快速判定化学恐怖袭击毒物中化学战剂毒性大小的方法
【专利摘要】本发明涉及毒物检测【技术领域】，是一种快速判定化学恐怖袭击毒物中化学战剂毒性大小的方法；按下述方法进行：第一步，在污染水源地取污染水6mL 作污染样，将污染样分成3 份每份2mL 分别移入3 支具塞磨口比色管中并分别标记为试样A 、试样B 和试样C 。本发明快速判定化学恐怖袭击毒物中化学战剂毒性大小的方法较传统的化学毒物检测方法大大缩短了检测周期、简化了操作，说明本发明快速判定化学恐怖袭击毒物中化学战剂毒性大小的方法检测周期短、操作过程简单，大大提高了检测效率，降低了检测成本，适宜于当前反恐应急化学毒物的现场快速检测和对化学毒物进行进一步�：π云拦�。
【专利说明】快速判定化学恐怖袭击毒物中化学战剂毒性大小的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及毒物检测【技术领域】，是一种快速判定化学恐怖袭击毒物中化学战剂毒 性大小的方法。
【背景技术】
[0002]近年来，国家分裂与反分裂、恐怖与反恐怖的斗争进入一个比较尖锐的时期。随 着国际形势发生的深刻变化，在民族分裂主义、宗教极端主义、暴力恐怖主义三股势力的影 响、怂恿和支持下，新疆境内外的民族分裂破坏活动处于升级态势，我国面临恐怖袭击的直 接威胁，做好重大恐怖袭击时化学毒物的应急监测具有重要的民用及军事意义。
[0003]恐怖主义已成为严重�：野踩闹匾蛩�。尽管恐怖份子采用的方法各不相 同，但投放化学毒物是目前最常采用的手段之一，恐怖份子通常选择水源、人群密集场所等 投毒，以极小的成本造成大面积的伤亡和�：Γ⒀现氐纳缁峥只�。面对日益频繁的恐怖 活动，毒物检测、识别和排除技术是反恐应急处理的关键之一。
[0004]全身中毒性毒剂（systemic agents)主要为氢氰酸（hydrogen cyanide，HCN)，其 化合物分子中含CN-，故属氰类毒剂（cyanide agents)。施放后呈蒸气态，经呼吸道吸入， 作用于细胞呼吸链末端细胞色素氧化酶，使细胞能量代谢受阻，供能失调，迅速导致机体功 能障碍，是一类速杀性毒剂。氢氰酸可经人体皮肤、眼睛或胃肠道迅速吸收，口服少量即可 引起猝死。它阻滞人体的三羧酸循环，使组织细胞的生物氧化作用不能正常进行，造成"细 胞内窒息"，中枢神经系统首先受累，呼吸中枢麻痹常为氰化物中毒的致死原因。
[0005] 传统的化学毒物检测方法的核心技术主要来源于国外发达国家，以气相、液相色 谱-质谱以及分光光度计等仪器分析方法为主要手段，这些方法可检出样品中的痕量级物 质，检测限低、灵敏度高，但也存在着检测周期长、操作烦琐、成本较高等问题，尤其不适宜 反恐应急化学毒物的现场快速检测，也无法对化学毒物进行进一步的�：π云拦�。以往化 学毒物的应急监测多基于理化的方法，罕有以发光菌为研究对象，采用生物毒理学实验对 化学毒物进行监测的相关报道。
【发明内容】
[0006] 本发明提供了一种快速判定化学恐怖袭击毒物中化学战剂毒性大小的方法，克服 了上述现有技术之不足，其能有效解决传统的氰类毒剂化学毒物检测方法存在检测周期 长、操作烦琐和成本高，已不适宜反恐应急化学毒物的现场快速检测和对化学毒物进行进 一步�：π云拦赖奈侍�。
[0007] 本发明的技术方案是通过以下措施来实现的：一种快速判定化学恐怖袭击毒物中 化学战剂毒性大小的方法，按下述方法进行：第一步，在污染水源地取污染水6mL作污染 样，将污染样分成3份每份2mL分别移入3支具塞磨口比色管中并分别标记为试样A、试样 B和试样C，在装有试样A、试样B和试样C的3支具塞磨口比色管中分别加入10 μ 1菌液， 加塞上下振荡5次，去塞计时，精确到秒，15 min后将装有试样Α、试样β和试样C的3支具 塞磨口比色管分别插入生物毒性测试仪中进行样品发光强度测试，测试后得到试样A发光 强度、试样B发光强度和试样C发光强度；第二步，取6mL质量百分比浓度为3%的NaCl超 纯水溶液作空白对照，将空白对照分成3份每份2mL分别移入3支具塞磨口比色管中并分 别标记为空白样A、空白样B和空白样C，在装有空白样A、空白样B和空白样C的3支具塞 磨口比色管中分别加入10 μ 1菌液,加塞上下振荡5次，去塞计时，精确到秒，15 min后将 装有空白样A、空白样B和空白样C的3支具塞磨口比色管分别插入生物毒性测试仪中进 行空白样发光强度测试，测试后得到空白样A发光强度、空白样B发光强度和空白样C发光 强度；第三步，将试样A发光强度与空白样A发光强度的比值、试样B发光强度与空白样B 发光强度的比值、试样C发光强度与空白样C发光强度的比值平均后得到相对发光率；第四 步，把相对发光率代入浓度与毒性效应回归方程Y=96. 73-205. 12X，其中：Y为相对发光率， X为氢氰酸浓度，计算得到X值即为污染样的氢氰酸浓度。
[0008] 下面是对上述发明技术方案的进一步优化或/和改进： 上述菌液按下述方法得到：在装有〇. 5g明亮发光杆菌的安瓿瓶中加入lmL质量百分比 浓度为2%的NaCl超纯水溶液混匀后，得到菌液。
[0009] 上述超纯水为18. 2 ΜΩ · cm的超纯水。
[0010] 上述试样A和空白样A在生物毒性测试仪的检测温度不超过± 1 °C、试样B和空白 样B在生物毒性测试仪的检测温度不超过± 1 °C、试样C和空白样C在生物毒性测试仪的检 测温度不超过土 1°C。
[0011] 上述生物毒性测试仪为发光菌毒性测定仪DXY-3型。
[0012] 上述具塞磨口比色管的规格为直径1. 2cm、高5cm。
[0013] 本发明快速判定化学恐怖袭击毒物中化学战剂毒性大小的方法较传统的化学毒 物检测方法大大缩短了检测周期、简化了操作，说明本发明快速判定化学恐怖袭击毒物中 化学战剂毒性大小的方法检测周期短、操作过程简单，大大提高了检测效率，降低了检测成 本，适宜于当前反恐应急化学毒物的现场快速检测和对化学毒物进行进一步�：π云拦�。
【具体实施方式】
[0014] 本发明不受下述实施例的限制，可根据本发明的技术方案与实际情况来确定具体 的实施方式。
[0015] 实施例1，一种快速判定化学恐怖袭击毒物中化学战剂毒性大小的方法，按下述方 法进行：第一步，在污染水源地取污染水6mL作污染样，将污染样分成3份每份2mL分别移 入3支具塞磨口比色管中并分别标记为试样A、试样B和试样C，在装有试样A、试样B和 试样C的3支具塞磨口比色管中分别加入10 μ 1菌液，加塞上下振荡5次，去塞计时，精确 到秒，15 min后将装有试样Α、试样Β和试样C的3支具塞磨口比色管分别插入生物毒性测 试仪中进行样品发光强度测试，测试后得到试样A发光强度、试样B发光强度和试样C发光 强度；第二步，取6mL质量百分比浓度为3%的NaCl超纯水溶液作空白对照，将空白对照分 成3份每份2mL分别移入3支具塞磨口比色管中并分别标记为空白样A、空白样B和空白样 C，在装有空白样A、空白样B和空白样C的3支具塞磨口比色管中分别加入10 μ 1菌液，力口 塞上下振荡5次，去塞计时，精确到秒，15 min后将装有空白样Α、空白样Β和空白样C的3 支具塞磨口比色管分别插入生物毒性测试仪中进行空白样发光强度测试，测试后得到空白 样A发光强度、空白样B发光强度和空白样C发光强度；第三步，将试样A发光强度与空白 样A发光强度的比值、试样B发光强度与空白样B发光强度的比值、试样C发光强度与空白 样C发光强度的比值平均后得到相对发光率；第四步，把相对发光率代入浓度与毒性效应 回归方程Y=96. 73-205. 12X，其中：Y为相对发光率，X为氢氰酸浓度，计算得到)(值即为污 染样的氢氰酸浓度。
[0016] 实施例2,作为上述实施例的优化，实施例2中菌液按下述方法得到：在装有 〇· 5g明亮发光杆菌的安瓿瓶中加入lmL质量百分比浓度为2%的NaCl超纯水溶液混匀后， 得到菌液。这样，当明亮发光杆菌活性高，处于积极分裂状态时，细胞ATP含量高，发光强； 休眠细胞ATP含量明显下降，发光弱；当细胞死亡，ATP立即消失，发光停止；处于活性期的 明亮发光杆菌，当加入毒性物质，菌体就会受抑甚至死亡，体内ATP含量也会随之降低甚至 消失，发光度便下降甚至到零。
[0017] 实施例3,作为上述实施例的优化，实施例3中超纯水为18. 2 ΜΩ . cm的超纯水。 超纯水可由Mili-Q超纯水机制备。
[0018] 实施例4,作为上述实施例的优化，实施例4中试样A和空白样A在生物毒性 测试仪的检测温度不超过土 l°c、试样B和空白样B在生物毒性测试仪的检测温度不超过 土 1°C、试样C和空白样C在生物毒性测试仪的检测温度不超过土 rc。
[0019] 实施例5,作为上述实施例的优化，实施例5中生物毒性测试仪为发光菌毒性测 定仪DXY-3型。
[0020] 实施例6,作为上述实施例的优化，实施例6中具塞磨口比色管的规格为直径 1. 2cnu高 5cm〇
[0021] 本发明上述实施例中浓度与毒性效应回归方程按下述方法得到： 1材料与方法 1. 1供试发光细菌明亮发光杆菌（photobacterium phosphoreum)T3变种由中国科 学院南京土壤研究所提供。T3小种冻干粉，安瓿瓶包装，每瓶0. 5g，在2°C至5°C冰箱内保 存，有效期为6个月，有效期内使用。
[0022] . 2供试化学战剂选择毒性强烈的全身中毒性毒剂氢氰酸（hydrogen cyanide， HCN)做为待测化学战剂。
[0023] · 3化学毒物模型建立待测化学战剂HCN与对照均采用Mili-Q超纯水机制备 的1S. 2 ΜΩ . cm超纯水进行溶液制备，保存于4Γ冰箱待用，保存期不超过24h ;实验对照 组用质量百分比为3%的NaCl超纯水溶液，同一批样品在测定过程中要求温度波动不超过 ±1°C。实验仪器为南京土壤研究所生产的发光菌毒性测定仪dxy-3型。所有测试器皿及 试剂、溶液测前lh均置于控温的测试室内。根据预实验的结果将HCN标准贮备液分别配制 成0.01，0.05,0· 10,0.2〇,0.30和0.50 mg / L的6个浓度系列，每个浓度设3份平行样 品。
[0024] . 4毒性测试各吸取2mL氢氰酸溶液于比色管中，用2ml质量百分比浓度为3% 的NaCl超纯水溶液作空白对照，迅速吸1〇 μ丨菌液于具塞磨口比色管（直径L 2 cm，高 5 cm)中，加塞上下振荡5次，去塞计时，精确到秒，15 min后将比色管插入生物毒性测试仪 中，进行发光强度的检测（以仪器中光电倍增管受光量子感应后产生的微电流mV为信号， 计量发光量），计算相对发光率（相对发光率=样品发光强度/对照发光强度X 100%)，取 3次重复测定的平均值。
[0025] . 5统计学处理采用SPSS 17. 0统计软件对数据进行分析，用EC5(I-15 min值（15 min时发光细菌半数发光抑制浓度）表达样品毒性，将己知毒物浓度与其相对发光度均 值进行回归分析，建立相关方程，绘制关系曲线，求各自的一元一次线性回归方程的a (截 距）、b (斜率）和r (相关系数），列出方程：Y = a+bX，求出相对发光度为50%时所对应毒 物的稀释浓度，即EQ值。
[0026] 结果 分析化学战剂氢氰酸的毒性剂量与对明亮发光杆菌的毒性效应关系，结果见表1所 /J、〇
[0027] 氢氰酸属于剧毒类物质，毒性迅速而剧烈。在本实验中，氢氰酸对明亮发光杆菌 的剂量-毒性效应实验结果显示，样品发光强度均值变化范围从最小的0.00 mV (对应 HCN浓度为0· 50 mg/L)到最大的715. 00 mV (对应HCN浓度为0. 01 mg/L)，对照发光强度 均值740. 67至802. 00 mV，而样品相对发光率随着毒物浓度的增加而不断下降，从最高的 95. 50% (对应HCN浓度为0· 01 mg/L)到最低的0. 00% (对应HCN浓度为0. 50 mg/L)。随着 氢氰酸剂量的不断增加，明亮发光杆菌的相对发光率不断降低，提示氢氰酸的毒性强度与 其浓度呈正相关，明亮发光杆菌的相对发光率与氢氰酸的浓度呈负相关。
[0028] 在本实验中，EC50-15 min值是指使发明亮发光杆菌作用15min时使样品产生50% 光损失时的污染物浓度，该值越大，说明被研究的物质毒性越低，而该值越�。得鞅谎芯� 的物质毒性越强。进一步对氢氰酸的分析发现，其EC50-15 min值为0.23 mg / L，其浓度 与毒性效应回归方程为Y=96. 73-205. 12X，而相关系数r为-0. 98。
[0029] 实际应用 氢氰酸主要应用于电镀业(镀铜、镀金、镀银)、采矿业(提取金银)、船舱、仓库的烟熏灭 鼠，制造各种树脂单体如丙烯酸树酯、甲基丙烯酸树酯等行业。氢氰酸是氰化氢（HCN)的水 溶液，外观为无色液体，有苦杏仁味。按照我国危险化学品的分类及标志（GB 13690-92)将 该物质划为第6.1类毒害品；剧毒物品分级、分类与品名编号（GA 57-93)中，该物质属第 一类A级无机剧毒品。
[0030] 为了验证明亮发光杆菌对氢氰酸毒性大小的判定，本实验室采用双盲法进行了实 际应用，步骤如下： 3. 1氢氰酸溶液的配置分别吸取0. 30mL、0. 60mL和0. 12 mL的lOmg / L的HCN标 准贮备液入100 mL容量瓶，采用Mili-Q超纯水机制备的18. 2 ΜΩ . cm超纯水作为溶剂定 容至100mL，配制成0· 03,0· 06和0. 12mg / L的3个浓度，成为未知浓度的待测样品，分别 标记为A样品、B样品和C样品。以上操作由一名实验操作人员完成。
[0031] 样品毒性测试及浓度计算各吸取2 ml A样品、B样品和C样品于3支具塞磨口 比色管（直径1.2 cm，高5 cm)中，每个样品设3份平行。用2ml质量百分比浓度为3% NaCl超纯水溶液作空白对照，迅速吸取10μ1菌液于比色管中，加塞上下振荡5次，去塞 计时，精确到秒，15 min后将比色管插入生物毒性测试仪中，计算相对发光率，取3个平行 的平均值作为最终计算结果。
[0032] 按照前期浓度与毒性效应回归方程为Y=96. 73-205. 12X，其中X代表氢氰酸浓度， Υ代表该氢氰酸浓度下的相对发光率（％);计算过程是通过Υ求得X ;Υ :相对发光率（％)=样 品发光强度/对照发光强度X100°/。是已知的，通过将已知的γ值带入上述毒性效应回归方 程，求得X。以上操作由另一名实验操作人员完成。
[0033] 结果 Α样品、Β样品和C样品通过回归方程推算样品浓度的验证结果如表2所示。
[0034] 从上述结果可知，按照前期浓度与毒性效应回归方程为Y=96. 73-205. 12X，实际配 置Α样品、Β样品和C样品的浓度0_03mg / L、0_06mg / L和0. 12mg / L与通过明亮发光 杆菌方法推算出的样品浓度完全一致，说明该方法具有很好的推广价值。
[0035] 传统生活饮用水中氰化物检测方法根据GB/T 5750.5-2006《生活饮用水标准检 验方法》异烟酸-吡唑酮分光光度法；其原理是用氯胺T将氰化物转变为氯化氰，再与异 烟酸一吡唑酮作用，生成蓝色染料，比色定量；所用试剂主要包括酒石酸、乙酸锌、氢氧化钠 溶液、磷酸盐缓冲溶液、磷酸氢二钠、异烟酸、吡唑酮、N-二甲基甲酞胺、氯胺T、硝酸银、氰 化钾、试银灵、丙酮、甲基橙等12种试剂；主要仪器包括500mL全玻璃蒸馏器、25mL和50mL 具塞比色管、恒温水浴锅、分光光度计、电炉等；实验步骤主要包括量取样品、蒸馏、测量吸 光度等5步化学反应；根据氰化物标准使用溶液计算标准曲线，然后从曲线上查出样品管 中氰化物质量；检测时间为4h至5h，所用试剂以及仪器种类较多，操作过程烦琐。生活饮 用水中氰化物检测方法详见GBT 5750.5-2006生活饮用水标准检验方法，无机非金属指 标.pdf 第 19-21 页。
[0036] 本发明从污染水源地检测出污染样的氢氰酸浓度的时间仅为13分钟至17分钟， 且本发明快速判定化学恐怖袭击毒物中化学战剂毒性大小的方法中所用试剂为明亮发光 杆菌和NaCl超纯水溶液，操作步骤简单。
[0037] 综上所述，本发明快速判定化学恐怖袭击毒物中化学战剂毒性大小的方法较传统 的化学毒物检测方法大大缩短了检测周期、简化了操作，说明本发明快速判定化学恐怖袭 击毒物中化学战剂毒性大小的方法检测周期短、操作过程简单，大大提高了检测效率，降低 了检测成本，适宜于当前反恐应急化学毒物的现场快速检测和对化学毒物进行进一步�：� 性评估。
[0038]以上技术特征构成了本发明的实施例，其具有较强的适应性和实施效果，可根据 实际需要增减非必要的技术特征，来满足不同情况的需求。
[0039] 表1氢氰酸对明亮发光杆菌的剂量-毒性效应
【权利要求】
1. 一种快速判定化学恐怖袭击毒物中化学战剂毒性大小的方法，其特征在于按下述方 法进行：第一步，在污染水源地取污染水6mL作污染样，将污染样分成3份每份2mL分别移 入3支具塞磨口比色管中并分别标记为试样A、试样B和试样C,在装有试样A、试样B和 试样C的3支具塞磨口比色管中分别加入10 μ 1菌液，加塞上下振荡5次，去塞计时，精确 到秒，15 min后将装有试样Α、试样Β和试样C的3支具塞磨口比色管分别插入生物毒性测 试仪中进行样品发光强度测试，测试后得到试样A发光强度、试样B发光强度和试样C发光 强度；第二步，取6mL质量百分比浓度为3%的NaCl超纯水溶液作空白对照，将空白对照分 成3份每份2mL分别移入3支具塞磨口比色管中并分别标记为空白样A、空白样B和空白样 C，在装有空白样A、空白样B和空白样C的3支具塞磨口比色管中分别加入10 μ 1菌液，力口 塞上下振荡5次，去塞计时，精确到秒，15 min后将装有空白样Α、空白样Β和空白样C的3 支具塞磨口比色管分别插入生物毒性测试仪中进行空白样发光强度测试，测试后得到空白 样A发光强度、空白样B发光强度和空白样C发光强度；第三步，将试样A发光强度与空白 样A发光强度的比值、试样B发光强度与空白样B发光强度的比值、试样C发光强度与空白 样C发光强度的比值平均后得到相对发光率；第四步，把相对发光率代入浓度与毒性效应 回归方程Y=96. 73-205. 12X，其中：Y为相对发光率，X为氢氰酸浓度，计算得到X值即为污 染样的氢氰酸浓度。
2. 根据权利要求1所述的快速判定化学恐怖袭击毒物中化学战剂毒性大小的方法，其 特征在于菌液按下述方法得到：在装有0. 5g明亮发光杆菌的安瓿瓶中加入lmL质量百分比 浓度为2%的NaCl超纯水溶液混匀后，得到菌液。
3. 根据权利要求2所述的快速判定化学恐怖袭击毒物中化学战剂毒性大小的方法，其 特征在于菌液按下述方法得到：在装有0. 5g明亮发光杆菌的安瓿瓶中加入lmL质量百分比 浓度为2%的NaCl超纯水溶液混匀后，得到菌液。
4. 根据权利要求3所述的快速判定化学恐怖袭击毒物中化学战剂毒性大小的方法，其 特征在于超纯水为18. 2 ΜΩ . cm的超纯水。
5. 根据权利要求1或2或3或4所述的快速判定化学恐怖袭击毒物中化学战剂毒性大 小的方法，其特征在于试样A和空白样A在生物毒性测试仪的检测温度不超过± 1 °C、试样 B和空白样B在生物毒性测试仪的检测温度不超过± 1°C、试样C和空白样C在生物毒性测 试仪的检测温度不超过±1°C。
6. 根据权利要求1或2或3或4所述的快速判定化学恐怖袭击毒物中化学战剂毒性大 小的方法，其特征在于生物毒性测试仪为发光菌毒性测定仪DXY-3型。
7. 根据权利要求5所述的快速判定化学恐怖袭击毒物中化学战剂毒性大小的方法，其 特征在于生物毒性测试仪为发光菌毒性测定仪DXY-3型。
8. 根据权利要求1或2或3或4所述的快速判定化学恐怖袭击毒物中化学战剂毒性大 小的方法，其特征在于具塞磨口比色管的规格为直径1. 2cm、高5cm。
9. 根据权利要求5所述的快速判定化学恐怖袭击毒物中化学战剂毒性大小的方法，其 特征在于具塞磨口比色管的规格为直径1. 2cm、高5cm。
10. 根据权利要求7所述的快速判定化学恐怖袭击毒物中化学战剂毒性大小的方法， 其特征在于具塞磨口比色管的规格为直径1. 2cm、高5cm。
【文档编号】G01N21/76GK104297228SQ201410440659
【公开日】2015年1月21日 申请日期:2014年9月1日 优先权日:2014年9月1日
【发明者】王君, 张建江, 贾继民, 田华, 马永红, 刘健, 王新建 申请人:乌鲁木齐市疾病预防控制中心, 中国人民解放军新疆军区疾病预防控制中心
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