一种化学发光免疫生物传感器检测装置及检测分析方法
【专利摘要】本发明公开一种化学发光免疫生物传感器检测装置及检测分析方法。该装置包括声能传输与化学发光免疫反应检测装置部分、控制检测部分。声能传输与化学发光免疫反应检测装置部分包括超声换能器、超声耦合胶体、声聚焦透镜阵列一体化玻璃基板、可更换化学发光免疫生物传感基片、聚光透明玻璃、光阑和光透镜、光信号检测电路。控制检测部分包括超声传感器、PID超声能量模式控制�？�、微弱光信号处理�？椤⑹莘治黾胺蠢】刂颇？�、能量控制模式与化学发光免疫反应体系数据库。该方法是调节超声波换能器的辐射能量�。唤形⒘鞫⑸浞治觯苯谐⑸淠芰恐悄懿饪�。本发明提高反应效率，拓展检测灵敏度、精确度、重复性和稳定性。
【专利说明】一种化学发光免疫生物传感器检测装置及检测分析方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物传感器【技术领域】，涉及一种化学发光免疫生物传感器检测装置及检测分析方法，特别是根据超声化学原理、基于微流动注射的化学发光免疫生物传感器检测装置及化学发光免疫分析测定的方法。
【背景技术】
[0002]作为一种免疫分析方法而言，免疫生物传感器由于其选择性好，分析速度快，操作简易，测试仪器具有高性能价格比等特点正大量的应用在医疗健康、食品安全、环境监测等各个领域。在此背景下，如何开发出性能卓越，差异性�。恢滦愿叩纳锎衅饕恢被故茄蟹⒘煊虻墓丶魈狻＝甘昀矗庖叻治黾际踅岷狭丝固�-抗原间的特异性识别反应和电化学、光谱学、声表面波等技术的灵敏和方便等特性，例如对肿瘤标志物、重金属离子、有机毒性物质等目标分析物的高选择性和高灵敏性，成为临床、生物化学、环境分析等各个领域重要的分析手段之一。而相对于放射免疫分析法、酶联免疫分析法、荧光免疫分析法等分析检测方法而言，化学发光检测具有无放射污染、所需仪器简单、检测限低、灵敏度高和宽的动力学范围等优点，能够灵活地和多种不同的传感检测模式相结合进行高质量的检测分析。
[0003]微流动注射分析方法具有操作简便灵活、分析速度快、易于自动化和准确度高等优点。相对于一些常规分析方法操作步骤的繁琐，分析时间较长，样品消耗量大，测定成本高等问题，微流动注射技术与免疫分析和化学发光检测方法相结合而发展起来的微流动注射免疫分析技术已被证明是一种有力的检测分析方法，相对应的分析检测仪器装置也已经被广泛地应用于环境监测、药物分析、食品检验和临床分析的众多关键领域。但是由于常规的免疫反应受限于其对反应条件和反应体系的严格要求，而影响了反应的效率，导致分析时间与分析性能依然成为一个不容忽视的重要问题。如何有效解决这一重要问题，也就是在尽量缩短分析时间的同时保证和提高分析性能的重要问题，成为本发明的重要特征。而针对多种化学发光免疫生物反应体系的特点，从系统整体的角度考虑，将超声化学效应的测控参数与化学发光免疫生物传感器性能参数技术相结合并形成可操作的质控过程信息也是本发明具有广泛适用性的重要关键特征。当前在酶联免疫反应过程中存在超声和高频电磁波两种加速反应方法，相对而言，超声辐射能量与固相免疫生物传感技术相结合能够提高检测分析性能的同时，还能保持检测装置的小型化，为检测装置广泛应用于现场监测提供便利的技术基础。
[0004]免疫生物传感器固相载体上的抗体(抗原)以及催化反应的酶蛋白与被检测液中相应的抗原(抗体)之间存在两相间的能量壁鱼——Nernst层，如何克服这种壁垒限制提高反应效率是一个重要的问题。即使已经跨越这一能量壁垒的抗体/抗原发生有效反应尺度内的碰撞或者结合，也还存在着一定非特异性结合的概率，这种现象会带来背景噪声和干扰，导致检测限、灵敏度和重复一致性等性能的降低。因此如何促进非特异性结合向特异性结合转变，并提高转变的效率，也将是如何提高免疫反应效率的重要问题之一。[0005]根据超声化学的原理，在化学反应中，超声能量带来两个基本效应，一是振荡效应，二是能量扩散效应。根据对免疫反应中所存在问题的分析发现，可以利用超声能量的这些作用促进免疫反应的成分穿越不同相面之间的Nernst层而有效地发生反应。这种作用的效果也已经为许多实验工作所证实。另外，针对抗体/抗原之间的特异性结合力远远大于非特异性的结合力，超声效应也能够加速实现非特异性结合向特异性结合的转变，也就是促进结合蛋白构形的重新选择性排列。通过控制超声能量强度在一定范围内来减少能量扰动对特异性结合的影响，保障其有效特异性结合的转变速率。这些作用的效果在一定程度上通过物理方式促进反应速率，增加特异性免疫反应效率而在系统的水平上提高化学发光免疫生物传感检测的检测低限、灵敏度和重复一致性等性能。
【发明内容】
[0006]免疫生物传感器固相的表面效应会对免疫反应效率存在着重要的影响，同时在免疫传感检测过程中抗体与抗原或者其他酶标记物之间的扩散限制也是其中一个重要的影响因素。它们不但影响着免疫反应中所应体现的检测低限和灵敏度，同时也影响着免疫反应速度，从而限制了化学发光免疫生物反应的检测效率。本发明针对这一重要问题，针对化学发光免疫生物传感检测系统的这些问题，根据超声化学的原理引入了可控的超声能量辐射功能，通过对传感器固相表面区域适度的能量扰动来提高免疫生物传感器敏感膜上免疫反应的速度，获得均匀反应的效果，促进深度免疫反应，提高化学发光免疫生物传感检测的灵敏度和一致重复性。另外，免疫生物传感检测过程中的质量控制也是一个不容忽视的重要问题，而根据超声化学的原理引入的可控的超声能量辐射技术可以成为质控过程的基础技术内容。通过与质控过程紧密结合，可以规范地获得必要的测控参数与性能参数而形成关系信息数据库。这一信息数据库是构成整个可控超声能量辐射化学发光免疫生物传感器检测装置系统的关键组成部分。
[0007]本发明的特征是从系统整体水平上出发，将超声能量辐射功能和化学发光免疫生物传感器检测分析相结合，且在系统整体的水平上，结合微流动注射技术，最终形成根据超声化学原理、基于微流控注射的化学发光免疫生物传感器检测装置及化学发光免疫生物反应测定的分析方法，来提高检测分析系统的检测低限、灵敏度和重复一致性等性能指标。并且针对多种化学发光免疫生物反应体系的特点，在系统整体水平上，将超声化学效应的测控参数与化学发光免疫生物传感器技术的性能参数相结合，并形成可操作的质控过程信息以备广泛的应用之需。这些是本发明的重要关键特征。
[0008]本发明的一个目的是针对现有技术的不足，提供一种化学发光免疫生物传感器检测装置。
[0009]本发明装置包括声能传输与化学发光免疫反应检测装置部分、控制检测部分。
[0010]所述的声能传输与化学发光免疫反应检测装置部分从下至上依次包括换能器固定基板111、声能量阻尼衰减片110、超声换能器101、超声耦合胶体102、声聚焦透镜阵列一体化玻璃基板103、可更换化学发光免疫生物传感基片104、硅橡胶密封圈109、聚光透明玻璃107、光阑和光透镜108、光信号检测电路106。
[0011]由声聚焦透镜阵列一体化玻璃基板103、硅橡胶密封圈109、聚光透明玻璃107从下至上依次设置构成流动注射反应池/注射装置； 高频超声换能器101放置在高分子超声耦合胶体102与声能量阻尼衰减片110之间，通过PID超声能量模式控制�？�202来控制高频超声换能器101超声能量的辐射强度。
[0012]超声耦合胶体102由超声耦合剂与高分子薄膜构成；其中高分子薄膜的声阻抗特性与所选超声耦合剂的声阻抗特性相近。
[0013]超声耦合胶体102上表面设有声透镜阵列，用于聚焦超声能量，超声耦合胶体102通过声透镜阵列与声聚焦透镜阵列一体化玻璃基板103紧贴；声透镜的凹球面尺寸由焦距而定，焦距为透镜表面到超声束聚焦的焦点的距离。通过调整声透镜的凹球面尺寸，控制焦点到可更换化学发光免疫生物传感基片104表面的垂直距离为I?2mm。
[0014]声聚焦透镜阵列一体化玻璃基板103开有两个通道作为流体传输的进出口，两通道分别设于超声稱合胶体102的两侧；声聚焦透镜阵列一体化玻璃基板103上表面开有凹槽，从下至上依次放置超声传感器201、可更换化学发光免疫生物传感基片104。该凹槽与两通道构成倒置的U型结构，使得流体从一个通道流向另一个通道。
[0015]在声聚焦透镜阵列一体化玻璃基板103边沿设有硅橡胶密封圈109，用于密封流动注射反应池/注射装置，调节流动注射反应池/注射装置的流动反应室105的高度，并与聚光透明玻璃107形成封闭结构。
[0016]所述的流动注射反应池/注射装置的流动反应室105的高度为I?3_。
[0017]所述的可更换化学发光免疫生物传感基片104是由硅烷化试剂交联戊二醛、壳聚糖等形成载体表面交联基膜，形成基膜，进一步在基膜上固定抗原分子(或抗体分子)和催化酶，其中催化酶用以催化氧化还原反应，产生电活性物质而引起电流变化，常用酶的种类为碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶等。
[0018]所述的聚光透明玻璃107为透光率大于90 %的无机玻璃或者高分子玻璃；在聚光透明玻璃107的下表面刻有透镜状凹槽，用来聚集化学发光的强度。通过调整透镜状凹槽的深度与圆半径尺寸，控制超声传感器201发出光信号透过透镜状凹槽使得焦点在光阑和光透镜108表面。
[0019]在流动注射反应池/注射装置的流动反应室105内设有可更换化学发光免疫生物传感基片104，可更换化学发光免疫生物传感基片104的下表面粘附有超声传感器201，其超声传感器201的材料为聚偏氟乙烯PVDF。
[0020]可更换化学发光免疫生物传感基片104将荧光信号依次透过聚光透明玻璃107与光阑和光透镜108传递给光信号检测电路106,发生光电反应,完成信号的拾取。
[0021]所述的控制检测部分包括超声传感器201、PID超声能量模式控制�？�202、微弱光信号处理�？�203、数据分析及反馈控制�？�204、能量控制模式与化学发光免疫反应体系数据库205。
[0022]PID超声能量模式控制模块202作为控制处理单元，接收超声传感器201的超声能量信号以及能量控制模式与化学发光免疫反应体系数据库205的反馈信号，PID超声能量模式控制�？�202驱动超声换能器101启动工作模式；微弱光信号处理�？�203接收聚光透明玻璃107的采集信号，能量控制模式与化学发光免疫反应体系数据库205通过数据分析及反馈控制�？�204分析处理微弱光信号处理�？�203的信号，然后将识别后的信号传递PID超声能量模式控制�？�202，最终调节超声换能器101的超声发射模式(频率与强度)。[0023]本发明的另一个目的是利用上述的装置进行化学发光免疫生物反应测定的分析方法。
[0024]步骤(I).调节超声波换能器101的辐射能量场
通过超声耦合胶体102上声透镜的凹球面尺寸来调节焦距，使焦点到可更换化学发光免疫生物传感基片104表面的垂直距离为I?2mm。
[0025]所述的超声耦合胶体102上声透镜的凹球面的特征尺寸由超声频率、聚焦的能量大小、高分子金膜电极基板107材料与厚度以及流动注射反应池/注射装置的流动反应室105的特征尺寸等具体参数决定。
[0026]总体的原则是:①调节超声波换能器101强度使流动注射反应池/注射装置的流动反应室105内待测溶液能够产生机械与温度的扰动，促进扩散效应，克服反应的能量壁垒，提高了反应效率；②调节到适当强度，可促进待测溶液中抗体/抗原间的非特异性结合分子分离发生重排，并向特异性结合转变，使得待测溶液反应充分。
[0027]步骤(2).进行微流动注射分析
将待测溶液、载流经一通道恒速注入至流动注射反应池/注射装置的流动反应室105达到二者的混合，最终经另一通道流出。
[0028]在进行微流动注射分析过程中，可更换化学发光免疫生物传感基片104上若固定有抗原分子，则使得待测溶液中的相应抗体发生特异性结合反应。
[0029]所述的流动注射反应池/注射装置的流动反应室105通过光刻或蚀刻的方法实现了反应池的微型化。
[0030]步骤(3).超声发射能量智能测控过程
在进行步骤(2)的过程中，本发明同时进行超声发射能量智能测控。所述的智能控制过程包括两条反馈信号通路，分别是超声能量的反馈信号通路、检测反馈通路。
[0031]所述的超声能量的反馈信号由超声传感器201来检测超声辐射能量的强度，其与超声换能器101以及PID超声能量模式控制�？�202构成一条闭环测控系统。
[0032]PID超声能量模式控制�？�202接收超声传感器201的超声能量信号，PID超声能量模式控制�？�202驱动超声换能器101启动工作模式。
[0033]所述的检测反馈通路是由PID超声能量模式控制�？�202、微弱电信号处理检测�？�203、数据分析及反馈控制�？�204、能量控制模式与化学发光免疫反应体系数据库205构成闭环测控系统。
[0034]微弱电信号处理检测�？�203处理光信号检测电路106获得的电化学信号，通过超声能量模式控制�？�202调节超声换能器101的辐射能量来确定较优的免疫反应效果，数据分析及反馈控制模块204将对不同免疫反应体系的参数集合进行整合，形成能量控制模式与化学发光免疫反应体系数据库205，这些数据库的内容将为不同免疫检测分析体系的应用提供必要的PID控制参数。进一步地，利用标准质控免疫反应溶液和超声传感器201所测量的超声能量反馈参数，来获得超声福射能量的控制参数对电化学免疫反应的动态效果，通过对反应效果参数与超声能量控制参数之间动力学数据进行拟合，获得用于控制的优化参数，这些优化参数与PID控制参数进行信息融合，获得待测溶液中目标抗体或抗原的浓度。
[0035]所述的智能测控方法依据事先得到的标准免疫化学反应强度的特征动力学曲线，获得超声辐射能量的控制参数，控制化学免疫反应。
[0036]本发明的有益效果是:
本发明装置及应用方法利用超声化学的原理以及超声能量所产生的微空化搅拌效用结合特异性免疫反应和微流动注射化学发光分析的技术，极大的发展了硅烷化交联戊二醛(壳聚糖)基膜固定抗原的典型微流动注射化学发光免疫分析技术，并制备了免疫生物传感检测系统。该方法较现有典型技术方法具有以下优点:
加快了反应样品以及实际反应进程，极大地缩短了反应时间，提高检测效率，非常适合于临床、环境监测、食品安全等多个领域的在线快速检测应用。
[0037]A)优越的一致重现性。样品与敏感物质的反应的各个阶段由于超声能量聚焦在反应面附近产生的微搅拌和反应能量传递效应，使得反应界面的均匀化得到了较大提升，较好地保证了一致重现性。
[0038]B)利用戊二醛、壳聚糖等典型的高分子材料固定抗原、抗体分子，成本低，技术成熟。
[0039]C)该传感器表现出优越的检测灵敏度(低限)、精确性、重复性和稳定性，制备方法成熟简单，有利于发展成极具市场实际应用价值的产品进行推广。
[0040]本发明利用超声化学的原理以及超声能量所产生的微搅拌效用结合特异性免疫反应和微流动注射化 学发光分析的技术，提高了反应效率，拓展了检测灵敏度、精确度、重复性和稳定性，简化了分析过程，缩短了总体检测所需时间，减少了试剂消耗，进一步降低了检测成本，提高了检测效率和性能，有利于高性能价格比地实现临床分析，食品安全，环境监测等多个领域中的在线快速分析。
【专利附图】
【附图说明】
[0041]图1为本发明装置的结构示意图；
图2为本发明装置的截面部分结构示意图。
【具体实施方式】
[0042]下面结合附图对本发明做进一步的分析。
[0043]实施例1.如图1、图2所示，本发明装置包括声能传输与化学发光免疫反应检测装置部分、控制检测部分。
[0044]所述的声能传输与化学发光免疫反应检测装置部分从下至上依次包括换能器固定基板111、声能量阻尼衰减片110、超声换能器101、超声耦合胶体102、声聚焦透镜阵列一体化玻璃基板103、可更换化学发光免疫生物传感基片104、硅橡胶密封圈109、聚光透明玻璃107、光阑和光透镜108、光信号检测电路106。
[0045]由声聚焦透镜阵列一体化玻璃基板103、硅橡胶密封圈109、聚光透明玻璃107从下至上依次设置构成流动注射反应池/注射装置；
高频超声换能器101放置在高分子超声耦合胶体102与声能量阻尼衰减片110之间，通过PID超声能量模式控制模块202来控制高频超声换能器101超声能量的辐射强度。
[0046]超声耦合胶体102由超声耦合剂与高分子薄膜构成；其中高分子薄膜的声阻抗特性与所选超声耦合剂的声阻抗特性相近。[0047]超声耦合胶体102上表面设有声透镜阵列，用于聚焦超声能量，超声耦合胶体102通过声透镜阵列与声聚焦透镜阵列一体化玻璃基板103紧贴；声透镜的凹球面尺寸由焦距而定，焦距为透镜表面到超声束聚焦的焦点的距离。通过调整声透镜的凹球面尺寸，控制焦点到可更换化学发光免疫生物传感基片104表面的垂直距离为I?2mm。
[0048]声聚焦透镜阵列一体化玻璃基板103(50mmX40X IOmm)开有两个通道作为流体传输的进出口，两通道分别设于超声耦合胶体102的两侧；声聚焦透镜阵列一体化玻璃基板103上表面开有凹槽(20_X10_X2mm)，长度和宽度公差为±1_，高度公差为±0.5mm,从下至上依次放置超声传感器201、可更换化学发光免疫生物传感基片104。该凹槽与两通道构成倒置的U型结构，使得流体从一个通道流向另一个通道。
[0049]在声聚焦透镜阵列一体化玻璃基板103边沿设有硅橡胶密封圈109，用于密封流动注射反应池/注射装置，调节流动注射反应池/注射装置的流动反应室105的高度，并与聚光透明玻璃107形成封闭结构。
[0050]所述的流动注射反应池/注射装置的流动反应室105的高度为I?3mm。
[0051]所述的可更换化学发光免疫生物传感基片104是由硅烷化试剂交联戊二醛、壳聚糖等形成载体表面交联基膜，形成基膜，进一步在基膜上固定抗原分子(或抗体分子)和催化酶，其中催化酶用以催化氧化还原反应，产生电活性物质而引起电流变化，常用酶的种类为碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶等。
[0052]所述的聚光透明玻璃107为透光率大于90 %的无机玻璃或者高分子玻璃；在聚光透明玻璃107的下表面刻有透镜状凹槽，用来聚集化学发光的强度。通过调整透镜状凹槽的深度与圆半径尺寸，控制超声传感器201发出光信号透过透镜状凹槽使得焦点在光阑和光透镜108表面。
[0053]在流动注射反应池/注射装置的流动反应室105内设有可更换化学发光免疫生物传感基片104，可更换化学发光免疫生物传感基片104的下表面粘附有超声传感器201，其超声传感器201的材料为聚偏氟乙烯PVDF。
[0054]可更换化学发光免疫生物传感基片104将荧光信号依次透过聚光透明玻璃107与光阑和光透镜108传递给光信号检测电路106,发生光电反应,完成信号的拾取。
[0055]所述的控制检测部分包括超声传感器201、PID超声能量模式控制�？�202、微弱光信号处理�？�203、数据分析及反馈控制�？�204、能量控制模式与化学发光免疫反应体系数据库205。
[0056]PID超声能量模式控制�？�202作为控制处理单元，接收超声传感器201的超声能量信号以及能量控制模式与化学发光免疫反应体系数据库205的反馈信号，PID超声能量模式控制�？�202驱动超声换能器101启动工作模式；微弱光信号处理�？�203接收聚光透明玻璃107的采集信号，能量控制模式与化学发光免疫反应体系数据库205通过数据分析及反馈控制�？�204分析处理微弱光信号处理�？�203的信号，然后将识别后的信号传递PID超声能量模式控制�？�202，最终调节超声换能器101的超声发射模式(频率与强度)。
[0057]实施例2.利用上述的装置进行化学发光免疫生物反应测定的分析方法。
[0058]步骤(I).调节超声波换能器101的辐射能量场
通过超声耦合胶体102上声透镜的凹球面尺寸来调节焦距，使焦点到可更换化学发光免疫生物传感基片104表面的垂直距离为I~2mm。
[0059]所述的超声耦合胶体102上声透镜的凹球面的特征尺寸由超声频率、聚焦的能量大小、高分子金膜电极基板107材料与厚度以及流动注射反应池/注射装置的流动反应室105的特征尺寸等具体参数决定。
[0060]总体的原则是:①调节超声波换能器101强度使流动注射反应池/注射装置的流动反应室105内待测溶液能够产生机械与温度的扰动，促进扩散效应，克服反应的能量壁垒，提高了反应效率；②调节到适当强度，可促进待测溶液中抗体/抗原间的非特异性结合分子分离发生重排，并向特异性结合转变，使得待测溶液反应充分。
[0061]步骤(2).进行微流动注射分析
将待测溶液、载流经一通道恒速注入至流动注射反应池/注射装置的流动反应室105达到二者的混合，最终经另一通道流出。
[0062]在进行微流动注射分析过程中，可更换化学发光免疫生物传感基片104上若固定有抗原分子，则使得待测溶液中的相应抗体发生特异性结合反应；。
[0063]所述的流动注射反应池/注射装置的流动反应室105通过光刻或蚀刻的方法实现了反应池的微型化。
[0064]步骤(3).超声发射能量智能测控过程
在进行步骤(2)的过程中，本发明同时进行超声发射能量智能测控。所述的智能控制过程包括两条反馈信号通路，分别是超声能量的反馈信号通路、检测反馈通路。
`[0065]所述的超声能量的反馈信号由超声传感器201来检测超声辐射能量的强度，其与超声换能器101以及PID超声能量模式控制�？�202构成一条闭环测控系统。
[0066]PID超声能量模式控制�？�202接收超声传感器201的超声能量信号，PID超声能量模式控制模块202驱动超声换能器101启动工作模式。
[0067]所述的检测反馈通路是由PID超声能量模式控制�？�202、微弱电信号处理检测�？�203、数据分析及反馈控制模块204、能量控制模式与化学发光免疫反应体系数据库205构成闭环测控系统。
[0068]微弱电信号处理检测�？�203处理光信号检测电路106获得的电化学信号，通过超声能量模式控制�？�202调节超声换能器101的辐射能量来确定较优的免疫反应效果，数据分析及反馈控制�？�204将对不同免疫反应体系的参数集合进行整合，形成能量控制模式与化学发光免疫反应体系数据库205，这些数据库的内容将为不同免疫检测分析体系的应用提供必要的PID控制参数。进一步地，利用标准质控免疫反应溶液和超声传感器201所测量的超声能量反馈参数，来获得超声福射能量的控制参数对电化学免疫反应的动态效果，通过对反应效果参数与超声能量控制参数之间动力学数据进行拟合，获得用于控制的优化参数，这些优化参数与PID控制参数进行信息融合，获得待测溶液中目标抗体或抗原的浓度。
[0069]所述的智能测控方法依据事先得到的标准免疫化学反应强度的特征动力学曲线，获得超声辐射能量的控制参数，控制化学免疫反应。
[0070]实施例3.可更换化学发光免疫生物传感基片104的制备
免疫传感器的制备可以分为两种方式:在线制备和离线制备。本发明采离线制备，在线制备方式为另外一个专利的内容。[0071](I)将待测抗原溶解于缓冲溶液，所选择的缓冲溶液因抗原种类而异，标准是使免疫反应的活性和化学发光信号响应达到最大，如何判断可以通过标准通道的比对进行判断。
[0072](2)对玻片载体表面进行预处理得到平整，干净，亲水性的表面。
[0073](3)配置一定浓度环氧丙烷基三甲基硅烷溶液，放置60分钟使其充分水解，然后移取50微升溶液滴于载体表面，在93°C下加热60分钟。滴40微升1%壳聚糖醋酸溶液于环氧丙烷基三甲基硅烷处理过的玻片上，再置于烘箱中以100°C的沸水条件下加热50分钟，得到硅烷交联戊二醛(壳聚糖)基膜。
[0074](4)将40微升抗原溶液滴于硅烷交联戊二醛(壳聚糖)基膜上，在4°C冰箱中缓慢挥发8小时。
[0075](5)用40微升牛血清白蛋白溶液滴于(4)步骤所得基膜上，封闭活性点，得到免疫功能膜。
[0076]( 6 )将上述免疫功能膜置于化学发光流动池的嵌入槽内构成免疫生物分析检测装置。
[0077](7)影响所获得免疫生物功能基膜和免疫传感器性能的主要因素存在三个方面:Ca)足够的时间和适宜的温度使环氧丙烷基三甲基硅烷充分水解反应；(b)免疫生物传感器的制备受到交联戊二醛(壳聚糖)表面形貌结构的影响，这主要取决于制备过程中环氧丙烷基三甲基硅烷和戊二醛(壳聚糖)的用量，只有用量配比合适，才能获得规则、均匀、一致性好、呈现网孔状结构的交联基膜，从而制备出稳定性高，性能好的免疫功能膜；(C)缓冲溶液的PH值:只有在一定酸度下，抗原才具有最佳活性。如果酸度偏离这一数值，将影响免疫功能基膜和传感器的性能。
[0078]实施例4.待测抗原的测定:(1)免疫测定的优化条件是保证抗体、抗原和标记酶的有效活性，以及化学发光实际的活性条件。(2)在最佳测定条件下，将不同浓度抗原的标准溶液或样品盒与定量的酶标记抗体溶液在温育后，超声强度通过质控确定控制曲线。然后通过(微)流动注射装置注入到流动注射反应池/注射装置的流动反应室105中，前期超声温育免疫反应中未被结合的游离酶标抗体被传感器(可更换化学发光免疫生物传感基片104)中固定的抗原/抗体捕获，免疫结合物则基本上被带出流动反应室105。按照标准的(微)流动注射方式注入化学发光底物注到传感器(可更换化学发光免疫生物传感基片104)，已被捕获的酶标抗体对化学发光体系进行催化反应获得发光信号，根据质控过程中测定的标准曲线进行分析识别，通过多参数信息融合的方式获得样品中抗原浓度。
[0079]实施例5.质控测试实验的优化免疫反应测定条件的应该包括以下三个方面: 反应溶液中酶标抗体的量:如果采用非竞争免疫分析方法，即将待测抗原和固定量酶
标记抗体的反应溶液在线温育和超声搅拌传递能量，免疫反应结束后通过固定在免疫传感器(可更换化学发光免疫生物传感基片104)上的抗原来分离结合的和游离的酶标空提，由固定在免疫传感器(可更换化学发光免疫生物传感基片104)上的抗原捕获的酶标抗体催化化学发光反应，从而产生信号降低来间接测定待测抗原的量。反应溶液中酶标抗体的量的优化获得最大检测范围且最灵敏为标准。如果酶标抗体的量小于该值，会使检测范围缩小；如果酶标抗体的量大于该值，会使背景信号增大，测定结果偏小。
[0080]温育后免疫复合物流过免疫传感器(可更换化学发光免疫生物传感基片104)的流动速度超声强度:按道理免疫复合物在传感器(可更换化学发光免疫生物传感基片104)滞留的时间越长，即流速越慢，则固定在免疫传感器(可更换化学发光免疫生物传感基片104)上的抗原捕获的游离酶标抗体的量越多；反之则游离酶标抗体的捕获量就少；在一定的条件下前者分离效果相对较好，而后者分离的效果就差一些。但是在这两种情形下，都会存在一定得非特异吸附。非特异性吸附可能导致噪声提高，影响到传感器(可更换化学发光免疫生物传感基片104)的灵敏度和准确性。另外考虑到超声一方面可以加速抗体/抗原的反应进程另一方面可以减少非特异性吸附导致的本底噪声，超声的存在可以较大的改善检测性能，提高检测效率。但是超声强度的不合适配置也可能导致负面因素的出现，这就是当强度过大后会导致抗体/抗原失活以及传感器(可更换化学发光免疫生物传感基片104)表面的敏感膜出现脱落的问题从而严重影响性能。在本发明的设计中由于采用了超声聚焦透镜，可以大大减少超声能量强度对敏感膜的影响，同时保证超声聚焦区内足够的能量配置，易于改善超声免疫反应的速度和充分性，进一步提高和改善免疫检测性能。化学的反应水平。兼顾到临床上快速检测的需求，超声温育后免疫复合物流过免疫传感器的流速对结合的和游离的酶标抗体分离效果的影响进行了优化。
[0081]实施例6.应用实例:检测过程是首先将待测样品与稍微过量的HRP标记抗体离线温育，而后将此免疫混合物通入流动注射反应池/注射装置的流动反应室105，前一步温育中未结合的酶标抗体被免疫传感器(可更换化学发光免疫生物传感基片104)中固定的抗原捕获，而待测抗原-酶标抗体免疫复合物则被冲洗出来。基于捕获的酶标抗体对鲁米诺-H202化学发光反应的催化作用进行化学发光检测。典型的酶标抗体为辣根过氧化物酶T 己 O
【权利要求】
1.一种化学发光免疫生物传感器检测装置，其特征在于包括声能传输与化学发光免疫反应检测装置部分、控制检测部分； 所述的声能传输与化学发光免疫反应检测装置部分从下至上依次包括换能器固定基板111、声能量阻尼衰减片110、超声换能器101、超声耦合胶体102、声聚焦透镜阵列一体化玻璃基板103、可更换化学发光免疫生物传感基片104、硅橡胶密封圈109、聚光透明玻璃107、光阑和光透镜108、光信号检测电路106 ； 由声聚焦透镜阵列一体化玻璃基板103、硅橡胶密封圈109、聚光透明玻璃107从下至上依次设置构成流动注射反应池/注射装置； 高频超声换能器101放置在高分子超声耦合胶体102与声能量阻尼衰减片110之间，通过PID超声能量模式控制模块202来控制高频超声换能器101超声能量的辐射强度；超声耦合胶体102由超声耦合剂与高分子薄膜构成；其中高分子薄膜的声阻抗特性与所选超声耦合剂的声阻抗特性相近； 超声耦合胶体102上表面设有声透镜阵列，用于聚焦超声能量，超声耦合胶体102通过声透镜阵列与声聚焦透镜阵列一体化玻璃基板103紧贴；声透镜的凹球面尺寸由焦距而定，焦距为透镜表面到超声束聚焦的焦点的距离；通过调整声透镜的凹球面尺寸，控制焦点到可更换化学发光免疫生物传感基片104表面的垂直距离为I~2mm ; 声聚焦透镜阵列一体化玻璃基板103开有两个通道作为流体传输的进出口，两通道分别设于超声稱合胶体102的两侧；声聚焦透镜阵列一体化玻璃基板103上表面开有凹槽,从下至上依次放置超声传感器201、可更换化学发光免疫生物传感基片104 ;该凹槽与两通道构成倒置的U型结构，使得流体从一个通道流向另一个通道； 在声聚焦透镜阵列一体化玻璃基板103边沿设有硅橡胶密封圈109，用于密封流动注射反应池/注射装置，调节流动注射反应池/注射装置的流动反应室105的高度，并与聚光透明玻璃107形成封闭结构； 所述的流动注射反应池/注射装置的流动反应室105的高度为I~3_ ; 所述的可更换化学发光免疫生物传感基片104是由硅烷化试剂交联戊二醛、壳聚糖形成载体表面交联基膜，形成基膜，进一步在基膜上固定抗原分子或抗体分子和催化酶，其中催化酶用以催化氧化还原反应，产生电活性物质而引起电流变化； 所述的聚光透明玻璃107为透光率大于90 %的无机玻璃或者高分子玻璃；在聚光透明玻璃107的下表面刻有透镜状凹槽，用来聚集化学发光的强度；通过调整透镜状凹槽的深度与圆半径尺寸，控制超声传感器201发出光信号透过透镜状凹槽使得焦点在光阑和光透镜108表面； 在流动注射反应池/注射装置的流动反应室105内设有可更换化学发光免疫生物传感基片104，可更换化学发光免疫生物传感基片104的下表面粘附有超声传感器201，其超声传感器201的材料为聚偏氟乙烯PVDF ； 可更换化学发光免疫生物传感基片104将荧光信号依次透过聚光透明玻璃107与光阑和光透镜108传递给光信号检测电路106,发生光电反应,完成信号的拾�。� 所述的控制检测部分包括超声传感器201、PID超声能量模式控制�？�202、微弱光信号处理�？�203、数据分析及反馈控制�？�204、能量控制模式与化学发光免疫反应体系数据库205 ；PID超声能量模式控制�？�202作为控制处理单元，接收超声传感器201的超声能量信号以及能量控制模式与化学发光免疫反应体系数据库205的反馈信号，PID超声能量模式控制模块202驱动超声换能器101启动工作模式；微弱光信号处理模块203接收聚光透明玻璃107的采集信号，能量控制模式与化学发光免疫反应体系数据库205通过数据分析及反馈控制�？�204分析处理微弱光信号处理�？�203的信号，然后将识别后的信号传递PID超声能量模式控制�？�202，最终调节超声换能器101的超声发射模式。
2.利用如权利要求1所述的一种化学发光免疫生物传感器检测装置进行化学发光免疫生物反应测定的分析方法，其特征在于该方法包括以下步骤: 步骤(1).调节超声波换能器101的辐射能量场: 通过超声耦合胶体102上声透镜的凹球面尺寸来调节焦距，使焦点到可更换化学发光免疫生物传感基片104表面的垂直距离为I~2mm ; 步骤(2).进行微流动注射分析: 将待测溶液、载流经一通道恒速注入至流动注射反应池/注射装置的流动反应室105达到二者的混合，最终经另一通道流出； 在进行微流动注射分析过程中，可更换化学发光免疫生物传感基片104上若固定有抗原分子，则使得待测溶液中的相应抗体发生特异性结合反应； 所述的流动注射反应池/注射装置的流动反应室105通过光刻或蚀刻的方法实现了反应池的微型化； 步骤(3).超声发射能`量智能测控过程: 在进行步骤(2)的过程中，同时进行超声发射能量智能测控；所述的智能控制过程包括两条反馈信号通路，分别是超声能量的反馈信号通路、检测反馈通路； 所述的超声能量的反馈信号由超声传感器201来检测超声辐射能量的强度，其与超声换能器101以及PID超声能量模式控制模块202构成一条闭环测控系统； PID超声能量模式控制�？�202接收超声传感器201的超声能量信号，PID超声能量模式控制模块202驱动超声换能器101启动工作模式； 所述的检测反馈通路是由PID超声能量模式控制�？�202、微弱电信号处理检测模块`203、数据分析及反馈控制�？�204、能量控制模式与化学发光免疫反应体系数据库205构成闭环测控系统； 微弱电信号处理检测�？�203处理光信号检测电路106获得的电化学信号，通过超声能量模式控制模块202调节超声换能器101的辐射能量来确定较优的免疫反应效果，数据分析及反馈控制�？�204将对不同免疫反应体系的参数集合进行整合，形成能量控制模式与化学发光免疫反应体系数据库205，这些数据库的内容将为不同免疫检测分析体系的应用提供必要的PID控制参数；进一步地，利用标准质控免疫反应溶液和超声传感器201所测量的超声能量反馈参数，来获得超声福射能量的控制参数对电化学免疫反应的动态效果，通过对反应效果参数与超声能量控制参数之间动力学数据进行拟合，获得用于控制的优化参数，这些优化参数与PID控制参数进行信息融合,获得待测溶液中目标抗体或抗原的浓度。
【文档编号】G01N21/76GK103604921SQ201310542576
【公开日】2014年2月26日 申请日期:2013年11月5日 优先权日:2013年11月5日
【发明者】刘军, 邹倩, 谢斐, 周雅琪 申请人:浙江大学
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