷(Y-MAPS)的丙酮溶液，将石英毛细管两端封口放置在室温下。
[0032]③在常温下反应24小时后，利用甲醇将剩余溶液冲洗干净；再利用氮气将处理好的石英毛细管干燥30分钟，密封备用。
[0033](2)整体柱的合成
称取甲基丙烯酸缩水甘油酯GMA 0.864g、二甲基丙烯酸乙二酯EDMA 0.576g (单体)、十二醇0.3456g和环己醇1.8144g (致孔剂)、过氧化苯甲酰BPO (引发剂)0.0144g,通氮气至过氧化苯甲酰完全溶解；再将所述溶液注射入步骤(I)预处理的石英毛细管中，封口后放入72°C的水浴中，恒温反应24小时后取出；用乙醇洗净，得到有多孔结构的毛细管整体柱。
[0034](3)毛细管整体柱的功能化处理
配制lmol/L乙二胺溶液:将0.2mL乙二胺溶液以0.2mL/h流速通入步骤(2)得到的多孔结构的毛细管整体柱内，使所述毛细管整体柱的表面具有氨基，对金属纳米粒子具有键合或者吸附能力；
然后用去离子水清洗毛细管整体柱至流出液体为中性；
将清洗后的毛细管整体柱切割成5-20mm小段备用。
[0035](4)制备合成反应物
利用柠檬酸三钠还原硝酸银制备银溶胶:称取18mg硝酸银溶于IOOmL超纯水中，充分溶解；另取3mL的柠檬酸三钠溶液(质量分数1%):将硝酸银溶液加热至沸腾，边搅拌边将柠檬酸三钠溶液逐滴缓慢加入，待柠檬酸三钠溶液滴加完成后，继续不断搅拌并保持溶液沸腾状态10分钟，之后停止加热，让溶液自然冷却至室温，得到呈灰绿色的银溶胶。
[0036](5)修饰金属纳米粒子(SERS基底的制备)
取步骤(4)得到的银溶胶0.1mL以0.6mL/h的流速通入步骤(3)处理后的毛细管整体柱中，得到目标产物——基于修饰了银纳米颗粒的毛细管整体柱的表面增强拉曼基底。
[0037](6)拉曼光谱的检测
采用罗丹明6G (R6G)作为探针分子，取IOOyL l(T9mol/L R6G引入步骤(5)修饰了银纳米颗粒的毛细管整体柱的表面增强拉曼基底，再将毛细管整体柱直立置于拉曼激光下，随机测量10个点的SERS信号。
[0038]实施例1制备的基于修饰了银纳米颗粒的毛细管整体柱的表面增强拉曼基底的微观形貌见图1 ;拉曼光谱见图3。
[0039]实施例2
一种基于毛细管整体柱的表面增强拉曼基底的制备方法，包括以下步骤:
(I)毛细管的预处理
采用内径为530 %ι长度为5cm石英毛细管，其余参见实施例1。
[0040](2)整体柱的合成(参见实施例1)。
[0041](3)毛细管整体柱的功能化处理
配制lmol/L半胱氨酸溶液:将0.1mL半胱氨酸溶液以0.2mL/h流速通入步骤(2)得到的多孔结构的毛细管整体柱内，使毛细管整体柱的表面具有巯基，对金纳米粒子具有键合或者吸附能力；
然后用去离子水清洗毛细管整体柱至流出液体为中性；
将清洗后的毛细管整体柱切割成0.5-lcm小段备用。
[0042](4)制备合成反应物
利用柠檬酸三钠还原氯金酸制备金银复合溶胶:取50mL lmmol/L氯金酸与Immol/L硝酸银混合溶液置于250mL的圆底烧瓶中，加热搅拌至沸腾，保持沸腾状态下快速加入
1.85mL柠檬酸钠溶液(质量分数1%)后持续加热保持沸腾状态15分钟，继续不断搅拌，之后移除热源，继续搅拌20分钟；冷却至室温后，将合成的金银复合溶胶置于棕色广口瓶中避光保存。
[0043](5)修饰金纳米粒子(SERS基底的制备)
取步骤(4 )制备金银复合溶胶0.1mL通入步骤(3 )处理后的毛细管整体柱内，得到目标产物——基于修饰了金银复合纳米颗粒的毛细管整体柱的表面增强拉曼基底。 [0044](6)拉曼光谱的检测
将不同浓度(IO-5 mo I/L-1 O^8 mol/L)的探针分子4-巯基吡啶(4-Mpy)溶液100 PL通入步骤(5)修饰了金银复合纳米颗粒的毛细管整体柱的表面增强拉曼基底，再将毛细管整体柱直立置于拉曼激光下，随机测量10个点的SERS信号。
[0045]实施例2制备的基于修饰了金银复合纳米颗粒的毛细管整体柱的表面增强拉曼基底的拉曼光谱见图4。
[0046]实施例3
一种基于毛细管整体柱的表面增强拉曼基底的制备方法，包括以下步骤:
(I)毛细管的预处理
采用内径为530 Pm、长度为30cm石英毛细管，其余参见实施例1。
[0047](2)整体柱的合成(参见实施例1)。
[0048](3)毛细管整体柱的功能化处理
配制硫化钠-磷酸盐缓冲液:配制0.lmol/L磷酸二氢钠溶液,取8mL于50mL烧杯中，加入2mL甲醇溶液与4.8g硫化钠固体,超声溶解,用5mol/L磷酸溶液调节pH至8,使用中速定性滤纸(最大孔径15~20 PflO过滤备用；
将0.2mL所述硫化钠-磷酸盐缓冲液以0.2mL/h流速通入步骤(2)得到的多孔结构的毛细管整体柱内，使毛细管整体柱的表面具有巯基，然后用去离子水清洗毛细管整体柱至流出液体为中性；
将清洗后的毛细管整体柱切割成3~15cm小段备用。
[0049](4)制备合成反应物并修饰金纳米粒子(SERS基底的制备)
采用化学还原法原位还原合成金纳米粒子:配制0.01g/mL氯金酸溶液、0.0175g/mL朽1檬酸三钠溶液，置于5°C低温下；将氯金酸溶液与柠檬酸三钠溶液以体积比1:1混合后直接通入步骤(3)所得的多孔结构的毛细管整体柱，将所述毛细管整体柱封口后放入90°C水浴中，反应lOmin，得到目标产物一基于修饰了金纳米颗粒的毛细管整体柱的表面增强拉曼基底。
[0050](5)拉曼光谱的检测 将不同浓度(10_5 mo I/L-1O-7 mol/L)的探针分子4-巯基吡啶(4_Mpy)溶液200 PLfflA步骤(5)修饰了金纳米粒子基底的毛细管整体柱内，再用0.1mL甲醇溶液冲洗，用手术刀将毛细管表面的涂层刮除，置于拉曼激光下，随机测量10个点的SERS信号。
[0051]实施例3制备的基于修饰了金纳米颗粒的毛细管整体柱的表面增强拉曼基底的微观形貌见图2 ;拉曼光谱见图5。
【权利要求】
1.一种基于毛细管整体柱的表面增强拉曼基底的制备方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)毛细管的预处理 ①将毛细管依次用稀碱、水、稀酸、去离子水和无水乙醇冲洗，冲洗后用氮气吹干； ②通入硅烷化试剂，将毛细管两端封口在室温下放置24小时； ③洗净后用氮气吹干毛细管以备用； (2)整体柱的合成 在步骤(1)预处理的毛细管内合成聚丙烯酸酯类、聚苯乙烯类和聚丙烯酰胺类整体柱材料，得到有多孔结构的毛细管整体柱； (3)毛细管整体柱的功能化处理 利用功能化溶液对步骤(2)得到的毛细管整体柱进行处理，使毛细管整体柱的表面具有特定的功能基团，对金属纳米粒子具有键合或者吸附能力； 所述特定的功能化基团包括氨基或巯基； (4)制备合成反应物 将硝酸银、氯金酸或者两者混合溶于超纯水中，另取柠檬酸三钠溶液:将硝酸银、氯金酸或者两者混合溶液加热至沸腾，边搅拌边将柠檬酸三钠溶液逐滴缓慢加入，待柠檬酸三钠溶液滴加完成后，继续不断搅拌并保持溶液沸腾状态10分钟，之后停止加热，让溶液自然冷却至室温，得到银溶胶、金溶胶或金银复合溶胶； (5)修饰金属纳米粒子 利用步骤(4)的合成反应物以下面两种方法修饰金属纳米粒子: ①采用化学还原法在步骤(3)功能化处理后的毛细管整体柱内原位合成金属纳米粒子; ②采用化学还原法合成金属纳米粒子，再通入步骤(3)功能化处理后的毛细管整体柱内； (6)拉曼光谱的检测 在步骤(5)修饰了金属纳米粒子基底的毛细管整体柱内引入检测样品进行表面增强拉曼光谱的检测。
2.根据权利要求1所述的基于毛细管整体柱的表面增强拉曼基底的制备方法，其特征在于，步骤(1)使用的毛细管为石英毛细管，内径为530 rtn,长度为I~30cm。
3.根据权利要求1所述的基于毛细管整体柱的表面增强拉曼基底的制备方法，其特征在于，步骤(1)硅烷化试剂为甲基丙烯酸氧丙基三甲氧基硅烷(Y-MAPS)的丙酮溶液。
4.根据权利要求1所述的基于毛细管整体柱的表面增强拉曼基底的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述的功能化溶液包括氨水溶液、乙二胺溶液、硫酸溶液、半胱氨酸溶液或硫化钠-磷酸盐缓冲液。
5.根据权利要求1所述的基于毛细管整体柱的表面增强拉曼基底的制备方法，其特征在于，步骤(3)功能化处理的多孔结构的毛细管整体柱表面具有活性基团，能被改性；改性的范围包括聚丙烯酸酯类、聚苯乙烯类或聚丙烯酰胺类整体柱。
6.根据权利要求1所述的基于毛细管整体柱的表面增强拉曼基底的制备方法，其特征在于，步骤(4)所述的金属纳米粒子包括银纳米粒子、金纳米粒子、金银复合纳米粒子,其粒径为 IOnm ~500nm。
7.根据权利要求1所述的基于毛细管整体柱的表面增强拉曼基底的制备方法，其特征在于，在步骤(5)的拉曼光谱检测中，将毛细管整体柱截成长度为5~200mm的短管基底用于表面增强拉曼检测。
8.根据权利要求7所述的基于毛细管整体柱的表面增强拉曼基底的制备方法，其特征在于，使用所述短管基底进行检测时，进样量在5~2000 I之间，在去除了涂层的检测窗口位置进行表面增强拉曼检测。
9.根据权利要求1所述的基于毛细管整体柱的表面增强拉曼基底的制备方法，其特征在于，步骤(5)所述的检测样品为常用的探针分子或者生物分子。
【文档编号】G01N21/65GK103994991SQ201410214057
【公开日】2014年8月20日 申请日期:2014年5月21日 优先权日:2014年5月21日
【发明者】杜一平, 潘英骋, 汪宣, 张涵, 徐莹 申请人:华东理工大学
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