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鉴定anammox反应器污泥中的anammox菌是否利用有机物的方法
【专利摘要】鉴定ANAMMOX反应器污泥中的ANAMMOX菌是否利用有机物的方法，它涉及一种鉴定ANAMMOX反应器污泥中微生物是否利用有机物的方法。本发明提供一种不用富集高纯度ANAMMOX菌，无需分离、鉴定、纯化，不必纯培养，便可以鉴定ANAMMOX反应器中污泥内的ANAMMOX菌是否可以利用有机物的方法。鉴定方法：一、用15N标记ANAMMOX反应器内的氨氮，用13C标记ANAMMOX反应器内的有机物，然后厌氧氨氧化反应；二、TEM观察；三、制备导电样品；四、根据NanoSIMS图片进行得出结果。本发明应用于水处理及微生物领域。
【专利说明】鉴定ANA圖OX反应器污泥中的ANAMMOX菌是否利用有机物的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种鉴定ANAMMOX反应器污泥中微生物是否利用有机物的方法。
【背景技术】
[0002]随着全球工业化、城市化的发展，人口的快速增长，用水量大大增加，水资源的日益紧缺正威胁着人类的生存与发展。我国是严重缺水国家之一，淡水量仅占世界平均的1/4，并且已进入水资源危机初期，同时水源地域分布的不平衡，使淡水短缺矛盾更加突出。更为严峻的问题是我国水资源污染较严重，从一般污染物扩展到有毒有害污染物，已经形成了点源与面源共存，生活污染和工业排放叠加，各种新旧污染和二次污染相互复合的态势。同时，城市人口的膨胀给有限的给水系统和排水设施造成巨大的压力，污水处理设施总量不足，也导致一部分污水未经处理直接排放到自然水体中。因此，控制和治理我国水环境污染成为迫切需要解决的问题，除了需要控制污染，减少污染源外，更重要的是加快提高污水处理效率极其资源化程度。
[0003]根据《中国环境状况公报》，2001年到2012年我国废水排放总量逐年提高，从2001年的432.9亿吨增加到684.6亿吨(其中氨氮总排放量为253.6万吨，工业排放量为26.4万吨，生活排放量为144.7万吨)，其中生活污水所占比例逐年提高。生活污水是城市污水的主要组成部分，而且是氨氮污染物的主要来源。含氮污染物会造成水体富营养化；影响给水源水水质，增加给水处理成本，而且化合态氮对人体和生物具有毒害作用。早在2003年，我国正式实施了《城镇污水处理厂污染物排放标准》根据二级强化处理的技术水平，增加对总氮控制。2008年，国家环保部、国家质监总局先后出台了 7个行业共计12个污染物排放标准。新标准新增了控制项目，分年限对各行业不同工艺制定了污染物控制项目和标准限值。水污染物也增加了总磷、总氮等基本项目。
[0004]随着公众环境意识的提高和国家对氮、磷排放限制标准的日趋严格，传统污水生物处理工艺日益显示出一些自身无法克服的缺点，例如流程长，基建费用高，操作麻烦；需要曝气，能源消耗大；需要控制碳氮比，或投加额外碳源；释放二氧化碳等等。因此，如何经济并有效地去除污水中的含N、P的化合物，有效地保护受纳水体，进而防治水体的富营养化，成为迫切需要解决的问题。
[0005]ANAMMOX (厌氧氨氧化)工艺是目前已知的最经济的生物脱氮技术，与传统的硝化反硝化技术相比，ANAMMOX工艺具有能耗低、不消耗有机碳、剩余污泥量小、不释放CO2等优点，在生物脱氮领域具有广泛的应用前景。
[0006]ANAMMOX菌是一种化能自养型细菌，以无机碳为碳源，之前认为不能利用有机碳。由于受无机物氧化产生能量不足的制约，ANAMMOX微生物存在生长缓慢、世代时间长、细胞得率低等诸多缺陷，导致细菌培养周期长，导致其实际应用效率被限制。
[0007]如能证明ANAMMOX菌可利用有机物，则可以通过人为调节水体中有机物的方式大大缩短ANAMMOX微生物的生长周期和世代，提高细胞得率和脱氮效果。但是研究ANAMMOX菌20余年，至今ANAMMOX污泥中的ANAMMOX微生物仍未获得纯培养，为生理生化研究造成了巨大的困难。虽经研究人员的不懈努力、采用多种方法截至2011年一共从厌氧氨氧化反应器污泥中分离、鉴定出了 8株ANAMMOX菌，但鉴定结果显示这些ANAMMOX菌分属于不同的种属，而且分别出现在不同的ANAMMOX污泥中。由于ANAMMOX污泥的来源不同，组成ANAMMOX污泥的微生物也不同，所以不同ANAMMOX污泥的生理生化特点也不相同。尽管利用同位素示踪技术已经证明已知的ANAMMOX菌中某些特定菌株可以利用有机物，但是依靠分离、鉴定的方式无法满足对不同ANAMMOX污泥中ANAMMOX菌研究的需要。
[0008]另有研究人员通过富集的手段对ANAMMOX污泥中ANAMMOX菌的生理生化进行研究，但富集的微生物中还包含有非ANAMMOX菌，因此其实验结果会受到非ANAMMOX菌的干扰，而且富集过程中也可能导致微生物种群发生变化，影响结果的准确性。
[0009]由于ANAMMOX菌没有获得纯培养，所以ANAMMOX菌利用有机物的研究都是建立在反应器水平上的，作为一个混合培养体系，仅能证明有机物对ANAMMOX过程无影响，其结果均通过水体中物质的浓度变化分析间接得出的，不能为ANAMMOX菌利用有机物提供直接证据；而且无法获知利用有机物的是富集物中的哪种或哪些微生物。即使对污泥中的ANAMMOX菌富集培养并采用现有的同位素示踪技术，由于未能实现纯培养，微生物中的干扰因素未能排除，其实验结果仍然缺乏可信度和说服力。

【发明内容】

[0010]本发明要提供一种不用富集高纯度ANAMMOX菌，无需分离、鉴定、纯化，不必纯培养，便可以鉴定ANAMMOX反应器中污泥内的ANAMMOX菌是否可以利用有机物的方法。
[0011]本发明鉴定方法按以下步骤进行:
[0012]一、用15N标记ANAMMOX反应器内的游离态氨，用13C标记ANAMMOX反应器内的有机物，然后厌氧氨氧化反应10~100小时，之后终止反应，离心分离获得微生物样品，将微生物样品放置于2.5%戊二醛磷酸盐缓冲液中固定`；
[0013]二、用步骤一微生物样品制备透射电子显微镜样品，然后进行TEM观察；
[0014]三、根据步骤二 TEM观察结果选择目标微生物分布均匀的位置，利用切片机切片成半薄切片，放置于导电硅片上，经固定、烘干后再次喷金覆盖，得到导电样品；
[0015]四、利用纳米二次离子质谱技术扫描步骤三制备的导电样品中的标记元素，获得NanoSIMS图片；若15N标记富集的区域中有13C明显富集，则该反应器内的ANAMMOX菌可以利用有机物；若15N标记富集的区域中没有13C富集，则该反应器内的ANAMMOX菌不能利用有机物。
[0016]本发明方法为反应器内污泥中的ANAMMOX菌是否可以利用有机物提供了直接证据。本发明方法不改变微生物的生存环境，保证了 ANAMMOX微生物的原有种群和丰度，不受反应器的影响，并排除了非ANAMMOX菌的干扰，具有准确、可靠的特点；而且为ANAMMOX菌的后期研究和发展奠定了基础。
【专利附图】

【附图说明】
[0017]图1是【具体实施方式】十一中利用纳米二次离子质谱技术扫描15N的NanoSIMS图片，图片中浅亮色区域为15N标记富集区域。[0018]图2是【具体实施方式】十一中利用纳米二次离子质谱技术扫描13C的NanoSIMS图片，图片中浅亮色区域为13C标记富集区域。
[0019]图3是【具体实施方式】十二中利用纳米二次离子质谱技术扫描15N的NanoSIMS图片，图片中浅亮色区域为15N标记富集区域。
[0020]图4是【具体实施方式】十二中利用纳米二次离子质谱技术扫描13C的NanoSIMS图片，图片中浅亮色区域为13C标记富集区域。
[0021]图5是【具体实施方式】十二中利用纳米二次离子质谱技术扫描15N的NanoSIMS图片，图片中浅亮色区域为15N标记富集区域。
[0022]图6是【具体实施方式】十二中利用纳米二次离子质谱技术扫描13C的NanoSIMS图片，图片中浅亮色位点为13C标记物。
[0023]本发明技术方案不局限于以下所列举【具体实施方式】，还包括各【具体实施方式】间的任意组合。
[0024]【具体实施方式】一:本实施方式鉴定方法按以下步骤进行:
[0025]一、用15N标记ANAMMOX反应器内的游离态氨(15NH4+_N)，用13C标记ANAMMOX反应器内的有机物，然后厌氧氨氧化反应10?100小时，之后终止反应，离心分离获得微生物样品，将微生物样品放置于2.5%戊二醛磷酸盐缓冲液中固定；
[0026]二、用步骤一微生物样品制备透射电子显微镜样品(TEM样品)，然后进行TEM观察；
[0027]三、根据步骤二 TEM观察结果选择目标微生物分布均匀的位置，利用切片机切片成半薄切片，放置于导电硅片上，经固定、烘干后再次喷金覆盖，得到导电样品；
[0028]四、利用纳米二次离子质谱技术扫描步骤三制备的导电样品中的标记元素，获得NanoSIMS图片；若15N标记富集的区域中有13C明显富集，则该反应器内的ANAMMOX菌可以利用有机物；若15N标记富集的区域中没有13C富集，则该反应器内的ANAMMOX菌不能利用有机物。
[0029]本实施方式方法同时利用两种稳定性同位素进行示踪和鉴定。ANAMMOX反应器污泥中能吸收利用游离态氨的无一例外均为ANAMMOX菌，因此NanoSIMS (纳米二次离子质谱技术)图片中15N标记富集的区域显示为ANAMMOX菌；而ANAMMOX反应器内只有有机物含有13C,所以15N标记富集的区域中有13C明显富集则直接证明ANAMMOX菌利用有机物。
[0030]本实施方式方法对任何来源的ANAMMOX反应器污泥都适用，不受其他因素的干扰，具有准确度高、结果直观等优点。
[0031]用13C标记不同的有机物然后分组进行试验，可以快速得出上述有机物是否被此ANAMMOX反应器内ANAMMOX菌利用的直接证据，大大缩短了试验周期；而且相对于代谢产物的浓度分析，本实施方式方法的鉴定结果更准确和可信。
[0032]【具体实施方式】二:本实施方式与【具体实施方式】一的不同点是:步骤二透射电子显微镜样品按以下步骤制备:
[0033]A、从2.5%戊二醛磷酸盐缓冲液中取出样品，然后用0.lmol/L磷酸漂洗液漂洗三次，再用1%锇酸固定液固定2?3小时,而后用0.lmol/L磷酸漂洗液漂洗三次,每次15分钟；再在4°C条件下用梯度浓度为50%、70%、90%、95%的乙醇溶液对样品依次进行脱水处理，每种浓度处理15分钟；之后再用乙醇丙酮混合液和90%的丙酮溶液分别脱水三次，每次15?20min，然后在室温下放入浓度为100%的丙酮中脱水三次，每次15?20min ；
[0034]B、用纯丙酮与包埋液的混合液对步骤A处理后的样品室温处理3?4小时，然后37°C下纯包埋液包埋2?3小时、60°C固化5小时、再80°C固化24小时；
[0035]C、切片；
[0036]D、用3%醋酸铀-枸橼酸铅双染色切片，即完成透射电子显微镜样品；
[0037]步骤A中乙醇丙酮混合液由浓度为90%的乙醇和浓度为90%的丙酮按1:1的体积比混合而成；
[0038]步骤B纯丙酮与包埋液的混合液中纯丙酮与包埋液的体积比为2:1。其它步骤及参数与实施方式一相同。
[0039]锇酸固定液又称为四氧化锇固定液。
[0040]【具体实施方式】三:本实施方式与【具体实施方式】二的不同点是:步骤C中切片厚度为50?60nm。其它步骤及参数与实施方式二相同。
[0041]【具体实施方式】四:本实施方式与【具体实施方式】二或三的不同点是:步骤三中半薄切片的厚度为500?lOOOnm。其它步骤及参数与实施方式二或三相同。
[0042]【具体实施方式】五:本实施方式与【具体实施方式】二至四之一的不同点是:步骤三中导电硅片为喷金的玻璃片。其它步骤及参数与实施方式二至四之一相同。
[0043]【具体实施方式】六:本实施方式与【具体实施方式】二至五之一的不同点是:步骤三中喷金覆盖厚度为8?12nm。其它步骤及参数与实施方式二至五之一相同。
[0044]【具体实施方式】七:本实施方式与【具体实施方式】一至六之一的不同点是:步骤一中厌氧氨氧化反应时间为10?50小时。其它步骤及参数与实施方式一至六之一相同。
[0045]【具体实施方式】八:本实施方式与【具体实施方式】一至七之一的不同点是:步骤一中厌氧氨氧化反应时间为15?30小时。其它步骤及参数与实施方式一至七之一相同。
[0046]【具体实施方式】九:本实施方式与【具体实施方式】一至八之一的不同点是:步骤一中厌氧氨氧化反应时间为20小时。其它步骤及参数与实施方式一至八之一相同。
[0047]【具体实施方式】十:本实施方式与【具体实施方式】一至九之一的不同点是其特征在于步骤一中用13C标记的有机物为甲酸、乙酸、丙酸、丙酮、苯或其衍生物。其它步骤及参数与实施方式一至九之一相同。
[0048]【具体实施方式】十一:哈尔滨工业大学城市水资源与水环境国家重点实验室运行的ANAMMOX反应器内的ANAMMOX菌是否可利用有机物按以下步骤进行鉴定:
[0049]一、用15N标记ANAMMOX反应器内的氨氮(15NH4+-N，购自美国剑桥同位素实验室CIL)，用13C标记ANAMMOX反应器内的醋酸根(CH313C00_)，然后厌氧氨氧化反应20小时，之后终止反应，离心分离获得微生物样品，将微生物样品放置于2.5%戊二醛磷酸盐缓冲液中固定；
[0050]二、用步骤一微生物样品制备透射电子显微镜样品(TEM样品)，然后进行TEM观察；
[0051]三、根据步骤二 TEM观察结果选择目标微生物分布均匀的位置，利用切片机切片成半薄切片，放置于导电硅片上，经固定、烘干后再次喷金覆盖，得到导电样品；
[0052]四、利用纳米二次离子质谱技术扫描步骤三制备的导电样品中的标记元素，获得NanoSIMS图片；若15N标记富集的区域中有13C明显富集，则该反应器内的ANAMMOX菌可以利用有机物；若15N标记富集的区域中没有13C富集，则该反应器内的ANAMMOX菌不能利用有机物；
[0053]其中，步骤三中半薄切片的厚度为800nm;
[0054]步骤三中导电硅片为喷金的玻璃片；
[0055]步骤三中喷金覆盖厚度为IOnm ；
[0056]步骤二透射电子显微镜样品按以下步骤制备:
[0057]A、从2.5%戊二醛磷酸盐缓冲液中取出样品，然后用0.lmol/L磷酸漂洗液漂洗三次，再用1%锇酸固定液固定2.5小时，而后用0.lmol/L磷酸漂洗液漂洗三次，每次15分钟；再在4°C条件下用梯度浓度为50%、70%、90%、95%的乙醇溶液对样品依次进行脱水处理，每种浓度处理15分钟；之后再用乙醇丙酮混合液和90%的丙酮溶液分别脱水三次，每次15~20min，然后在室温下放入浓度为100%的丙酮中脱水三次，每次15~20min ；
[0058]B、用纯丙酮与包埋液的混合液对步骤A处理后的样品室温处理3.5小时，然后37°C下纯包埋液包埋2.5小时、60°C固化5小时、再80°C固化24小时；
[0059]C、切片；
[0060]D、用3%醋酸铀-枸橼酸铅双染色切片，即完成透射电子显微镜样品；
[0061 ] 步骤A中乙醇丙酮混合液由浓度为90%的乙醇和浓度为90%的丙酮按1:1的体积比混合而成；
[0062]步骤B纯丙酮与包埋液 的混合液中纯丙酮与包埋液的体积比为2:1;
[0063]其中步骤C中切片厚度为50nm。
[0064]本实施方式的NanoSMS图片如图1和图2所示，根据图1和图2对比可以直观清楚的看到在15N富集区域中有13C明显富集，且富集量有所不同，说明13C被ANAMMOX菌细胞吸收,表明本实施方式反应器内的ANAMMOX菌可以利用有机物——醋酸。
[0065]【具体实施方式】十二:本实施方式与【具体实施方式】十一的不同点是:
[0066]一、用15N标记ANAMMOX反应器内的氨氮(15NH4+-N，购自美国剑桥同位素实验室CIL)，用13C标记ANAMMOX反应器内的丙酸根(CH3CH213COO^购自美国剑桥同位素实验室CIL)，然后厌氧氨氧化反应25小时，之后终止反应，离心分离获得微生物样品，将微生物样品放置于2.5%戊二醛磷酸盐缓冲液中固定；
[0067]其中步骤二 C中切片厚度为55nm。
[0068]本实施方式的NanoSMS图片如图3和图4所示，根据图3和图4对比可以直观清楚的看到在15N富集区域中有13C明显富集，且富集量有所不同，说明13C被ANAMMOX菌细胞吸收,表明本实施方式反应器内的ANAMMOX菌可以利用有机物——丙酸。
[0069]【具体实施方式】十三:本实施方式与【具体实施方式】十一的不同点是:
[0070]一、用15N标记ANAMMOX反应器内的氨氮(15NH4+-N，购自美国剑桥同位素实验室CIL)，用13C标记ANAMMOX反应器内的无机碳源(H13C03_，购自美国剑桥同位素实验室CIL)，然后厌氧氨氧化反应20小时，之后终止反应，离心分离获得微生物样品，将微生物样品放置于2.5%戊二醛磷酸盐缓冲液中固定；
[0071]其中步骤二 C中切片厚度为60nm。
[0072]本实施方式的NanoSMS图片如图5和图6所示，根据图5和图6对比可以直观清楚的看到在15N富集区域中没有形成比较明显的13C富集，说明本实施方式反应器内的ANAMMOX菌通过厌氧乙酰辅酶A途径固定二氧化碳，固碳速率较低。
[0073]通过具体实施十一至十三可以直接证明哈尔滨工业大学城市水资源与水环境国家重点实验室运行的ANAMMOX反应器内的ANAMMOX菌具有异养特性，可以利用有机物CH313COCT 与 CH3CH213COO'
【权利要求】
1.鉴定ANAMMOX反应器污泥中的ΑΝΑΜΜ0Χ菌是否利用有机物的方法，其特征在于鉴定方法按以下步骤进行: 一、用15N标记ANAMMOX反应器内的游离态氨，用13C标记ANAMMOX反应器内的有机物，然后厌氧氨氧化反应10~100小时，之后终止反应，离心分离获得微生物样品，将微生物样品放置于2.5%戊二醛磷酸盐缓冲液中固定； 二、用步骤一微生物样品制备透射电子显微镜样品，然后进行TEM观察； 三、根据步骤二TEM观察结果选择目标微生物分布均匀的位置，利用切片机切片成半薄切片，放置于导电硅片上，经固定、烘干后再次喷金覆盖，得到导电样品； 四、利用纳米二次离子质谱技术扫描步骤三制备的导电样品中的标记元素，获得NanoSIMS图片；若15N标记富集的区域中有13C明显富集，则该反应器内的ANAMMOX菌可以利用有机物；若15N标记富集的区域中没有13C富集，则该反应器内的ANAMMOX菌不能利用有机物。
2.根据权利要求1所述的鉴定ANAMMOX反应器污泥中的ANAMMOX菌是否利用有机物的方法，其特征在于步骤二透射电子显微镜样品按以下步骤制备: A、从2.5%戊二醛磷酸盐缓冲液中取出样品，然后用0.lmol/L磷酸漂洗液漂洗三次，再用1%锇酸固定液固定2~3小时,而后用0.lmol/L磷酸漂洗液漂洗三次,每次15分钟；再在4°C条件下用梯度浓度为50%、70%、90%、95%的乙醇溶液对样品依次进行脱水处理，每种浓度处理15分钟；之后再用乙醇丙酮混合液和90%的丙酮溶液分别脱水三次，每次15~20min，然后在室温下放入浓度为100%的丙酮中脱水三次，每次15~20min ； B、用纯丙酮与包埋液的混`合液对步骤A处理后的样品室温处理3~4小时，然后37°C下纯包埋液包埋2~3小时、60°C固化5小时、再80°C固化24小时； C、切片； D、用3%醋酸铀-枸橼酸铅双染色切片，即完成透射电子显微镜样品； 步骤A中乙醇丙酮混合液由浓度为90%的乙醇和浓度为90%的丙酮按1:1的体积比混合而成； 步骤B纯丙酮与包埋液的混合液中纯丙酮与包埋液的体积比为2:1。
3.根据权利要求2所述的鉴定ANAMMOX反应器污泥中的ANAMMOX菌是否利用有机物的方法，其特征在于步骤C中切片厚度为50~60nm。
4.根据权利要求1所述的鉴定ANAMMOX反应器污泥中的ANAMMOX菌是否利用有机物的方法，其特征在于步骤三中半薄切片的厚度为500~lOOOnrn。
5.根据权利要求1所述的鉴定ANAMMOX反应器污泥中的ANAMMOX菌是否利用有机物的方法，其特征在于步骤三中导电硅片为喷金的玻璃片。
6.根据权利要求1所述的鉴定ANAMMOX反应器污泥中的ANAMMOX菌是否利用有机物的方法，其特征在于步骤三中喷金覆盖厚度为8~12nm。
7.根据权利要求1所述的鉴定ANAMMOX反应器污泥中的ANAMMOX菌是否利用有机物的方法，其特征在于步骤一中厌氧氨氧化反应时间为10~50小时。
8.根据权利要求1所述的鉴定ANAMMOX反应器污泥中的ANAMMOX菌是否利用有机物的方法，其特征在于步骤一中厌氧氨氧化反应时间为15~30小时。
9.根据权利要求1所述的鉴定ANAMMOX反应器污泥中的ANAMMOX菌是否利用有机物的方法，其特征在于步骤一中厌氧氨氧化反应时间为20小时。
10.根据权利 要求1所述的鉴定ANAMMOX反应器污泥中的ANAMMOX菌是否利用有机物的方法，其特征在于步骤一中用13C标记的有机物为甲酸、乙酸、丙酸、丙酮、苯或其衍生物。
【文档编号】G01N1/28GK103822963SQ201410101312
【公开日】2014年5月28日 申请日期:2014年3月19日 优先权日:2014年3月19日
【发明者】高大文, 黄晓丽, 丛岩 申请人:哈尔滨工业大学