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用液相层析-质谱法分析体液内的氨基酸的制作方法
【专利摘要】本公开提供了对从人类患者获得的各种体液中的个体氨基酸进行定量的方法。也提供了各种体液内(例如血浆、尿、脑脊髓液和唾液)和各年龄组(例如，婴儿、幼儿、儿童和成人)正常氨基酸水平的参考范围。
【专利说明】用液相层析-质谱法分析体液内的氨基酸
[0001]本申请是分案申请，原申请的申请日为2008年6月27日、申请号为200880024878.1 (PCT/US2008/068653)、发明名称为“用液相层析-质谱法分析体液内的氨基酸”。
发明领域
[0002]本发明一般涉及氨基酸，特别是包含在生物学流体内的氨基酸的检测和分析。
[0003]背景
[0004]由于许多原因，患者体液(例如，血浆)内的氨基酸的身份和数量对于患者的健康是重要的。异常氨基酸水平能用于诊断疾病或病变。例如，低血浆氨基酸水平可以发生在患有癌症、厌食症、关节炎、毛囊炎、酗酒、胰高血糖素瘤和/或怀孕的患者体内。经历重压或抑郁的患者也可以具有低的血浆氨基酸水平。特别地，抑郁患者可能缺乏苯丙氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸、甘氨酸、色氨酸和/或牛磺酸。精神病患者可能具有低水平的氨基酸如甘氨酸、色氨酸和/或组氨酸，和升高水平的氨基酸如苯丙氨酸、酪氨酸和/或丝氨酸。
[0005]患有传染病和/或发热的患者也可以具有降低的氨基酸水平，尽管在这样的患者体内的一些氨基酸如苯丙氨酸可以以升高水平存在。肾衰竭患者可以具有低水平的氨基酸如酪氨酸、苏氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、赖氨酸和/或组氨酸。患有克罗恩病(Crohn’ s disease)、溃瘍性结肠炎、慢性疲劳综合征的患者血楽;中可以异常地具有低水平的胱氨酸和谷氨酰胺。
[0006]此外，高于正常的氨基酸水平也许是疾病状态的指示。例如，升高的血浆氨基酸水平可以在患有肝脏疾病、胰腺炎、重金属中毒、维生素C缺乏和/或维生素D缺乏的患者体内被观察到。特别地，威尔逊病(wilson’s disease)患者可以显示升高的色氨酸和组氨酸水平。患有库兴病(cushing’s disease)或痛风的患者可以显示升高的丙氨酸水平。糖尿病患者可以显示升高水平的缬氨酸、亮氨酸和/或异亮氨酸。多动儿童可以显示升高水平的酪氨酸和苯丙氨酸。槭糖尿病(Maple Syrup Urine Disease)患者血衆中可以具有升高水平的亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸。因此，分析体液如血浆中的氨基酸的方法在医学和科学情形(settings)中是有用的。
[0007]传统上，氨基酸的分析方法已经包括了衍生化步骤。在衍生化过程中，氨基酸与促进样品中的氨基酸分析的衍生化试剂发生反应。衍生化试剂通常与样品中氨基酸的游离氨基发生反应。用于衍生化氨基酸的常见试剂包括异硫氰酸酯(例如，苯基异硫氰酸酯(PITC))、邻苯二醛(OPA)、2，4-二硝基氟苯(DNFB)和N α - (2，4-二硝基-5-氟苯基)-L-丙氨酰胺(alainamide) (FDAA)。衍生化试剂是有用的，因为它们可以包括促进衍生化氨基酸的分析的取代基。例如，衍生化试剂可以包括用于UV-吸收检测的生色团或用于荧光检测的荧光团。
[0008]通过进行与质谱连接的层析如液相层析(LC)或气相层析(GC)(即，LC-MS或GC-MS)，可以分离和检测衍生化氨基酸。但是，氨基酸具有不同的化学结构(例如，碱性的、酸性的、芳香族的、极性的、非-极性的等)，并且由于可能存在于体液中的各种氨基酸在化学结构上的重大差异，这些化合物给分析者提出了解决LC-MS或GC-MS中衍生/分离的艰巨任务。
[0009]使用LC和MS检测氨基酸的方法已经被报导过，包括，例如，Casetta等人，"Development of a method for rapid quantificat1n of aminoacids by liquid chromatrography, tandem mass spectrometry"(LC-MSMS)in plasma"Clin Chem lab Med(2000)38:391-401 ;Hess 等人，"Acid hydrolysisof silk fibroins and determinat1n of the enrichment of isotopicalIylabeled amino acids using precolumn derivitizat1n and high performanceliquid chromatography-electrspray 1nizat1n mass spectrometry〃AnalB1chem(2002)311:19-26 ;Ji 等人，"Determinat1n of phenethyl isoth1cyanatein human plasma and urine by ammonia derivatizat1n and liquidchromatography-tandem mass spectrometry^AnaI B1chem(2003) 323:39-47 ；VanEijik 等人，"Determinat1n of amino acid isotope enrichment using liquidchromatography-mass spectrometry^(1999)Anal B1chem271:8-17 ;和 Liu 等人，^Derivitizat1n of amino acids with N,N-dimethyl-2, 4-dinitro-5-fluorobenzylamine for liquid chromatography/electrospray 1nizat1n mass spectrometry^(2004)Rapid Commun Mass Spectroml8:1059-65。检测体液内氨基酸的改进方法是令人期望的。
[0010]发明概述
[0011]公开的是检测可能存在于个体的体液内的各种个体氨基酸的方法。体液内的个体氨基酸的检测可以用于确定体液是否包含异常的一个或多个氨基酸。一方面，该方法包括衍生化体液氨基酸，通过液相层析(LC)分离衍生化氨基酸，用质谱(MS)分析鉴定衍生化氨基酸，以及通过与来自一系列氨基酸标准物的结构上相近的氨基酸的比较来量化衍生化氨基酸。优选地,MS不同于串联MS，其包括，例如，单一 MS。结构上相似的氨基酸共有重要的结构特征如关键的官能团，以便使用质谱法鉴定一个氨基酸能够以同样的方法用于鉴定其它结构上相似的氨基酸。通过在处理之前添加一系列个体氨基酸标准物到体液中，该系列个体氨基酸标准物优选地用作一系列内标。
[0012]适合的体液包括，例如，血浆、血清、唾液、尿液和脑脊髓液(CSF)。对于检测、鉴定和/或量化血浆中个体氨基酸的方法，其水平可以与表1中提供的参考范围相比较。落在表1的参考范围之外的血浆氨基酸水平可以被鉴定为异常。对于检测、鉴定和/或量化尿液中个体氨基酸的方法，其水平可以与表2中提供的参考范围相比较。落在表2的参考范围之外的尿液氨基酸水平可以被鉴定为异常。对于检测、鉴定和/或量化CSF中个体氨基酸的方法，其水平可以与表3中提供的参考范围相比较。处于表3的参考范围之外的CSF氨基酸水平可以被鉴定为异常。对于检测、鉴定和/或量化唾液中个体氨基酸的方法，其水平可以与表4中提供的参考范围相比较。处于表4的参考范围之外的唾液氨基酸水平可以被鉴定为异常。在一些实施方式中，每个氨基酸的参考范围基于对象(即，婴儿、幼儿、儿童或成人)的年龄而不同。
[0013]该系列标准物可以是非-衍生化的，并在衍生化之前添加到初始体液中或任何后处理步骤中。在优选的实施方式中，该标准物包含个体氘化氨基酸(即，包含一个或多个氘离子的单个氨基酸)。该系列标准物也可以在衍生化步骤之后添加到体液氨基酸中。在这种情况下，添加的标准物应该以与体液氨基酸同样的方式被衍生化。在一种方法中，该氨基酸用异硫氰酸酯(例如，苯基异硫氰酸酯(PITC))衍生化。在优选的实施方式中，衍生化试剂是PITC。其它适合的衍生化试剂可以包括邻苯二醛(OPA)、2，4-二硝基氟苯(DNFB)和N α - (2，4- 二硝基-5-氟苯基)-L-丙氨酰胺(FDAA)。
[0014]每个来自一定量体液的鉴定的氨基酸的数量，能通过将其质谱信号与已知数量的结构相似的氨基酸的信号相比较来确定。然后体液中氨基酸的数量可以相对于分析的体液的体积表示，以获得原始体液内氨基酸的浓度。定量分析优选地用内标进行。
[0015]在一些实施方式中，在进一步分析之前，体液可以被处理以获得具有浓缩的氨基酸浓度的部分。在一种方法中，获得了体液的低分子量部分(例如，使体液通过分子量滤器获得)。
[0016]在一个实施方式中，该方法可以用于检测至少20个不同的个体氨基酸。在其它实施方式中，该方法可以用于检测至少25、30、35或40个个体氨基酸。
[0017]例如，该方法可以用于检测和/或量化个体氨基酸的任何组合，所述个体氨基酸包括但不限于:磷酸丝氨酸、磺酸-半胱氨酸、精氨琥珀酸、羟脯氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、丝氨酸、磷酸乙醇胺(ΡΕΑ)、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、肌氨酸、牛磺酸、肌肽、瓜氨酸、精氨酸、鹅肌肽、1-甲基-组氨酸、3-甲基-组氨酸、α -氨基-己二酸(AAD)、苏氨酸、丙氨酸、丙氨酸(BALA)、脯氨酸、乙醇胺、Y-氨基-丁酸(GABA)、β -氨基-异丁酸(BAIB)、α -氨基-丁酸(AAB)、半胱氨酸、酪氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、L-别-胱硫醚(胱硫醚-A)、L-胱硫醚(胱硫醚-B)、胱氨酸、异亮氨酸、别-异亮氨酸、亮氨酸、DL-羟赖氨酸(羟赖氨酸(I))、DL-别-羟赖氨酸(羟赖氨酸(2))、苯丙氨酸、鸟氨酸、色氨酸、高胱氨酸、精氨琥珀酸(ASA)、赖氨酸和Hawkinsin ((2-L-半胱氨酸-S-基-1，4- 二羟基环己-5-烯-1-基)-乙酸)。此外，基于任何检测到的体液内个体氨基酸的水平，该方法可以用于诊断疾病状态。
[0018]在一个实施方式中，该方法可以用于检测和/或量化个体氨基酸的任何组合，所述氨基酸包括但不限于:天冬氨酸、ASA、S-半胱氨酸、谷氨酸、OH-脯氨酸、丝氨酸、天冬酰胺、PEA、AAD、甘氨酸、谷氨酰胺、肌氨酸、组氨酸、β -丙氨酸、牛磺酸、瓜氨酸、肌肽、苏氨酸、精氨酸、鹅肌肽、1-甲基-组氨酸、3-甲基-组氨酸、丙氨酸、GABA、ΒΑΙΒ、脯氨酸、乙醇胺、ΑΑΒ、酪氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、胱硫醚Α、胱硫醚B、胱氨酸、异亮氨酸、别-异亮氨酸、亮氨酸、羟基-赖氨酸-1、羟基-赖氨酸_2、高胱氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、鸟氨酸和赖氨酸。
[0019]在另一个实施方式中，该方法可以用于检测和/或量化个体氨基酸的任何组合，所述氨基酸包括但不限于:羟脯氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、丝氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、肌氨酸、牛磺酸、瓜氨酸、精氨酸、1，3-甲基-组氨酸、α -氨基-己二酸、苏氨酸、丙氨酸、丙氨酸、脯氨酸、乙醇胺、Y-氨基-丁酸、氨基-异丁酸、α-氨基-丁酸、酪氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、L-胱硫醚、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、鸟氨酸、色氨酸、高胱氨酸和赖氨酸。
[0020]仍在另一个实施方式中，该方法可以用于检测和/或量化个体氨基酸的任何组合，所述氨基酸包括但不限于:羟脯氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、丝氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、肌氨酸、牛磺酸、瓜氨酸、精氨酸、1，3-甲基-组氨酸、α -氨基-己二酸、苏氨酸、丙氨酸、丙氨酸、脯氨酸、乙醇胺、Y-氨基-丁酸、氨基-异丁酸、α-氨基-丁酸、酪氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、L-胱硫醚、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、鸟氨酸、色氨酸、高胱氨酸、赖氨酸、胱氨酸和羟赖氨酸。
[0021]仍在另一个实施方式中，该方法可以用于检测和/或量化个体氨基酸的任何组合，所述氨基酸包括但不限于:羟脯氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、丝氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、肌氨酸、牛磺酸、瓜氨酸、精氨酸、α-氨基-己二酸、苏氨酸、丙氨酸、β-丙氨酸、脯氨酸、Y -氨基-丁酸、β -氨基-异丁酸、α -氨基-丁酸、酪氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、鸟氨酸、色氨酸、高胱氨酸和赖氨酸。
[0022]在一个实施方式中，该方法可以用于检测和/或量化个体氨基酸的任何组合，所述氨基酸包括但不限于:磷酸丝氨酸、磺酸-半胱氨酸、精氨琥珀酸、羟脯氨酸、天冬氨酸、磷酸乙醇胺、肌氨酸、肌肽、鹅肌肽、1，3-甲基-组氨酸、α-氨基-己二酸、丙氨酸、脯氨酸、乙醇胺、Y -氨基-丁酸、β -氨基-异丁酸、半胱氨酸、L-别-胱硫醚-A、L_胱硫醚、胱氨酸、别-异亮氨酸、DL-羟赖氨酸、DL-别-羟赖氨酸和高胱氨酸。
[0023]在另一个实施方式中，该方法可以用于检测和/或量化个体氨基酸的任何组合，所述氨基酸包括但不限于:磷酸丝氨酸、磺酸-半胱氨酸、精氨琥珀酸、羟脯氨酸、天冬氨酸、磷酸乙醇胺、肌氨酸、肌肽、鹅肌肽、1，3-甲基-组氨酸、α -氨基-己二酸、β -丙氨酸、脯氨酸、乙醇胺、Y -氨基-丁酸、β -氨基-异丁酸、半胱氨酸、L-别-胱硫醚-A、L-胱硫醚、胱氨酸、DL-羟赖氨酸、DL-别-羟赖氨酸和高胱氨酸。在进一步的实施方式中，该方法可以用于鉴别半胱氨酸、磷酸丝氨酸或精氨琥珀酸中的任一种。
[0024]在进一步的实施方式中，该方法可以用于检测和/或量化个体氨基酸的任何组合，所述氨基酸包括但不限于:磷酸丝氨酸、磺酸-半胱氨酸、精氨琥珀酸、羟脯氨酸、磷酸乙醇胺、肌氨酸、肌肽、鹅肌肽、1，3-甲基-组氨酸、α -氨基-己二酸、β -丙氨酸、脯氨酸、乙醇胺、Y -氨基-丁酸、β -氨基-异丁酸、半胱氨酸、L-别-胱硫醚-A、L-胱硫醚、胱氨酸、别-异亮氨酸、DL-羟赖氨酸、DL-别-羟赖氨酸和高胱氨酸。
[0025]在进一步的实施方式中，该方法可以用于检测和/或量化个体氨基酸的任何组合，所述氨基酸包括但不限于:磷酸丝氨酸、磺酸-半胱氨酸、精氨琥珀酸、羟脯氨酸、磷酸乙醇胺、肌氨酸、肌肽、鹅肌肽、1，3-甲基-组氨酸、α -氨基-己二酸、乙醇胺、Y -氨基-丁酸、β -氨基-异丁酸、L-别-胱硫醚-A、L_胱硫醚、胱氨酸、别-异亮氨酸、DL-羟赖氨酸、DL-别-羟赖氨酸和高胱氨酸。
[0026]在进一步的实施方式中，该方法可以用于检测和/或量化个体氨基酸的任何组合，所述氨基酸包括但不限于:磷酸丝氨酸、半胱氨酸、精氨琥珀酸、羟脯氨酸、磷酸乙醇胺、肌氨酸、肌肽、鹅肌肽、1，3-甲基-组氨酸、α-氨基-己二酸、乙醇胺、Y-氨基-丁酸、β -氨基-异丁酸、L-别-胱硫醚-A、L-胱硫醚、胱氨酸、DL-羟赖氨酸、DL-别-羟赖氨酸和高胱氨酸。
[0027]在其它实施方式中，该方法量化至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少七个、至少十个、至少十五个、至少二十个、至少二十五个或至少三十个或更多个个体氨基酸。
[0028]该公开的方法可以用作诊断或监测对多种已知与异常个体氨基酸(S卩，除二肽和多肽之外的单个氨基酸)水平有关的疾病的治疗效果的基础。例如，亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、赖氨酸和/或组氨酸的水平可以用于诊断和/或监控肾衰竭；胱氨酸和/或谷氨酰胺可以用于诊断和/或监控克罗恩病、溃疡性结肠炎和/或慢性疲劳综合征；色氨酸和/或组氨酸可以用于诊断和/或监控威尔逊病；丙氨酸可以用于诊断和/或监控库兴病或痛风；缬氨酸、亮氨酸和/或异亮氨酸可以用于诊断和/或监控糖尿病和/或槭糖尿病；酪氨酸和/或苯丙氨酸可以用于诊断和/或监控机能允进失调(hyperactivity disorder);和hawkinsin可以用于诊断和/或监控乙酸尿(霍金斯素尿症，hawkinsinuria)。
[0029]可以用任何类型的、如商业上可得的LC系统来进行衍生化氨基酸的LC分离。适合的LC柱是具有包含微小颗粒(例如，具有直径大约为2-5 μ m,优选地大约为3 μ m的二氧化硅颗粒)的填装材料的柱子。颗粒通常具有大约50到300埃，并且优选地大约为150埃的孔。颗粒通常具有大约50-600m2/g的表面积，优选地大约100m2/g的表面积。
[0030]颗粒可以包括连接在其表面的疏水固定相。在一个实施方式中，疏水固定相可以是烧基相，其可以包括C_4、C-8和C_18(优选地是C-18)。
[0031]柱子可以具有任何适当的尺寸。优选地，柱子具有的直径大约为0.5毫米到大约5毫米，并且长度大约为15毫米到大约300毫米，并且最优选地，直径大约2毫米，长度大约50晕米。
[0032]衍生化氨基酸的LC分离也可以用疏水溶剂或梯度中包括疏水溶剂的溶剂混合物作为流动相来进行以洗脱氨基酸。在一个实施方式中，衍生化部分可以被施加到水性缓冲液(即，亲水溶剂)中的柱子上，并且可以通过施加流动相到具有渐增数量的有机溶剂(即，疏水溶剂)的柱子中来洗脱氨基酸。例如，水性缓冲液可以包括(95%7jC，5%乙腈)，且可以通过逐渐增加流动相中乙腈的浓度到大约100%，从柱子上洗脱氨基酸。如果期望，流动相可以被加热到温度大约为40-60°C，优选地大约为50°C。此外，流动相可以任选地包括一个或多个在LC和/或MS期间有用的额外试剂。例如，乙酸铵或乙酸。
[0033]衍生化氨基酸的MS分析可以通过样品的电离来进行。适合的电离技术包括电喷雾电离(electrospray 1nizat1n) (ESI)、大气压化学电离(APCI)、光电离(photoinonizat1n)、电子电离、快速原子轰击(FAB)/液相二次电离(liquid secondary1nizat1n) (LSIMS)、基质辅助激光解吸电离(MALDI)、场电离、场解吸、热喷雾/等离子喷镀电离和粒子束电离。优选地，使用ESI进行MS。进一步地，可以用阴离子或阳离子模式进行MS，优选地是阴离子模式。
[0034]衍生化氨基酸的MS分析可以用几种类型的离子分析器中的任一种进行，所述离子分析器包括四极分析器、离子阱分析器和时间飞行分析器。优选地，可以使用四极分析器进行MS。可以通过使用包括选择性离子检测模式(SIM)和扫描模式在内的几种检测模式对MS期间产生的离子进行检测。优选地，用SM检测离子。MS优选地不是串联MS。
[0035]也提供的是诊断个体内代谢失调——包括氨基酸代谢——的存在的方法。该方法包括通过下述步骤确定体液是否包含异常水平的一个或多个氨基酸:首先(a)衍生化体液氨基酸；(b)用液相层析(LC)分离衍生化氨基酸；(C)使用质谱仪，对分离的衍生化氨基酸进行质谱分析(MS);和(d)通过与来自一系列氨基酸标准物的结构相似的氨基酸相比照，使用MS分析来鉴定来自体液的衍生化氨基酸的量。该方法的各种实施方式与那些已经讨论过的相似。
[0036]附图简述
[0037]图1是显示用本文描述的方法检测和量化的各种氨基酸的表。第三列显示MT分子量”；第四列显示PITC分子量；第五列显示每种PITC衍生化氨基酸的分子量；第六列是LC保留时间；第七列显示观察到的质谱离子。
[0038]图2显示了包含指定氨基酸的单个样品的在LC分离之前的MS分析结果。指出了每个氨基酸的离子尺寸特征。
[0039]优选实施方式详述
[0040]如本文所用的，“氨基酸”是指含有共价地连接氨基和酸基的α -碳原子的任何分子。酸基可以包括羧基。“氨基酸”可以包含具有下式之一的分子:
[0041]
【权利要求】
1.一种定量来自人个体的体液样品中一种或多种游离氨基酸水平的方法，包含: (a)衍生化所述样品内的一种或多种游离氨基酸； (b)通过液相层析法(LC)分离该一种或多种衍生化游离氨基酸；和 (c)用质谱法(MS)分析，定量来自步骤(b)的一种或多种衍生化游离氨基酸。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述一种或多种氨基酸包括选自下列的至少一种:磷酸丝氨酸、磺酸-半胱氨酸、磷酸乙醇胺、肌肽、鹅肌肽、1，3-甲基-组氨酸、L-别-胱硫醚4、和DL-别-羟赖氨酸、精氨琥珀酸、羟脯氨酸、天冬氨酸、肌氨酸、α -氨基-己二酸、β-丙氨酸、脯氨酸、乙醇胺、Y-氨基-丁酸、氨基-异丁酸、半胱氨酸、L-胱硫醚、别-异亮氨酸、DL-羟赖氨酸、高胱氨酸、苏氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、赖氨酸、胱氨酸、谷氨酰胺、色氨酸、组氨酸、丙氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸和hawkinsin。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述一种或多种游离氨基酸包括选自下列的至少一种:酪氨酸、苏氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、赖氨酸和组氨酸。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述一种或多种游离氨基酸包括选自下列的至少一种:胱氨酸和谷氨酰胺。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述一种或多种游离氨基酸包括选自下列的至少一种:色氨酸和组氨酸。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述一种或多种游离氨基酸包括丙氨酸。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述一种或多种游离氨基酸包括选自下列的至少一种:酪氨酸和苯丙氨酸。
8.根据权利要求1所述的方法，其中至少一种游离氨基酸用苯基异硫氰酸酯(PITC)、邻苯二醒(OPA)、2，4- 二硝基氟苯(DNFB)或Na (2, 4- 二硝基_5_氟苯基)_L_丙氨酰胺(FDAA)衍生化。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述一种或多种游离氨基酸包括hawksinsin。
10.一种定量人个体体液内一种或多种游离氨基酸的方法，包括: (a)衍生化所述体液内的一种或多种游离氨基酸，其中所述一种或多种游离氨基酸包括选自下列的至少一种:磷酸丝氨酸、磺酸半胱氨酸、磷酸乙醇胺、肌肽、鹅肌肽、1，3-甲基-组氨酸、L-别-胱硫醚-A和DL-别-羟赖氨酸；(b)通过液相层析法(LC)分离所述一种或多种衍生化游离氨基酸； (c)用质谱法(MS)分析，定量来自步骤(b)的所述一种或多种衍生化游离氨基酸。
11.一种定量人个体体液中一种或多种游离氨基酸水平的方法，所述方法包括: (a)衍生化所述体液内的一种或多种游离氨基酸，其中该一种或多种衍生化游离氨基酸包括选自下列的至少一种:磷酸丝氨酸、磺酸-半胱氨酸、精氨琥珀酸、羟脯氨酸、天冬氨酸、磷酸乙醇胺、肌氨酸、肌肽、鹅肌肽、1，3-甲基-组氨酸、α -氨基-己二酸、β -丙氨酸、脯氨酸、乙醇胺、Y -氨基-丁酸、β -氨基-异丁酸、半胱氨酸、L-别-胱硫醚-A、L-胱硫醚、胱氨酸、别-异亮氨酸、DL-羟赖氨酸、DL-别-羟赖氨酸和高胱氨酸； (b)通过液相层析法(LC)分离所述一种或多种衍生化游离氨基酸； (c)使用质谱法(MS)分析，定量来自步骤(b)的所述一种或多种衍生化游离氨基酸。
12.—种定量人个体唾液或脑脊髓液内一种或多种游离氨基酸的方法，包括: (a)衍生化所述唾液或脑脊髓液内的一种或多种游离氨基酸；(b)通过液相层析法(LC)分离所述一种或多种衍生化游离氨基酸；和 (c)使用质谱法(MS)分析，定量来自步骤(b)的一种或多种衍生化游离氨基酸。
13.一种定量人个体唾液或脑脊髓液中一种或多种游离氨基酸水平的方法，包括: (a)衍生化所述唾液或脑脊髓液内的游离氨基酸； (b)通过液相层析法(LC)分离衍生化游离氨基酸；和 (c)使用质谱法(MS)分析 ，通过与一系列游离氨基酸标准物进行比较，来定量来自步骤(b)的一种或多种衍生化游离氨基酸。
14.根据权利要求1-13中任一项所述的方法，其中量化至少20种衍生化游离氨基酸。
15.根据权利要求1-13中任一项所述的方法，其中量化至少22种衍生化游离氨基酸。
【文档编号】G01N30/02GK104076100SQ201410136266
【公开日】2014年10月1日 申请日期:2008年6月27日 优先权日:2007年6月29日
【发明者】S·戈尔德曼 申请人:奎斯特诊断投资公司