一种检测hev抗体的方法及试剂盒和该试剂盒的制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种检测HEV抗体的方法及试剂盒和该试剂盒的制备方法，本发明采用双标记时间分辨荧光免疫分析技术，解决了以往的HEV?IgG抗体和IgM抗体需单个检测或联合检测时不能区分IgG抗体和IgM抗体的难点；实现了微量化检测HEV?IgG抗体和IgM抗体；采用对患者血清中的HEV?IgG抗体和IgM抗体的联合检测,还可以提高HEV的临床检出率,有助于疾病的诊断与预防；所述试剂盒的抗原包含了多个主要抗原表位，能在最大程度上降低漏检情况的发生。本发明的试剂盒具有检测结果准确性、灵敏度高、特异性强、稳定性好、检测方法简便、高效等特点。
【专利说明】一种检测HEV抗体的方法及试剂盒和该试剂盒的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种检测戊型肝炎病毒抗体的方法及试剂盒，具体涉及一种基于双标 记时间分辨荧光免疫法检测戊型肝炎病毒抗体的方法及试剂盒和该试剂盒的制备方法。
【背景技术】
[0002] 戊型病毒性肝炎是由戊型肝炎病毒（HEV)引起的，以肝实质细胞炎性坏死为主的 肠道传播性疾病。患者主要为成年人，病死率较高，尤其孕期最后3个月的妊娠妇女患病 后，病死率可达10%?39%。戊型病毒性肝炎，首先在印度次大陆发现，中亚、东南亚、非 洲、印度次大陆均有较大流行的报道。多数爆发流行为水源性的。食源性的报道亦见诸文 献。我国人群戊型肝炎的感染率约18%。急性散发性肝炎中戊肝约占10%，是我国乙类法 定传染病之一。
[0003] HEV最初曾被划分为杯状病毒科，2005年国际病毒学分类委员会（ICTV)将其单独 门类为戊型肝炎病毒属（hepevirus)，将与人类疾病相关的HEV分为4个基因型（HEV-1? 4)。但仅有1个血清型。HEV-1是发展中国家戊型肝炎暴发流行及散发流行的主要病 因，HEV-2仅在南美洲和非洲少数国家中有报道，而发达国家的本土戊型肝炎病例主要由 HEV-3或HEV-4导致。迄今在我国戊型肝炎患者中仅发现HEV-1和HEV-4。
[0004] 戊型肝炎潜伏期2?9周，平均约40d。根据流行病学史、临床症状和体征及实验 室检查结果，并结合患者具体情况及动态变化进行综合分析，做出诊断。
[0005] HEV急性感染的诊断指标包括：抗-HEV IgM阳性；抗-HEV IgG阳转或含量有4倍 及以上升高；血清和（或）粪便HEV RNA阳性。一般情况下这3项指标的任何一项阳性都 可作为HEV急性感染的临床诊断依据，如同时有2项指标阳性则可确诊。（1)抗-HEV IgM 阳性戊型肝炎临床症状出现时绝大部分已可检出IgM抗体，并且在3个月内快速消退，但少 数患者在6个月后仍可检出较低水平的IgM抗体。因此，当抗-HEV IgM水平较低时（检 测值低于试剂盒临界值的2倍），还应结合抗-HEV IgG水平及其动态变化、HEV RNA检测 结果、患者自身所处的免疫功能状态等进行综合判断。（2)抗-HEV IgG阳转或含量有4倍 及以上升高，这一指标需定量检测双份血清，不利于早期诊断。由于HEV感染的潜伏期相 对较长，在患者就诊时IgG抗体常已阳转并达到较高水平，限制了这一指标的诊断实用性。 (3)血清和（或）粪便HEV RNA阳性HEV RNA的检出是HEV现症感染的直接证据。但考虑 到目前HEV RNA的检测主要采用RT-PCR的方法，易因操作不当或环境条件不佳而造成假阳 性。因此在HEV RNA阳性时，还需结合血清抗-HEV IgM、抗-HEV IgG水平或动态变化等进 行综合判断。在戊型肝炎临床症状开始的1?2周内，70%?80%患者的粪便、血清中可检 出HEV RNA，随后阳性率显著下降。由于HEV感染的潜伏期相对较长，20%?30%的患者在 发病时体内HEV已基本被清除，因此HEV RNA阴性并不能排除HEV急性感染。在一般临床 实践和研究中，抗-HEV IgG的检测结果因试剂和方法的不同会有较大差异，而且单份血清 IgG检测阳性难以区分急性感染和既往感染，因此除非能比较双份血清的动态变化，一般不 宜作为HEV急性感染的诊断依据。国内外依赖于构象性抗原研制的抗-HEV IgM检测试剂 已较成熟，抗-HEV IgM已成为临床上最主要的HEV急性感染诊断指标，IgM抗体阳性且IgG 抗体阳性一般即可诊断；若IgM抗体阴性而患者处于发病早期则需进行动态观察；在个别 情况下IgM抗体阳性但IgG抗体阴性，也需进行动态观察。采用对患者血清中的HEV抗体 (IgG+IgM)的联合检测，还可以提高HEV的临床检出率，有助于疾病的诊断与预防。
[0006] 戊型肝炎在全球各地还存在不同程度爆发和散发流行，但随着流行病学不断深入 的调查和积极的干预措施，提高人们对戊型肝炎的认识。以及临床检测手段的不断提高，将 更有助于降低戊型肝炎的患病率，提高人们的生活质量。
[0007] 研究表明，提高HEV诊断价值的首要因素是抗原位点的选择，HEV抗原表位主要分 布在0RF2和0RF3,理想的诊断试剂应包含0RF2及0RF3主要抗原表位，大部分HEV抗体阳 性血清既能和0RF2重组抗原反应，也能和0RF3合成肽反应。有少部分血清仅针对0RF2或 0RF3区抗原呈单阳性反应。其中较大的0RF2区编码膜结构蛋白，含有较多的抗原表位，而 且相应抗体的半衰期较长，因而用于ELISA诊断的敏感性高。在以往的研究中，对0RF3区 蛋白的研究不如0RF2,但0RF3区蛋白也包含了多个线性抗原表位，在机体免疫反应中起了 重要作用。为提高重组蛋白与合成肽抗原在HEV检测中的诊断价值，应尽可能多地保留各 种毒株的高效抗原表位，从而减少变异株所致的HEV检测中漏检的可能。合成肽抗原是通 过固相合成的方法制备，无需纯化，由于没有宿主菌蛋白混杂，且分子量�。峁辜虻ィ苊� 了与其他抗体发生交叉反应的可能，因而特异性高；但由于合成肽一般肽链比较短，包含的 抗原位点较少，影响了阳性的检出率。目前，商品化的试剂盒分别以0RF2部分片段重组蛋 白（如北京万泰试剂盒）、以0RF2片段为模板序列合成的多肽和0RF3重组蛋白的混合抗原 (如Genelabs试剂盒）和合成肽（如上�？苹约梁校┪乖�
[0008] 目前抗-HEV常用方法有放射免疫分析法（radioimmunoassay, RIA)、酶 联免疫吸附测定法（enzyme-linked immunosorbent assay， ELISA)、化学发光 免疫分析法（chemiluminescent immunoassay, CLIA)、电化学发光免疫分析法 (electro-chemiluminescence immunoassay，ECLI)等。RIA 由于放射性污染，对环境和 操作者影响较大，批内批间变异较大，难于自动化；ELISA采用大分子酶标记，且酶容易 失活，这种依靠比色法或偏振光法的检测技术所受的干扰因素太多（即使是优秀的"管 式ELISA"，其试管形状的变化也会影响试验的结果），其灵敏度、线性和稳定性未能高于 RIA ;CLIA的化学发光通常是瞬间完成，发光峰值很快衰减，温度和pH值对发光有很大影 响，该类因素影响了该类方法的应用；ECLI仍为非开放系统，试剂依赖进口，试剂昂贵， 维修及检测成本高，这也限制了其推广应用。由于时间分辨荧光免疫法（time-resolved fluoroisnmunoassay，TRFIA)独特的技术原理，有区别于传统的免疫标记技术的特点和优 势，已被人们广泛接受，与现在广泛使用的RIA、ELISA、CLIA和ECLI相比，TRFIA克服了 RIA 放射性污染的不足、酶标记物的不稳定性和定量范围窄的缺陷、化学发光仅能一次发光、一 般荧光标记受环境干扰的难点和ECLI的非直接标记等缺点，Eu标记TRFIA的灵敏度可达 l(T19m〇l/L，应用范围广，致使其试剂盒的生产和检测仪器的更新换代进展甚速，目前已实 现了分析技术的自动化，TRFIA已成为生物医学研究和临床超微量生化检验中一项最有发 展前景的分析手段。
【发明内容】
[0009] 本发明的目的在于克服现有技术存在的不足之处而提供了一种基于双标记时间 分辨荧光免疫法检测戊型肝炎病毒抗体的试剂盒，以及所述试剂盒的制备方法，本发明还 提供了一种采用所述试剂盒检测HEV抗体的方法。
[0010] 为实现上述目的，所采取的技术方案：一种检测戊型肝炎病毒抗体的试剂盒，所述 试剂盒包括：包被有HEV抗原的固相载体，与HEV抗体结合的镧系元素标记的检测抗体，校 准品，样本稀释液，实验缓冲液，浓缩洗液以及增强液。
[0011] 优选地，所述包被有抗原的固相载体中抗原为含有0RF2和0RF3抗原表位的HEV 重组抗原。
[0012] 优选地，所述包被有HEV抗原的载体是采用以下步骤制备而得的：
[0013] 将HEV抗原用包被缓冲液稀释，在固相载体上进行包被，将固相载体洗涤1次，然 后再用封闭液进行封闭，将固相载体甩干，晾干，真空包装，2?8°C保存备用。
[0014] 优选地，所述与HEV抗体结合的镧系元素标记的检测抗体为Eu3+标记的鼠抗人IgG 抗体和Sm3+标记的鼠抗人μ链抗体的组合。当所述与HEV抗体结合的镧系元素标记的检 测抗体为Eu 3+标记的鼠抗人IgG抗体和Sm3+标记的鼠抗人μ链抗体的组合时，所述Eu3+标 记的鼠抗人IgG抗体和所述Sm 3+标记的鼠抗人μ链抗体在本发明所述试剂盒中是分开储 存的，在使用时再联合加入。
[0015] 优选地，所述Eu3+标记的鼠抗人IgG抗体是参照Eu3+标记试剂盒说明书操作而制 备的，所述Sm 3+标记的鼠抗人μ链抗体是参照Sm3+标记试剂盒说明书操作而制备的。
[0016] 本发明还提供了一种采用上述所述试剂盒检测HEV抗体的方法，所述方法包括以 下步骤：
[0017] (1)用实验缓冲液配制与HEV抗体结合的镧系元素标记的检测抗体；
[0018] (2)用纯化水将浓缩洗液稀释成工作洗涤液；
[0019] (3)将待检样本用样本稀释液稀释，将校准品或已稀释待检样本加入到包被有 HEV抗原的固相载体中；
[0020] (4)固相载体在室温下孵育；
[0021] (5)用步骤（2)中工作洗涤液洗涤抗原固相载体；
[0022] (6)加入步骤（1)中配制的与HEV抗体结合的镧系元素标记的检测抗体，在室温下 孵育；
[0023] (7)用步骤⑵中工作洗涤液洗涤抗原固相载体；
[0024] (8)加入增强液，继续孵育；
[0025] (9)孵育结束后，采用对应的荧光标记窗口检测程序进行检测并分析。
[0026] 优选地，所述步骤（1)中与HEV抗体结合的镧系元素标记的检测抗体为Eu3+标记 的鼠抗人IgG抗体和Sm 3+标记的鼠抗人μ链抗体的组合。
[0027] 优选地，所述步骤（3)中包被有抗原的固相载体中抗原为含有0RF2和0RF3抗原 表位的HEV重组抗原。
[0028] 本发明还提供了一种上述所述试剂盒的制备方法，所述方法包括以下步骤：
[0029] (1)制备包被有HEV抗原的固相载体；
[0030] ⑵制备校准品；
[0031] (3)制备与HEV抗体结合的镧系元素标记的检测抗体；
[0032] (4)制备样本稀释液、实验缓冲液、浓缩洗液以及增强液；
[0033] (5)贴标签；
[0034] (6)组装为试剂盒。
[0035] 本发明的有益效果在于：目前，商品化的试剂盒所采用的诊断抗原多以HEV0RF3 表达蛋白与合成肽的混合抗原，或单以HEV 0RF2部分片段的表达蛋白，由于抗原表位的不 全，在HEV临床诊断过程中常发生漏检现象。本发明提供的检测试剂盒的重组蛋白抗原包 含了 0RF2片段和0RF3全片段，含有多个主要抗原表位，能在最大程度上降低漏检情况的发 生，克服了以合成多肽作为抗原的检测试剂的弱点，提高了检测试剂的敏感性，0RF3C端和 0RF2C端被认为是抗原性较强的区域，对抗原决定簇的研究多数是针对这两个区域开展的。 本发明采用双标记时间分辨荧光免疫分析技术，解决了以往的HEV IgG抗体和IgM抗体需 单个检测或联合检测时不能区分IgG抗体和IgM抗体的难点；本发明实现了一个微孔检测 能分别检测出HEV IgG抗体和IgM抗体，也实现了试剂盒能同时定量检测HEV IgG抗体和 IgM抗体；将试剂盒溯源至国家标准血清物质，实现了 HEV IgG抗体和IgM抗体检测结果的 溯源性；利用了时间分辨荧光免疫分析技术的高灵敏和高特异的独特技术原理，实现了微 量化检测HEV IgG抗体和IgM抗体，采用对患者血清中的HEV IgG抗体和IgM抗体的联合 检测，还可以提高HEV的临床检出率，有助于疾病的诊断与预防。本发明的试剂盒具有检 测结果准确性高、灵敏度高、特异性强、稳定性好、检测方法简便、高效等特点。
【专利附图】
【附图说明】
[0036] 图1为采用本发明所述试剂盒检测本发明所述试剂盒中校准品时校准品中 HEVIgG抗体的标准曲线图；
[0037] 图2为采用本发明所述试剂盒检测本发明所述试剂盒中校准品时校准品中 HEVIgM抗体的标准曲线图；
[0038] 图3为采用本发明所述试剂盒检测企业HEV IgG抗体参考品时的剂量-反应曲线 图；
[0039] 图4为采用本发明所述试剂盒检测企业HEV IgM抗体参考品时的剂量-反应曲线 图。
【具体实施方式】
[0040] 为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明 作进一步说明。实施例中的HEV重组抗原、鼠抗人IgG抗体、鼠抗人μ链抗体购于Sigma 公司；固相载体为96孔微孔空白板（8X12孔）购于深圳市金灿华实业有限公司；铕 (Eu3+)与杉（Sm 3+)标记试剂盒购于芬兰Wallac公司；琼脂糖凝胶Sepharose CL-6B购于 瑞典Pharmacia公司；HEV IgG抗体标准物质[GBW(E)090091]和HEV IgM抗体标准物质 [GBW(E)090089]为北京康彻思坦生物技术有限公司提供；HEV IgG抗体参考品和HEV IgM 抗体参考品为中国食品药品检定研究院提供；参比试剂盒为戊型肝炎病毒IgG抗体诊断试 剂盒（酶联免疫法）和戊型肝炎病毒IgM抗体检测试剂盒（酶联免疫法），由北京万泰生 物药业股份有限公司提供；第三方验证试剂盒为由意大利Dia. Pro Diagnostic Bioprobes S.r.l.公司提供的戊型肝炎病毒IgG、IgM抗体检测试剂盒（酶联免疫法），以及由北京金 豪制药股份有限公司提供的戊型肝炎病毒RNA检测试剂盒（FQ-PCR法）。增强液、浓缩洗 液、实验缓冲液、FWZ- I型微量振荡仪、DEM-III型全自动酶标洗板均由广州市丰华生物工 程有限公司提供。VictorTM2D1420型TRFIA仪购于美国Perkin Elmer公司。其他试剂为 国产分析纯。
[0041] 实施例1
[0042] 本发明所述检测戊型肝炎病毒抗体的试剂盒的一种实施例，所述试剂盒包括：包 被有HEV重组抗原的固相载体，Eu 3+标记的鼠抗人IgG抗体，Sm3+标记的鼠抗人μ链抗体，校 准品、样本稀释液、实验缓冲液、浓缩洗液以及增强液；所述HEV重组抗原含有0RF2和0RF3 抗原表位。
[0043] 本发明还提供了上述所述检测戊型肝炎病毒抗体的试剂盒的制备方法，所述方法 包括以下步骤：
[0044] (1)制备包被有抗原的固相载体：将HEV重组抗原用包被缓冲液稀释0. 1? 10 μ g/mL，在固相载体上进行包被，将固相载体洗涤1次，然后再用封闭液进行封闭，将固 相载体甩干，晾干，真空包装，2?8°C保存备用。优选地，所述包被缓冲液为50mmol/L、 pH9. 6的碳酸缓冲液，20mmol/L、pH4. 5的磷酸盐缓冲液，50mmol/L、pH7. 8的Tris-HCl缓冲 液和50mmol/L、pH4. 5的柠檬酸盐缓冲液中的一种，所述封闭液为含1%重量BSA和5%重 量鹿糖的50mmol/L、ρΗ7· 8的Tris-HCl缓冲液。
[0045] (2)制备所述Eu3+标记的鼠抗人IgG抗体：参照Eu3+标记试剂盒说明书操作，将 1. 〇mg的鼠抗人IgG抗体加入Millipore公司的截留分子量为50000的超滤离心管中， 8000r/min离心5?6min，再用标记缓冲液重复洗涤6次，将处理得到的200μ L鼠抗人 IgG抗体加入到1. Omg的预先用标记缓冲液溶解的Eu3+标记试剂充分混勻，2?8°C振荡 孵育48±2h ;反应液经用50mmol/L pH7. 80Tris-HCl缓冲液平衡的S印harose CL-6B柱 (lcmX40cm)层析，在A280监测收集第一洗脱峰。优选地，所述标记缓冲液为50mmol/L、 pH9. 6的碳酸缓冲液。
[0046] 制备所述Sm3+标记的鼠抗人μ链抗体：参照Sm3+标记试剂盒说明书操作，将 1. Omg的鼠抗人μ链抗体加入Millipore公司的截留分子量为50000的超滤离心管中， 8000r/min离心5?6min，再用标记缓冲液重复洗涤6次，将处理得到的200 μ 1鼠抗人 μ链抗体加入到1. 〇mg的预先用标记缓冲液溶解的Sm3+标记试剂充分混匀，2?8°C振荡 孵育48±2h。反应液经用50mmol/L pH7.80Tris-HCl缓冲液平衡的S印harose CL-6B柱 (lcmX40cm)层析，在A280监测收集第一洗脱峰。
[0047] 将Eu3+标记的鼠抗人IgG抗体和Sm3+标记的鼠抗人μ链抗体，分别用含有2g/ L BSA的50mmol/L、pH7. 8的Tris-HCl缓冲液稀释成最适工作浓度的1/20倍，分别分装成 0. 5ml/ 瓶。
[0048] (3)制备校准品：分别以HEV IgG抗体标准物质[GBW(E)090091]和HEV IgM抗体 标准物质[GBW(E)090089]为参比，将HEV IgG抗体和IgM抗体原料用含有10g/L BSA的 50mmol/L，pH7. 8的Tris-HCl缓冲液稀释成A、B、C、D、E和F6个校准品，其中A校准品含 有0U/ml HEV IgG抗体和0U/ml HEV IgM抗体，B校准品含有0.025U/ml HEV IgG抗体和 0.1U/ml HEV IgM 抗体，C 校准品含有 0.050U/ml HEV IgG 抗体和 0.2U/ml HEV IgM 抗体，D 校准品含有0. lOU/ml HEV IgG抗体和0. 5U/ml HEV IgM抗体，E校准品含有0. 50U/ml HEV IgG 抗体和 2. OU/ml HEV IgM 抗体，F 校准品含有 1. OU/ml HEV IgG 抗体和 4. OU/ml HEV IgM抗体，分装成0· 5ml/瓶。
[0049] (4)样本稀释液：含有BSA、硫柳汞、Tris-HCl缓冲液，分装成30ml/瓶。
[0050] ⑶实验缓冲液：含有小牛血清、染料、Tween2〇、EDTA、Procline 3〇0、Tris-HCl缓 冲液，分装成30ml/瓶。
[0051] (6)浓缩洗液：含有Tween20及染料、Procline300、Tris-HCl缓冲液，分装成 40ml/ 瓶。
[0052] (7)增强液：含曲拉通、冰乙酸、螯合剂、纯化水，分装成40ml/瓶。
[0053] (8)贴标签。
[0054] (9)组装为试剂盒产品。
[0055] 上述步骤所得产品分装即为半成品。抽出3份经过特异性、灵敏度、精密性及稳定 性检定合格才能组装成HEV IgG抗体和IgM抗体双标记测定试剂盒（时间分辨荧光免疫 法）。组装完成后还需抽检合格后才能出厂。
[0056] 实施例2
[0057] 本发明所述试剂盒实验方法简单快速，可自动化操作，检测系统为开放式操作系 统，本发明所述检测戊型肝炎病毒抗体的试剂盒的使用方法，具体操作如下：
[0058] (1)试剂准备
[0059] ①抗原固相载体：将试剂及所需数量的抗原固相载体平衡至室温（20?25°C )。 余下的抗原固相载体及时置入自封袋密闭并于2?8°C保存。
[0060] ②洗涤液：将40ml浓缩洗液和960ml纯化水在干净的容器中混合，作为工作洗涤 液备用。纯化水敬请用户自备。
[0061] ③标记物混合工作液：使用前30min内配制，将Eu3+标鼠抗人IgG抗体、Sm 3+标鼠 抗人μ链抗体与实验缓冲液按体积比为Eu3+标鼠抗人IgG抗体：Sm3+标鼠抗人μ链抗体： 实验缓冲液=1:1:20的比例加进洁净的同一个一次性容器中并混匀；当次实验用完。
[0062] (2)试验操作
[0063] ①将待测血清样本用样本稀释液按1:10稀释；吸取100 μ 1的抗_HEV(IgG+IgM) 校准品或已稀释样本依次加入到抗原固相载体中。
[0064] ②抗原固相载体在室温下，用振荡孵育45min。
[0065] ③第一步孵育结束后，洗涤4次。
[0066] ④向每个反应位中加入100 μ 1已配好的标记物混合工作液。
[0067] ⑤在室温下，振荡孵育45min。
[0068] ⑥第二步孵育结束后，洗涤6次。
[0069] ⑦向每个反应位中加入增强液100 μ 1。
[0070] ⑧固相载体于室温下缓慢振荡5min后检测，在30min内完成检测并进行分析。铕 (Eu 3+)标记荧光检测采用铕标记窗口检测程序，钐（Sm3+)标记荧光检测采用钐标记窗口检 测程序，并采用配套的分析软件进行结果分析，采用本发明所述试剂盒检测本发明所述试 剂盒中校准品时校准品中HEV IgG抗体的标准曲线图如图1，采用本发明所述试剂盒检测 本发明所述试剂盒中校准品时校准品中HEV IgM抗体的标准曲线图如图2。
[0071] 实施例3
[0072] 本发明所述检测戊型肝炎病毒抗体的试剂盒的分析性能评价：
[0073] (l)HEV IgG抗体的检测性能
[0074] 阴性参考品符合率：检测HEV IgG抗体国家阴性参考品30支，阳性反应不多于1 份；
[0075] 阳性参考品符合率：检测HEV IgG抗体国家阳性参考品10支，阴性反应不多于1 份；
[0076] 最低检出限：检测国家最低检出限参考品6份，阳性反应不少于3份且基质血清 S1为阴性反应；
[0077] 线性：检测企业参考品，L1?L5共5个样品测定值统计分析后，实测值与理论值 的线性相关系数r大于0.98,如图3。
[0078] 准确度：检测企业参考品，L1?L5共5个样品的实测值与理论值相对偏倚均在 ±20. 0% 内。
[0079] 重复性：平行测定HEV IgG抗体国家精密度参考品10孔，实测浓度值的精密度（CV 值）彡15% ;
[0080] 稳定性：试剂盒自成品生产之日起于37°C放置6天（有效期为12个月）；成品剩 余效期内，则按37°C放置6天有效期为12个月推算37°C放置的时间进行检测，结果符合各 项目规定的要求。
[0081] (2)HEV IgM抗体的检测性能
[0082] 阴性参考品符合率：检测HEV IgM抗体国家阴性参考品20支，均为阴性反应 (20/20)；
[0083] 阳性参考品符合率：检测HEV IgM抗体国家阳性参考品12支，均为阳性反应 (12/12)；
[0084] 重复性：平行测定HEV IgM抗体国家精密度参考品10孔，实测浓度值的精密度（CV 值）彡15% ;
[0085] 最低检出量（稀释度）：检测国家灵敏度参考品，最低检出量（稀释度1:8 ;
[0086] 线性：检测企业参考品，L1?L5共5个样品测定值统计分析后，实测值与理论值 的线性相关系数r大于0.98,如图4。
[0087] 准确度：检测企业参考品，L1?L5共5个样品的实测值与理论值相对偏倚均在 ±20. 0% 内；
[0088] 稳定性：试剂盒自成品生产之日起于37°C放置6天（有效期为12个月）；成品剩 余效期内，则按37°C放置6天有效期为12个月推算37°C放置的时间进行检测，结果符合各 项目规定的要求。
[0089] 本发明所述检测戊型肝炎病毒抗体的试剂盒的干扰试验评价：
[0090] 本发明实施例1制备的HEV IgG抗体和IgM抗体双标记测定试剂盒（时间分辨荧 光免疫法）的分析特异性评价如下：
[0091] 血样本中胆红素818 μ mol/L、血红蛋白180g/L、甘油三酯21. 54mmol/L对本试 剂盒的检测结果无干扰作用。不受血样本中柠檬酸钠（l.〇88mol/L)、乙二胺四乙酸二钾 (0. 2744mol/L)、草酸钾（0. 5428mol/L)、氟化钠（0. 4878mol/L)、肝素钠（150U/L)等抗凝剂 的干扰。检测甲型肝炎病毒抗体（8U/mL)、乙型肝炎病毒表面抗体（640mIU/mL)、乙型肝炎 病毒e抗体（16NCU/mL)、乙型肝炎病毒核心抗体（8NCU/mL)、丙型肝炎病毒抗体（4NCU/mL)、 梅毒抗体（160mIU/mL)均无交叉反应。
[0092] 本发明所述检测戊型肝炎病毒抗体的试剂盒与参比试剂盒的等效性评价：
[0093] 本发明实施例1制备的HEV IgG抗体和IgM抗体双标记测定试剂盒（时间分辨荧 光免疫法）的等效性评价结果如表1、表2、表3 :
[0094] 表1 1020例正常人血清样本的临床比对
[0095]
【权利要求】
1. 一种检测戊型肝炎病毒抗体的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：包被有HEV抗 原的固相载体，与HEV抗体结合的镧系元素标记的检测抗体，校准品，样本稀释液，实验缓 冲液，浓缩洗液以及增强液。
2. 根据权利要求1所述的检测戊型肝炎病毒抗体的试剂盒，其特征在于，所述包被有 抗原的固相载体中抗原为含有0RF2和0RF3抗原表位的HEV重组抗原。
3. 根据权利要求1所述的检测戊型肝炎病毒抗体的试剂盒，其特征在于，所述包被有 HEV抗原的载体是采用以下步骤制备而得的： 将HEV抗原用包被缓冲液稀释，在固相载体上进行包被，将固相载体洗涤1次，然后再 用封闭液进行封闭，将固相载体甩干，晾干，真空包装，2?8°C保存备用。
4. 根据权利要求1所述的检测戊型肝炎病毒抗体的试剂盒，其特征在于，所述与HEV抗 体结合的镧系元素标记的检测抗体为Eu3+标记的鼠抗人IgG抗体和Sm 3+标记的鼠抗人μ 链抗体的组合。
5. 根据权利要求4所述的检测戊型肝炎病毒抗体的试剂盒，其特征在于，所述Eu3+标 记的鼠抗人IgG抗体是参照Eu 3+标记试剂盒说明书操作而制备的，所述Sm3+标记的鼠抗人 μ链抗体是参照Sm3+标记试剂盒说明书操作而制备的。
6. -种采用如权利要求1所述试剂盒检测戊型肝炎病毒抗体的方法，其特征在于，包 括以下步骤： (1) 用实验缓冲液配制与HEV抗体结合的镧系元素标记的检测抗体； (2) 用纯化水将浓缩洗液稀释成工作洗涤液； (3) 将待检样本用样本稀释液稀释，将校准品或已稀释待检样本加入到包被有HEV抗 原的固相载体中； (4) 固相载体在室温下孵育； (5) 用步骤（2)中工作洗涤液洗涤抗原固相载体； (6) 加入步骤（1)中配制的与HEV抗体结合的镧系元素标记的检测抗体，在室温下孵 育； (7) 用步骤（2)中工作洗涤液洗涤抗原固相载体； (8) 加入增强液，继续孵育； (9) 孵育结束后，采用对应的荧光标记窗口检测程序进行检测并分析。
7. 根据权利要求6所述的检测戊型肝炎病毒抗体的试剂盒，其特征在于，所述步骤（1) 中与HEV抗体结合的镧系元素标记的检测抗体为Eu 3+标记的鼠抗人IgG抗体和Sm3+标记的 鼠抗人μ链抗体的组合。
8. 根据权利要求6所述的检测戊型肝炎病毒抗体的试剂盒，其特征在于，所述步骤（3) 中包被有抗原的固相载体中抗原为含有0RF2和0RF3抗原表位的HEV重组抗原。
9. 一种如权利要求1所述检测戊型肝炎病毒抗体的试剂盒的制备方法，其特征在于， 所述方法包括以下步骤： (1) 制备包被有HEV抗原的固相载体； (2) 制备校准品； (3) 制备与HEV抗体结合的镧系元素标记的检测抗体； (4) 制备样本稀释液、实验缓冲液、浓缩洗液以及增强液； (5) 贴标签； (6) 组装为试剂盒。
【文档编号】G01N33/576GK104090105SQ201410327852
【公开日】2014年10月8日 申请日期:2014年7月10日 优先权日:2014年7月10日
【发明者】谭玉华, 卢德祥, 李奕辉, 范主桥 申请人:广州市丰华生物工程有限公司
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