纸基微流控免疫传感器芯片和现场及时检测免疫分析平台的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种纸基微流控免疫传感器芯片和现场及时检测免疫分析平台。所述纸基微流控免疫传感器芯片，在纸基上构建微流控通道，对通道内反应区进行表面改性处理，使之与抗体进行化学交联，将抗体固定于纸基表面。芯片的洗涤需结合环炉进行，用环圈温度来控制洗涤和流速，解决了国内外现有的纸基微流控芯片在洗涤和流速控制上的问题。通过使用手机拍照、扫描采集图像或激光诱导荧光的方式，检测与抗原特异性结合的另一以介孔二氧化硅或金属氧化物-二氧化硅复合型纳米粒子为基质的集群标记物标记的抗体，从而检测出待测抗原的含量。本发明所述的纸基微流控免疫传感器芯片显著提高了检测的灵敏度。
【专利说明】纸基微流控免疫传感器芯片和现场及时检测免疫分析平台
【技术领域】
[0001]本发明属于检测分析领域，具体地，涉及一种纸基微流控免疫传感器芯片和现场及时检测免疫分析平台。
【背景技术】
[0002]现场及时检测(Point-of-care-testing, P0CT)是近年来医学检验的一个新概念。该检测平台可以减少病人进入医院就诊的次数，减小医院的压力，降低病人的就医成本和减小医疗保险的成本，增加病人的满意度。POCT的建立对于发展中国家尤其重要，生活在这些国家的人民或缺少医疗基础资源，或者负担不起昂贵的医疗测试费用。根据世界卫生组织的建议，对发展中国家，医疗诊断设备应该具有ASSURED，即不贵的(Affordable)，灵敏的(Sensitive),特效的(Specific),使用者友好的(User-friendly),快速的(Rapid),耐用的(Robust)和可以免费供给用户使用。为了构建POCT系统，具有生物活性纸(Bioactive paper)所搭建起来的分析检测平台走进了人们的生活。
[0003]中国人口众多、医疗资源差异较大，是POCT潜在的巨大市场。据估计中国POCT市场年增速35%以上。但目前中国POCT市场尚处于初始阶段，国内企业刚开始涉足这些【技术领域】，行业的自主创新能力仍然低下、拥有自主知识产权的产品缺乏，多为仿制，整体市场相当于欧美国家八九十年代水平，远远不能满足潜在的市场需求。还需集国内顶尖的学科技术优势共同协作攻关，科技跨界联合创新，优势互补，形成合力研发新型产品。
[0004]2007年美国哈佛大学的George M.Whitesides小组提出了一种名为微流控纸基分析装置(Microfluidic paper based analytical devoces, μ PADs)的诊断系统，代表纸条试验装置的新一代选择，为ASSURED设计了一个新的诊断平台，他们以同时测定体液中葡萄糖和蛋白质的纸质微流控免疫传感器芯片为模型，对这一新的检测系统进行了阐述。
[0005]中国专利申请CN201110270213.2中给出的微流控纸芯片仅能进行定性检测。
[0006]中国专利申请CN201210472330.1中给出的高通量微流控纸芯片设置丝网印刷电极、采用电化学信号对抗原进行检测。
[0007]中国专利申请CN201210577222.0中给出的多通道微流控化学发光纸芯片采用化学发光信号对抗原进行检测，且对该芯片进行塑封处理。
[0008]中国专利申请CN201210577821.2中给出的微流控芯片设置丝网印刷电极、采用电化学信号进行检测。
[0009]中国专利申请CN201310011320.2中给出的微流控芯片设置有双极电极、通过电化学进行检测。
[0010]中国专利申请CN201310398596.0中给出的微流控芯片设置有丝网印刷电极、通过电化学进行检测。
[0011]中国专利申请CN201310349414.0中给出的微流控芯片由纸基芯片和纸基底片复合而成，且所述纸基芯片和纸基底片用液态胶处理。
[0012]中国专利申请CN201320069523.2中给出的三维微流控芯片通过多层纸片重叠制备。
[0013]目前商品生产的快速检测手段主要是一些测试纸条，如血糖试纸、早孕试纸、乳酸试纸、尿酸试纸、滥用药物试纸、病原体检测试纸，农药检测试纸，生物标志物试纸等。免疫分析试纸也有商品生产，最典型的是基于免疫色谱原理，使用HRP (辣根过氧化物酶)作为标记物和使用胶体金作为标记物的免疫分析试纸。而这些传统的测试纸条，主要使用的检测方法是目视比色，不需要任何检测仪器，方便快捷，但是缺点是灵敏度比较低，仅仅适用于一般项目测试，很难满足许多免疫分析的要求。
[0014]免疫分析是一种高特异性的生物分析技术，它在各种低含量病原体抗原和抗体、激素、蛋白质，及各种半抗原，如药物、农药等的分析方面发挥了重要作用，已经成为临床检验和食品安全检测的重要手段。
[0015]以酶作为标记物并以酶催化显色反应为基础的酶联免疫分析(ELISA)和以酶催化化学发光反应为基础的化学发光免疫分析(CLIA)以及用荧光物质作为标记物的荧光免疫分析(FIA)，已经成为当前免疫分析的主流方法。酶联免疫分析的灵敏度取决于酶催化显色反应的灵敏度，通常一个抗体只能结合一个辣根过氧化物酶(HRP)的分子，测定灵敏度较低。
【发明内容】
[0016]本发明所要解决的技术问题是提供一种检测灵敏度高的纸基微流控免疫传感器
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[0017]此外，本发明还提供一种包含上述纸基微流控免疫传感器芯片的现场及时检测免疫分析平台。
[0018]本发明解决上述问题所采用的技术方案是:提供一种纸基微流控免疫传感器芯片，包括纸基、在所述纸基上构建的微流控通道，以及设在该微流控通道内的集群标记物标记的抗体，所述集群标记物的标记载体为介孔二氧化硅纳米粒子或金属氧化物-二氧化硅复合型纳米粒子，该纸基微流控免疫传感器芯片主要由以下制备方法制得:
构建微流控通道步骤:在纸基上构建微流控通道，所述微流控通道由疏水屏障及亲水通道构成，所述亲水通道包括用于发生免疫反应的反应区；
反应区表面改性处理步骤:所述反应区内纸基经过表面改性处理，使所述纸基表面带有醒基；
添加包被抗体步骤:在反应区内加入待检测抗原对应的包被抗体，包被抗体与表面带有醛基的纸基交联固定；
封闭步骤:在反应区内加入封闭剂，用于封闭纸基上未结合抗体的活性部位；
添加抗原步骤:在反应区内加入待检测抗原；
集群标记物标记抗体制备步骤:对标记载体进行表面改性，使任一标记载体能够结合若干的标记物，所述标记载体为介孔二氧化硅纳米粒子或金属氧化物-二氧化硅复合型纳米粒子，添加与待检测抗原一一对应的抗体，使任一抗体与以介孔二氧化硅或金属氧化物-二氧化硅复合型纳米粒子为基质的集群标记物结合；
添加标记抗体步骤:在反应区内加入以介孔二氧化硅或金属氧化物-二氧化硅复合型纳米粒子为基质的集群标记物标记的抗体；所述标记抗体与包被抗体分别与待检测抗原上的抗原决定簇结合，形成包被抗体-抗原-标记抗体免疫复合物。
[0019]近年来，由于纸基芯片的提出，免疫分析得到广泛地应用，在免疫分析中，通常一个抗体结合一个标记物，其测定灵敏度较低；且在纸上构建微流控通道，靠纸的毛细管作用进行液体的输送，不需要其它的动力设备、高压电源以及注射泵等，但是液体的输送速率难于控制，不能将难于洗涤的物质从反应区洗去，进而影响检测的灵敏度。
[0020]本发明对反应区内的纸基表面改性，使其带有醛基，易与包被抗体进行良好的化学交联，利于包被抗体的固定，并且采用以介孔二氧化硅或金属氧化物-二氧化硅复合型纳米粒子为基质的集群标记物来标记抗体，能够明显提高所述芯片的检测灵敏度，试剂及样品的消耗少，能实现亚微升甚至纳升的试剂及样品的消耗。
[0021]环炉技术是一种微量分析技术。环炉的主体是放在架子上的一块厚壁金属圆筒，外侧绕电热丝加热炉体。炉孔正上方是一支装洗涤剂用的毛细移液管。
[0022]现有技术中通常使用环炉将滤纸上的待检测组分冲洗至炉孔边缘，主要用于金属离子富集，具体为:先用一支毛细移液管在滤纸圆心加1-3微升试样溶液，调节炉温至稍高于洗涤剂的沸点，然后用滤纸上方的毛细移液管将洗涤剂加到滤纸中心，当毛细移液管尖端接触芯片时，试样中的可溶性组分随同洗涤剂向外扩散，当扩散到炉孔边缘时，洗涤剂蒸发，留下可溶性组分。这样连续冲洗，直到可溶性组分全被浓集到炉孔边缘，形成一个窄环，然后用试剂显色检测或者是发光检测。
[0023]本发明中将所述环炉应用于含有非封闭型反应区的纸基微流控免疫传感器芯片，且在所述反应区表面改性处理步骤、添加包被抗体步骤、添加抗原步骤以及添加标记抗体步骤中将纸基微流控免疫传感器芯片放置于所述环炉上，洗涤未反应的试剂。
[0024]具体地，所述反应区表面改性处理步骤可以为:所述反应区内纸基经过表面改性处理，使所述纸基表面带有醛基，反应后将所述芯片放置于所述环炉上，洗涤所述反应区内未反应的试剂。
[0025]所述添加包被抗体步骤具体地可以为:在反应区内加入待检测抗原对应的包被抗体，包被抗体与表面带有醛基的纸基交联固定，反应后将所述芯片放置于所述环炉上，洗涤所述反应区内未反应的试剂。
[0026]所述添加抗原步骤具体地可以为:在反应区内加入待检测抗原，反应后将所述芯片放置于所述环炉上，洗涤所述反应区内未与包被抗体结合的抗原。
[0027]所述添加标记抗体步骤具体地可以为:在反应区内加入以介孔二氧化硅或金属氧化物-二氧化硅复合型纳米粒子为基质的集群标记物标记的抗体；所述标记抗体与包被抗体分别与待检测抗原上的抗原决定簇结合，形成包被抗体-抗原-标记抗体免疫复合物，反应后将所述芯片放置于所述环炉上，洗涤所述反应区内未与抗原结合的标记抗体。
[0028]洗涤剂(如蒸馏水)加到所述芯片中心，通过微流控通道向芯片边缘扩散，所述环炉对所述芯片边缘加热使得洗涤剂加速蒸发，通过控制所述环炉的环圈温度来控制洗涤剂的流速。具体为:将一张纸基微流控免疫传感器芯片放在环炉上，用金属环压�。扔靡恢敢埔汗茉诟魍ǖ赖姆从η诩�1-3微升试样溶液，调节炉温至稍高于洗涤剂的沸点，然后用芯片上方的毛细移液管将洗涤剂加到芯片中心，当毛细移液管尖端接触芯片时，反应区内试样中的残余组分随同洗涤剂向外扩散，扩散到炉孔边缘。这样连续冲洗，直到试样中的残余组分全被洗至边缘，在反应区内只留下待测组分。通过调整环炉的加热温度，可以控制洗涤剂从芯片中央向外扩散的速率，从而可将反应区内难于洗涤的反应物洗去。用环圈温度来控制洗涤和流速，解决了国内外现有的纸基微流控芯片在洗涤和流速控制上的问题。
[0029]其中，所述集群标记物包括以介孔二氧化硅或金属氧化物-二氧化硅复合型纳米粒子为基质的辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶(AP)、异硫氰酸荧光素(FITC)或联吡啶钌。这种新标记物可以大大提高现有国内外免疫分析产品的检测灵敏度。根据选用的检测方法不同，标记物的选用也不同，采用比色法时，采用辣根过氧化物酶(HRP)以及碱性磷酸酶(AP)作为标记物；采用激光诱导荧光法时，采用异硫氰酸荧光素(FITC)或联吡啶钌作为标记物。
[0030]其中，所述待检测抗原包括:葡萄糖、蛋白质、血红蛋白、亚硝酸盐、尿胆素原、胆红素、血液中白细胞和红细胞、HIV、流感病毒、乙肝病毒、丙肝病毒、手足口病毒EV71和CA16蛋白、AFP、CEA、CA50、CA125、CA153、CA199、PSA、FER、β -HCG、肿瘤坏死因子-a、C-P、INS、抗-GAD、抗-1NS、白细胞介素_6、半胱氨酸蛋白酶抑制剂C、卵粘蛋白、牛血清白蛋白、B型葡萄球菌肠毒素等。
[0031 ] 其中，所述反应区表面改性处理步骤中，所述表面改性处理可以具体为:高碘酸钠法、壳聚糖-戊二醛法、表面硅烷化法或微晶纤维素-戊二醛纸外交联法。
[0032]更具体地，所述高碘酸钠法包括以下步骤:取似104加在纸基微流控免疫传感器芯片的反应区内，在37°C、恒温的条件下避光反应0.5小时。
[0033]所述壳聚糖-戊二醛法包括以下步骤:将壳聚糖的乙酸溶液用毛细管加到芯片反应区上，用0.1M pH7.2的PBS缓冲液(磷酸盐缓冲液)洗涤3次，再用毛细管点在芯片反应区，加体积分数为2.5%的戊二醛水溶液，避光反应0.5小时，干燥后用0.1M pH7.2的PBS缓冲液洗涤5次。
[0034]所述表面硅烷化法包括以下步骤:将3-氨丙基三乙氧基硅烷用毛细管加到芯片的反应区，对芯片进行硅烷化处理。
[0035]所述微晶纤维素-戊二醛纸外交联法包括以下步骤:将微晶纤维素溶解于体积分数为2.5%的戊二醒水溶液中，用毛细管将混合液点在芯片反应区,干燥后用0.1M pH7.2的PBS缓冲液洗涤3次。
[0036]其中，所述反应区表面改性处理步骤中，优选高碘酸钠法，本发明人通过多次试验发现在采用介孔二氧化硅或金属氧化物-二氧化硅复合型纳米粒子为基质的集群标记物的条件下，采用高碘酸钠法改性后的纸基芯片明显较另三种表面改性法的纸基芯片的检测灵敏度得到了大幅提高，提高约100倍，具有显著性。
[0037]其中，所述NaIO4的浓度为0.5M。
[0038]其中，所述纸基为纤维素或者是主要含有纤维素的高分子物质，具体如硝酸纤维素纸、纸上色谱用纸等。其具有良好的生物样品相容性，可以在其表面固定酶、蛋白质、DNA、细胞、抗原、抗体等生物大分子。本发明采用纸作为芯片的基质，安全环保，纸是可燃的，通过燃烧可以安全弃掷己经用过的芯片，不会造成化学和生物污染。
[0039]其中，所述纸基的厚度为0.07-lmm。
[0040]其中，所述构建微流控通道步骤中，可以采用疏水性高分子材料在所述纸基上构建微流控通道，或者是用自动雕刻法在所述纸基上构建微流控通道。[0041]其中，所述疏水性高分子材料包括但不限于:石蜡、过氯乙烯树脂。
[0042]具体地，所述构建微流控通道可以采用以下方法:用喷蜡打印机在纸基上打印出通道图案，将纸基放入90摄氏度恒温箱中加热5分钟，使表面蜡线渗透到纸基中，形成疏水屏障，而相邻两条蜡线内的无蜡区域为可以使液体流过的亲水通道。
[0043]其中，所述反应区包括封闭型反应区和非封闭型反应区，优选封闭型反应区。封闭型反应区内的显色反应能够呈现出良好且稳定的线性关系，检测结果稳定。
[0044]其中，所述介孔二氧化硅纳米粒子的直径为25_50nm。所述介孔二氧化硅纳米粒子比表面积大，表面及内部的孔道规则，易于固定大量的HRP分子。
[0045]其中，所述集群标记物标记抗体制备步骤中，所述标记载体可以经过以下改性处理:对标记载体中加入十六烷基溴化铵、正硅酸乙酯后，染色，再加入3-氨丙基三乙氧基硅烷使所述标记载体表面带有若干的氨基。
[0046]其中，所述纸基微流控免疫传感器芯片还包括设置在纸基上的纸阀、过滤器、混合器以及传感器等本领域技术人员常用的功能组件。
[0047]本发明所述的纸基微流控免疫传感器芯片将全分析的过程，包括取样和样品的处理、预浓集、稀释和混合、分离、化学和生物反应及信号的检测全部集成化在一块小的芯片上，它与传统的分析装置相比，能实现亚微升甚至纳升的试剂和样品消耗，分析时间短。
[0048]其中，本发明各步骤中添加试剂至反应区均以使试剂不溢出反应区为宜。
[0049]其中，所述包被抗体步骤中，所述的待检测物质的包被抗体可以为:甲胎蛋白单克隆抗体、癌胚抗原单克隆抗体等。本发明中，如无特别指出，所述包被抗体指的是待检测抗原对应的单克隆抗体。
[0050]其中，所述封闭步骤中，所述封闭剂为明胶、脱脂奶粉或质量分数为1%的BSA (牛血清白蛋白)溶液，添加量为4uL。
[0051]本发明所述的纸基微流控免疫传感器芯片可用于检测以下物质:
葡萄糖、蛋白质、血红蛋白、亚硝酸盐、尿胆素原、胆红素、血液中白细胞和红细胞、HIV、流感病毒、乙肝病毒、丙肝病毒、手足口病毒EV71和CA16蛋白、AFP、CEA、CA50、CA125、CA153、CA199、PSA、FER、β -HCG、肿瘤坏死因子-a、C-P、INS、抗-GAD、抗-1NS、白细胞介素-6、半胱氨酸蛋白酶抑制剂C、卵粘蛋白、牛血清白蛋白、B型葡萄球菌肠毒素等。
[0052]本发明所述的纸基微流控免疫传感器芯片根据对被分析物检测灵敏度的需要，可选择采用比色法、激光诱导荧光法或者是化学发光法对目标物进行定性及定量分析，具体地，采用比色法包括如下步骤:在芯片的反应区内加入TMB (四甲基联苯胺)显色液，避光反应后利用手机拍照或扫描仪采集所述芯片的图像，根据光密度值进行比色分析。具体地，采用激光诱导荧光法包括如下步骤:用激光诱导荧光法采集所述芯片发出的信号，用光电倍增管检测。
[0053]现有技术中的微流控芯片通常通过电化学信号、化学发光信号、电极等方法对待检测抗原进行检测，上述方法存在仪器设备复杂、检测成本高等缺点，而本发明所述的纸基微流控免疫传感器芯片根据集群标记物及对被分析物检测灵敏度的需要，分别用比色法、激光诱导荧光法对目标物进行定性或定量分析，检测灵敏度大幅提高，且操作简单，降低成本。
[0054]一种现场及时检测免疫分析平台，包括上述的纸基微流控免疫传感器芯片、数据处理终端、数据分析终端；
所述现场及时检测免疫分析平台能够在所述的纸基微流控免疫传感器芯片的基础上，通过所述数据处理终端以及所述数据分析终端进行数据的传输、处理以及分析，能够实时远程地获取分析结果；
所述数据处理终端用于采集所述纸基微流控免疫传感器芯片上的信息、对采集的信息进行处理、并将所述处理后的信息发送至所述数据分析终端；
所述数据分析终端用于接收所述数据处理终端发出的信息，进行分析并得出分析结
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[0055]其中，所述数据处理终端可以为智能手机、扫描仪、计算机等。通过照相或者是扫描等功能采集所述纸基微流控免疫传感器芯片上的信息。
[0056]其中，所述数据分析终端得出的分析结果还能回传至所述数据处理终端，使使用者能够远程获知该检测结果。
[0057]综上所述，本发明所述的纸基微流控免疫传感器芯片的反应灵敏度高，能适用于多种蛋白质及病毒的检测，应用范围更广。
【专利附图】
【附图说明】
[0058]图1为实施例1所示的纸基微流控免疫传感器芯片的微流控通道结构示意图，其中，纸基微流控免疫传感器芯片10、疏水屏障11、亲水通道12、反应区13、中心区14 ；
图2为实施例2所示的纸基微流控免疫传感器芯片的微流控通道结构示意图，其中，纸基微流控免疫传感器芯片20、疏水屏障21、反应区23 ；
图3为实施例3所示的纸基微流控免疫传感器芯片的微流控通道结构示意图，其中，纸基微流控免疫传感器芯片30、中心区31、亲水通道32、疏水屏障33、反应区34 ；
图4为介孔二氧化硅纳米粒子的结构示意图；
图5为介孔二氧化硅纳米粒子表面改性的流程图；
图6为双抗体夹心法检测待测抗原流程图；
图7为环炉的结构示意图，其中，环炉40、炉体41、毛细移液管42、光源43 ；
图8为反应区未洗涤的微流控免疫传感器芯片；
图9为采用环炉洗涤后的微流控免疫传感器芯片；
图10为实施例4中的甲胎蛋白标准系列显色情况；
图11为实施例4中的甲胎蛋白标准系列光密度-浓度曲线；
图12为实施例4中的2例血清样品显色情况，其中，A为I号血清样品，B为2号血清样品；
图13为实施例4中的另2例血清样品显色情况，其中，C为3号血清样品，D为4号血清样品；
图14为实施例5中的癌胚抗原标准系列显色情况；
图15为实施例5中的3例血清样品显色情况，其中，E为I号血清样品，F为2号血清样品，G为3号血清样品；
图16为实施例5中的癌胚抗原标准系列光密度-浓度曲线；
图17为实施例6中非封闭型反应区的纸基微流控免疫传感器芯片测定甲胎蛋白标准品的显色情况的扫描图，其中灰色圆形区域为显色区域；
图18为实施例6中具有非封闭型反应区的纸基微流控免疫传感器芯片测定甲胎蛋白的光密度-浓度曲线，其中A为第一试验点，B为第二试验点；
图19为实施例6中的采用封闭型反应区的纸基微流控免疫传感器芯片测定的第一试验点的甲胎蛋白标准系列显色情况；
图20为实施例6中的采用封闭型反应区的纸基微流控免疫传感器芯片测定的第二试验点的甲胎蛋白标准系列显色情况；
图21为实施例6中具有封闭型反应区的纸基微流控免疫传感器芯片测定甲胎蛋白光密度-浓度曲线，其中A为第一试验点，B为第二试验点；
图22为光导纤维激光诱导荧光检测流程，其中，半导体激光光源A、截止滤光片D、石英光纤E、玻璃光纤F、纸基微流控免疫传感器芯片G、芯片的毫米阵列的任一斑点M ；
图23为激光光源激发的Ru(bpy)32+掺杂的SiO2纳米粒子荧光强度图，A，B, C，D和E分别为不同量Ru(bpy)32+掺杂的SiO2纳米粒子激光诱导产生的荧光信号，其中，A为Ing/mL，B 为 0.5ng/mL，C 为 0.3ng/mL, D 为 0.2ng/mL, E 为 0.1ng/mL ；
图24为化学发光法对待测抗原定量检测；
图25为实施例7所示的现场及时检测免疫分析平台的结构示意图，其中，现场及时检测免疫分析平台100、纸基微流控免疫传感器芯片101、数据处理终端102、数据分析终端103。
【具体实施方式】
[0059]下面结合实施例，对本发明作进一步详细说明，但本发明的实施方式不限于此。
[0060]实施例1
请参阅图1，本发明所示的纸基微流控免疫传感器芯片10，用喷蜡打印机在纸基上打印出通道图案，将纸基放入90摄氏度恒温箱中加热5分钟，使表面蜡线渗透到纸基中，形成疏水屏障11，相邻两条蜡线内的无蜡区域则形成能够供液体流过的亲水通道12，所述纸基微流控免疫传感器芯片10中心设有一中心区14，所述中心区14向四周辐射形成若干条亲水通道12，本实施例中，设有8条所述亲水通道12。该亲水通道12包括一用于发生免疫反应的非封闭型反应区13。
[0061]实施例2
请参阅图2，本发明所示的纸基微流控免疫传感器芯片20，用喷蜡打印机在纸基上打印出通道图案，将纸基放入90摄氏度恒温箱中加热5分钟，使表面蜡线渗透到纸基中，形成若干疏水屏障21，所述若干疏水屏障21成矩形阵列排列，任一疏水屏障21成圆环形，任一疏水屏障21围成的区域为用于发生免疫反应的封闭的反应区23，该反应区23能够供液体流动。
[0062]上述实施例1及实施例2中除了采用石蜡之外，还可以采用过氯乙烯树脂等其他的疏水性高分子材料，也能达到相同的效果。
[0063]实施例3
请参阅图3，本发明所示的纸基微流控免疫传感器芯片30，用制图软件绘制出需要雕刻的图形后，采用小型数控雕刻机制作而成，所述纸基微流控免疫传感器芯片30中心设有一中心区31，所述中心区31向四周辐射形成若干条亲水通道32，本实施例中，设有8条所述亲水通道32。任意两相邻的亲水通道32之间设有疏水屏障33，所述亲水通道32邻近所述中心区设置有一用于发生免疫反应的非封闭型反应区34。
[0064]以上实施例1-3主要是对所述纸基微流控免疫传感器芯片构建微流控通道的具体方式及结构作出解释说明，除以上方法之外，还可以通过其他方式，如喷墨打印、激光处理等，其他结构构建所述微流控孔道。以下通过三个具体实施例进一步解释说明本发明。
[0065]实施例4测定人血清中的甲胎蛋白
甲胎蛋白(AFP)是由胎儿胃肠道上皮组织、胰和肝的细胞所合成。
[0066]纸基微流控免疫传感器芯片是利用ELISA双抗夹心法，利用连接于固相载体上的抗体和标记抗体分别与样品中被检测抗原分子上两个抗原决定簇结合，形成固相抗体-抗原-标记抗体免疫复合物。采用如实施例2所示矩形阵列排列的纸基微流控免疫传感器芯片，至少设有18个反应区。
[0067]具体如下:
(I)芯片氧化
a、移取0.5M NaIO4加在纸基芯片的每个圆形反应区，将芯片放入湿盒中，置于37°C恒温箱内避光反应0.5小时；
b、芯片从湿盒中取出，将反应区内剩余液体用吸水纸从背面吸干，用蒸馏水洗涤纸上未反应的闻鹏酸纳。
[0068](2)包被抗体
a、在芯片的18个反应区各加10ug/mL AFP (甲胎蛋白)单克隆抗体，放入湿盒中，置于37°C恒温箱内反应0.5小时；
b、取出芯片，将反应区内剩余液体用吸水纸从背面吸干，用蒸馏水洗涤纸上未反应的包被抗体。
[0069](3)封闭
在芯片的18个反应区各加质量分数为1%BSA溶液，放入湿盒中，置于37°C恒温箱内反应0.5小时。
[0070](4)加抗原
a、在芯片第一排依次加入0/10/20/50/100/200ng/mlAFP标准品，在下面两排中每三点加入同一血清样品，放入湿盒中，置于37°C恒温箱内反应0.5小时；
b、取出芯片，将反应区内剩余液体用吸水纸从背面吸干，用蒸馏水洗去多余的抗原。
[0071](5)制备标记抗体
如图5所示，加入十六烷基溴化铵、正硅酸乙酯对介孔二氧化硅纳米粒子进行处理后，染色，再加入3-氨丙基三乙氧基硅烷使所述介孔二氧化硅纳米粒子表面带有若干的氨基，最后使用蒸馏水将多余的组分洗涤；
将改性后的介孔二氧化硅纳米粒子中添加辣根过氧化物酶、AFP抗体，形成集群辣根过氧化物酶-AFP抗体共轭物，从而得到标记抗体。
[0072](6)加标记抗体
a、在芯片的18个反应区分别加入标记抗体，放入湿盒中，置于37°C恒温箱内反应0.5小时；b、取出芯片，将反应区内剩余液体用吸水纸从背面吸干，用蒸馏水洗涤纸上未反应的标记抗体。
[0073](7)显色反应
a、在芯片的18个反应区分别加入TMB显色液，避光反应10分钟；
b、反应后取出芯片，将反应区内剩余液体用吸水纸从背面吸干，分析显色结果。
[0074]测试结果如图10-13及下表1-2。
[0075]表1甲胎蛋白标准系列光密度值
【权利要求】
1.一种纸基微流控免疫传感器芯片，其特征在于，包括纸基、在所述纸基上构建的微流控通道，以及设在该微流控通道内的集群标记物标记的抗体，所述集群标记物的标记载体为介孔二氧化硅纳米粒子或金属氧化物-二氧化硅复合型纳米粒子，该纸基微流控免疫传感器芯片主要由以下制备方法制得: 构建微流控通道步骤:在纸基上构建微流控通道，所述微流控通道由疏水屏障及亲水通道构成，所述亲水通道包括用于发生免疫反应的反应区； 反应区表面改性处理步骤:所述反应区内纸基经过表面改性处理，使所述纸基表面带有醒基； 添加包被抗体步骤:在反应区内加入待检测抗原对应的包被抗体，包被抗体与表面带有醛基的纸基交联固定； 封闭步骤:在反应区内加入封闭剂，用于封闭纸基上未结合抗体的活性部位； 添加抗原步骤:在反应区内加入待检测抗原； 集群标记物标记抗体制备步骤:对标记载体进行表面改性，使任一标记载体能够结合若干的标记物，所述标记载体为介孔二氧化硅纳米粒子或金属氧化物-二氧化硅复合型纳米粒子，添加与待检测抗原一一对应的抗体，使任一抗体与以介孔二氧化硅或金属氧化物-二氧化硅复合型纳米粒子为基质的集群标记物结合； 添加标记抗体步骤:在反应区内加入以介孔二氧化硅或金属氧化物-二氧化硅复合型纳米粒子为基质的集群标记物标记的抗体；所述标记抗体与包被抗体分别与待检测抗原上的抗原决定簇结合，形成包被抗体-抗原-标记抗体免疫复合物。
2.根据权利要求1所述的纸基微流控免疫传感器芯片，其特征在于，所述反应区表面改性处理步骤中，所述表面改性处理为:高碘酸钠法、壳聚糖-戊二醛法、表面硅烷化法或微晶纤维素-戊二醛纸外交联法。
3.根据权利要求2所述的纸基微流控免疫传感器芯片，其特征在于，所述表面改性处理为高碘酸钠法，所述高碘酸钠法包括以下步骤:取NaIO4加在纸基微流控免疫传感器芯片的反应区内，在37°C、恒温的条件下避光反应0.5小时。
4.根据权利要求1所述的纸基微流控免疫传感器芯片，其特征在于，所述纸基微流控免疫传感器芯片的反应区为非封闭型反应区，且在所述反应区表面改性处理步骤、添加包被抗体步骤、添加抗原步骤以及添加标记抗体步骤中将该纸基微流控免疫传感器芯片放置于所述环炉上进行洗涤，洗涤剂加到所述芯片中心，通过微流控通道向芯片边缘扩散，所述环炉对所述芯片边缘加热使得洗涤剂加速蒸发，通过控制所述环炉的环圈温度来控制洗涤剂的流速。
5.根据权利要求1所述的纸基微流控免疫传感器芯片，其特征在于，所述纸基微流控免疫传感器芯片还包括以下检测步骤:在芯片的反应区内加入TMB显色液，避光反应后利用手机拍照或扫描仪采集所述芯片的图像，根据光密度值进行比色分析。
6.根据权利要求1所述的纸基微流控免疫传感器芯片，其特征在于，所述纸基微流控免疫传感器芯片还包括以下检测步骤:通过激光诱导荧光法对待测物进行定性及定量检测。
7.根据权利要求1所述的纸基微流控免疫传感器芯片，其特征在于，所述集群标记物标记抗体制备步骤中，所述标记载体经过以下改性处理:对标记载体中加入十六烷基溴化铵、正硅酸乙酯后，染色，再加入3-氨丙基三乙氧基硅烷使所述标记载体表面带有若干的氨基。
8.根据权利要求1所述的纸基微流控免疫传感器芯片，其特征在于，所述反应区为封闭型反应区。
9.一种现场及时检测免疫分析平台，其特征在于:包括权利要求1至8中任一项所述的纸基微流控免疫传感器芯片、数据处理终端、数据分析终端； 所述现场及时检测免疫分析平台能够在所述的纸基微流控免疫传感器芯片的基础上，通过所述数据处理终端以及所述数据分析终端进行数据的传输、处理以及分析，能够实时远程地获取分析结果； 所述数据处理终端用于采集所述纸基微流控免疫传感器芯片上的信息、对采集的信息进行处理、并将所述处理后的信息发送至所述数据分析终端；所述数据分析终端用于接收所述数据处理终端发出的信息，进行分析并得出分析结果.
10.根据权利要求9所述的现场及时检测免疫分析平台，其特征在于，所述数据处理终端为智能手机、扫描仪或计算机；所述数据分析终端得出的分析结果回传至所述数据处理终端，使使用者能够远程获知该检测结果。
【文档编号】G01N33/552GK103954751SQ201410177093
【公开日】2014年7月30日 申请日期:2014年4月29日 优先权日:2014年4月29日
【发明者】章竹君, 付爱华, 沈晖, 林湔, 章娴君 申请人:成都君亚科技有限公司
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