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制备抗Lp（a）多克隆抗血清的方法及多克隆抗血清的制作方法
【专利摘要】本申请公开了一种制备高特异性的抗Lp（a）多克隆抗血清的方法，该方法包括采用Seq?ID?No.1所示序列的抗原通过动物免疫制备获得抗Lp（a）多克隆抗血清。本申请的制备高特异性的抗Lp（a）多克隆抗血清的方法克服了传统方法的血浆来源困难、社会供给不足的问题；并且，所制备的抗Lp（a）多克隆抗血清效价高，特异性强，不会与LDL或PLG发生交叉反应，从而提高了Lp(a)检测的准确性和有效性，为Lp(a)检测的推广应用奠定了基础。
【专利说明】制备抗Lp (a)多克隆抗血清的方法及多克隆抗血清

【技术领域】
[0001] 本申请涉及免疫检测领域，特别是涉及一种制备高特异性的抗Lp (a)多克隆抗血 清的方法，以及有该方法制备的抗Lp (a)多克隆抗血清。

【背景技术】
[0002] 血浆脂蛋白按密度分为四大类：乳糜微粒（缩写，CM)、极低密度脂蛋白（缩写， VLDL)、低密度脂蛋白（缩写，LDL)和高密度脂蛋白（缩写，HDL)。同时，在血浆中还存在一 类特殊的脂蛋白：脂蛋白（a)(缩写，Lp(a))，它是一个独立的脂蛋白系统。Lp(a)的脂质成 分与LDL相似，主要由胆固醇脂和甘油三酯组成，表面被覆一层磷脂和游离胆固醇，甘油三 酯的组份大于LDL，Lp(a)与LDL均是胆固醇转移蛋白的底物。Lp(a)含有两类载脂蛋白： ΑροΒΙΟΟ和Apo (a)，前者与LDL的ΑροΒΙΟΟ相同，ΑροΒΙΟΟ上有LDL受体结合位点；后者是 Lp (a)的独特载脂蛋白，ΑροΒ 100和Apo (a)通过1至2个二硫键共价相连。
[0003] 从Apo (a)的N-末端到C-末端，所有的Kringle域通过两两之间的大约30个氨 基酸的中间序列依次相连。除最靠近C端的Kringle域与纤溶酶原中的Kringle5同源外， 其余Kringle域均与纤溶酶原中的Kringle4同源，并依次被命名为Kringle IV 1?10型； 需要说明的是，人类Apo (a)与人纤维蛋白溶酶原（英文名，Plasminogen.缩写，PLG)在DNA 和蛋白质水平均存在80%的同源性，从而具有共同的抗原决定簇，呈免疫交叉反应。在所有 这10型的Kringle IV中，不同个体的Kringle IV 2型的串联重复数一般在3?43之间变 化，因此Apo (a)的分子量也就在250?838kD的范围中变化，其体积与分子量在相同的个 体内或不同的个体间都具有较大的差异，因其这种特性，决定了 Lp(a)在不同的个体间具 有较大的差异。Kringle IV 9型中有7个半胱氨酸，其中未参与分子内二硫键的第4057位 半胱氨酸（缩写，Cys4057)与载脂蛋白B-100中的第4326位半胱氨酸（缩写，Cys4326)形 成分子间二硫键，进而组成完整的Lp (a)。
[0004] Lp(a)是动脉粥样硬化的独立危险因素，是冠心病（CHD)、心肌梗塞（MI)、脑卒中、 动脉重新狭窄的危险因子。另外，Lp (a)水平可作为慢性肾功能衰竭合并心脑血管病及血栓 形成的预示指标。Lp(a)的血清水平受遗传因素的高度影响，个体差异很大，主要由Apo(a) 基因决定，因种族而异，与性别、年龄无关，不易受环境，生活方式和一般降脂药物的干扰， 仅能够被肾衰、急性免疫反应轻微影响。一般把人血清Lp (a)正常值定为<300mg/L。因此， Lp (a)的检测对临床分析和病理分析具有重要的参考价值。
[0005] 目前，已知的检测Lp (a)浓度的方法有酶联免疫法、放射免疫法、荧光免疫测定法 和免疫比浊法，以上免疫检测方法均需要特异性强的Lp(a)抗血清/抗体作为核心原料。目 前基本上都是采用提纯人血清的方法制备免疫原Lp (a)或Apo (a)，即利用超高速离心机通 过密度梯度离心制取Lp (a)，或者利用SDS-PAGE电泳分离获得Apo (a)抗原；再利用抗原免 疫动物获得抗血清。如前面分析，因为Lp (a)含有两类载脂蛋白：ΑροΒΙΟΟ和Apo (a)，其中 ΑροΒΙΟΟ与LDL的ΑροΒΙΟΟ相同，所以利用Lp (a)作为免疫原制备的抗血清会与LDL存在免 疫交叉反应。而利用Apo (a)作为免疫原，因Apo (a)的氨基酸结构与PLG很相似，而PLG是 一种以较高浓度存在于人血液中的蛋白质，因此，利用Apo (a)作为免疫原制得的抗血清会 因与PLG发生交叉反应。因此，无论是Lp (a)还是Apo (a)作为抗原制备的抗血清都无法准 确地测定Lp (a)含量。并且，采用提纯人血清的方法制备免疫原Lp (a)或Apo (a)所需血浆 来源困难、社会供给不足；制备的抗血清不仅会与LDL或PLG有交叉反应，特异性较差；而 且，抗血清的效价也不高。


【发明内容】

[0006] 本申请的目的是提供一种制备抗Lp (a)多克隆抗血清的方法，以及由该方法制备 的抗Lp (a)多克隆抗血清。
[0007] 为了实现以上目的，本申请的一方面公开了一种制备高特异性的抗Lp (a)多克隆 抗血清的方法，该方法包括采用Seq ID No. 1所示序列的抗原通过动物免疫制备获得所述抗 Lp (a)多克隆抗血清。
[0008] 优选的，动物免疫包括选择青壮年时期并对Apo(a)易感的山羊或兔子，以浓度为 l-5mg/mL的Seq ID No. 1所示序列的抗原进行多点多次免疫，直至抗体效价达到预期值后， 颈动脉放血提取纯化本申请的抗Lp (a)多克隆抗血清。
[0009] 优选的，Seq ID No. 1所不序列的抗原为提纯的克隆表达的融合蛋白；克隆表达具 体包括采用Seq ID No. 2所示序列的DNA片段为插入片段构建质粒，将构建的质粒进行转化 和融合蛋白表达，然后提纯获得Seq ID No. 1所不序列的抗原。
[0010] 进一步的，Seq ID No. 2所示序列的DNA片段为PCR扩增的产物，PCR扩增具体包括 采用Seq ID No. 3所示序列和Seq ID No. 4所示序列的引物，以LPA基因为模板进行PCR扩 增。
[0011] 本申请的另一面还公开了本申请的制备方法制备的抗Lp (a)多克隆抗血清。
[0012] 本申请的再一面还公开了一种制备高特异性的抗Lp (a)多克隆抗血清的抗原，该 抗原含有Seq ID No. 1所不序列；并且，该抗原为提纯的克隆表达的融合蛋白；其中，克隆表 达具体包括采用Seq ID No. 2所示序列的DNA片段为插入片段构建质粒，将构建的质粒进行 转化和融合蛋白表达，然后提纯获得抗原。
[0013] 优选的，Seq ID No. 2所示序列的DNA片段为PCR扩增的产物，PCR扩增具体包括 采用Seq ID No. 3所示序列和Seq ID No. 4所示序列的引物，以LPA基因为模板进行PCR扩 增。
[0014] 本申请的再一面还公开了本申请的抗Lp (a)多克隆抗血清，和本申请的抗原在 Lp (a)检测中的应用。
[0015] 本申请的再一面还公开了一种检测Lp(a)浓度的方法，该述方法包括采用本申请 的抗Lp (a)多克隆抗血清，进行酶联免疫法、放射免疫法、荧光免疫测定法和免疫比浊法中 的至少一种。
[0016] 本申请的再一面还公开了一种用于Lp (a)检测的试剂盒，该试剂盒中含有本申请 的抗Lp (a)多克隆抗血清。
[0017] 由于采用以上技术方案，本申请的有益效果在于：
[0018] 本申请的制备高特异性的抗Lp (a)多克隆抗血清的方法克服了传统方法的血浆 来源困难、社会供给不足的问题；并且，所制备的抗Lp (a)多克隆抗血清效价高，特异性强， 不会与LDL或PLG发生交叉反应，从而提高了 Lp (a)检测的准确性和有效性，为Lp (a)检测 的推广应用奠定了基础。

【专利附图】

【附图说明】
[0019] 图1 :是本申请实施例中克隆片段的PCR扩增结果图，其中Μ为marker，l和2为 PCR扩增产物样品；
[0020] 图2 :是本申请实施例中收集的融合蛋白的SDS-PAGE检测结果图，其中marker为 蛋白质分子量标，apo (a)为受检样品；
[0021] 图3 :是本申请实施例中收集的融合蛋白的WESTERN-BLOT分析结果图，其中 marker为蛋白质分子量标，apo (a)为受检样品；
[0022] 图4 :是本申请实施例中融合蛋白纯化后再次进行SDS-PAGE检测的结果图，其中A 为电泳结果图，B为基于电泳结果的数值分析图。

【具体实施方式】
[0023] 本申请采用的抗原针对性的制备出了仅能与Lp (a)进行免疫反应的抗Lp (a)多 克隆抗血清，该抗Lp (a)多克隆抗血清不会与LDL和PLG存在免疫交叉反应。只要采用本 申请的抗原即可获得本申请的特异性强的效果，可以理解，抗原的获取方法有很多种，而本 申请的一种优选方案是，克隆表达融合蛋白，提取所需抗原，这种方法获得的抗原纯度高， 针对性强。而获得克隆表达融合蛋白的方法是将外源片段插入到载体中进行转化表达，可 以理解，外源插入片段同样可以采用化学合成或者直接从基因组中提取或者采用PCR扩增 获得，本申请的优选方案中，采用PCR扩增获得外源插入片段；为此，本申请还特别设计了 特异性的引物。
[0024] 本申请中，在动物免疫时采用多点多次免疫，使抗体效价达到预期值后再提取纯 化，从而使得制备的抗Lp (a)多克隆抗血清效价高，能够很好的满足使用要求。其中，多点 多次免疫是指，分多次对免疫动物的背部、颈部、腋窝皮下结合皮内进行多点注射；抗体效 价达到预期值是指根据实验设计，预期达到的效价，这是根据实验材料和实验目的设定的， 在此不作具体限定，比如期望制备出更高效价的抗Lp (a)多克隆抗血清，则抗体效价预期 值可以高些，对免疫动物多进行几次注射，不过，需要注意的是效价并不是无限次增加的。
[0025] 本申请的一个关键在于采用克隆表达方法获得高效、准确的抗原，从而制备出高 特异性的抗血清。为了使用方便，本申请进一步的，将本申请的高特异性的抗Lp (a)多克 隆抗血清制备成便于保存的固体或高浓度溶液，从而制备成试剂盒以方便Lp (a)免疫检测 使用。
[0026] 需要说明的是，虽然克隆表达的原理是已知的，并且，克隆表达制备抗原在多克隆 抗体制备中的应用也是蛋白免疫检测领域比较常用的；但是，目前并没有采用克隆表达方 法制备抗Lp (a)多克隆抗血清的研究，至少，这方面的研究不甚理想；正是如此，本申请为 了填补该漏洞，通过对Lp (a)蛋白基因进行研究，创造性的基于LPA基因设计了特异性引 物，通过该特异性引物构建可用于制备抗Lp (a)多克隆抗血清制备的质粒，从而制备出特 异性强、效价高的抗Lp (a)多克隆抗血清。
[0027] 本申请的一个关键点在于所选择的克隆片段以及特异性的引物序列，可以理解， 对于本申请的用于制备抗Lp (a)多克隆抗血清的质粒来说，插入片段是其重点，因此，理论 上实验室常规使用的原核表达载体，比如PET系列载体、pGEM-T系列载体等都适用于本申 请；本申请的优选实施方案中选择的是pet28a+。
[0028] 另外，在进行转化、表达的过程中，同样，目前实验室常规使用的原核表达细胞，如 大肠杆菌、凝结芽孢杆菌、枯草芽胞杆菌和链霉菌等都适用于本申请，其中，大肠杆菌中常 规使用的HB101，BL21，JM109和DH5a等也可以用于本申请的融合蛋白表达。当然，原核 表达细胞的选择要和选择的载体相符。另外，可以理解，除了可以采用原核表达细胞体系以 夕卜，实验室常规使用的真核细胞表达体系同样适用于本申请，比如酿酒酵母、毕赤巴斯德酵 母等。
[0029] 下面通过具体实施例并结合附图对本申请作进一步详细说明。以下实施例仅仅对 本申请进行进一步的说明，不应理解为对本申请的限制。
[0030] 一、材料与方法
[0031] 1、载体构建及转化
[0032] (1)引物设计
[0033] 经过大量的分析，本申请以人LPA基因为研究对象，选取基因序列号： NM_005577. 2, X06290. 1的序列中第12050-12990位片段，共941bp的片段进行克隆表达，并 设计其特异性引物，引物序列如表1所示。所设计的引物在生物试剂公司合成。
[0034] 表1用于制备抗Lp (a)多克隆抗血清的引物

【权利要求】
1. 一种制备高特异性的抗Lp (a)多克隆抗血清的方法，其特征在于：所述方法包括采 用Seq ID No. 1所示序列的抗原通过动物免疫制备获得所述抗Lp (a)多克隆抗血清。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述动物免疫包括选择青壮年时期并对 Apo(a)易感的山羊或兔子，以浓度为l-5mg/mL的所述抗原进行多点多次免疫，直至抗体效 价达到预期值后，颈动脉放血提取纯化所述抗Lp (a)多克隆抗血清。
3. 根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述Seq ID No. 1所示序列的抗原为 提纯的克隆表达的融合蛋白；所述克隆表达包括采用Seq ID No. 2所示序列的DNA片段为插 入片段构建质粒，将所述质粒进行转化和融合蛋白表达，然后提纯获得所述Seq ID No. 1所 示序列的抗原。
4. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述Seq ID No. 2所示序列的DNA片段为 PCR扩增的产物，所述PCR扩增包括采用Seq ID No. 3所示序列和Seq ID No. 4所示序列的 引物，以LPA基因为模板进行PCR扩增。
5. 根据权利要求1-4任一项所述的方法制备的抗Lp (a)多克隆抗血清。
6. -种制备高特异性的抗Lp(a)多克隆抗血清的抗原，其特征在于：所述抗原含有Seq ID No. 1所示序列；所述抗原为提纯的克隆表达的融合蛋白；所述克隆表达包括采用Seq ID No. 2所示序列的DNA片段为插入片段构建质粒，将所述质粒进行转化和融合蛋白表达，然 后提纯获得抗原。
7. 根据权利要求6所述的抗原，其特征在于：所述Seq ID No. 2所示序列的DNA片段为 PCR扩增的产物，所述PCR扩增包括采用Seq ID No. 3所示序列和Seq ID No. 4所示序列的 引物，以LPA基因为模板进行PCR扩增。
8. 根据权利要求5所述的抗Lp (a)多克隆抗血清或者权利要求6或7所述的抗原在 Lp (a)检测中的应用。
9. 一种检测Lp (a)浓度的方法，其特征在于：所述方法包括采用权利要求5所述的抗 Lp (a)多克隆抗血清，进行酶联免疫法、放射免疫法、荧光免疫测定法和免疫比浊法中的至 少一种。
10. -种用于Lp (a)检测的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中含有权利要求5所述的 抗Lp (a)多克隆抗血清。
【文档编号】G01N33/68GK104059144SQ201410085889
【公开日】2014年9月24日 申请日期:2014年3月10日 优先权日:2014年3月10日
【发明者】谢桂华, 柴宝玲 申请人:深圳市宝凯仑科技有限公司