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专利名称：叶黄素酯皂化程度快速测定方法
技术领域：
本发明属于生物化学技术领域，涉及一种测定叶黄素酯皂化程度的方法，特别涉及一种叶黄素酯皂化程度快速测定方法。
背景技术：
叶黄素是类胡萝卜素的一种，广泛存在于自然界的植物中。由于这种天然色素具有色泽鲜艳、着色力强、安全无毒、富含营养等特点，越来越受到人们的重视，广泛应用于食品、化妆品、禽类饲料等领域。着色剂类(叶黄素)饲料添加剂就是利用金盏花中富含的天然叶黄素，将金盏花浸膏中的叶黄素酯类衍生物转化为游离叶黄素供禽类吸收。目前采用的工艺大都是先将浸膏加碱皂化，然后用吸咐剂吸收混合，但在皂化过程中叶黄素酯皂化程度的测定却是难点，叶黄素酯皂化程度测定一般采用HPLC (高效液相色谱)法，此方法虽然比较准确，但对测定条件要求很高，设备昂贵，标准品不易保存，测定耗时长，在实际生产中指导意义不大。如何快速简便的测定叶黄素酯是否完全皂化是生产中的一项技术难题。

发明内容
本发明的目的是提供一种叶黄素酯皂化程度快速测定方法，不仅结果准确，而且对测定条件要求较低，测定时间短。本发明所采用的技术方案是:一种叶黄素酯皂化程度快速测定方法，利用叶黄素酯和叶黄素在不同溶剂中的溶解性，采用薄层层析法快速简便的测定叶黄素酯皂化程度，该快速测定方法的具体步骤为:
a)取金盏花浸膏皂化过程中生成的皂化液溶于四氢呋喃中，制成样液；
清洗玻璃板，干燥；
将硅胶研磨成粘稠状的硅胶糊；
b)将硅胶糊均匀涂布在干燥后的玻璃板上，烘干，制成层析板；
c)用微量进样器抽取样液，在层析板的娃胶铺层表面点样，冷风吹干；
d)将石油醚和乙酸乙酯配成展开剂，将点样后的层析板放入注有展开剂的层析缸中，展开剂液面低于样点，层析板上的样液不能渗入展开剂中，于暗处展开，当展开剂到达层析板顶部时，取出层析板暗处风干；
e)若风干层析板上的样斑没有展开，则说明金盏花浸膏完全皂化，停止金盏花浸膏的皂化；若风干层析板上的样斑展开，则说明金盏花浸膏未完全皂化，继续皂化金盏花浸膏，并按上述步骤重复检测金盏花浸膏的皂化进程，直至风干层析板上的样斑不再展开，停止阜化。本发明快速测定方法利用叶黄素酯和叶黄素分子在溶剂中溶解性的不同，以四氢呋喃为溶解剂，以石油醚和乙酸乙酯的混合液为展开剂，采用薄层层析法快速简便的测定叶黄素酯皂化程度。经过HPLC (高效液相色谱)法对比，测定结果准确，解决了 HPLC法对测定条件要求很高，测定耗时长的缺点，在实际生产中应用效果显著。


图1是完全皂化的叶黄素酯样斑用展开剂处理后的状态图。图2是未完全皂化的叶黄素酯样斑用展开剂处理后的状态图。图3是未皂化样斑色谱图。图4是完全皂化样斑色谱图。
具体实施例方式由于叶黄素在叶黄素浸膏中是以叶黄素酯的形式存在，因此金盏花浸膏中的叶黄素在分离纯化前首先要进行皂化，使叶黄素单体从叶黄素酯中分离出来，而皂化效果的好坏可以用皂化程度表示，游离态的叶黄素分子极易溶于极性有机溶剂中，溶于(mg/L):丙酮800，乙睛100，苯600，氯仿6000，环己烷50，环己酮4000，二氯甲烷800，二甲基甲酞胺1000，乙醇300，乙酸乙酯800，乙醚2000，己烷20，异丙醇400，甲醇200，叔丁酸甲醋2000，四氢呋喃8000，甲苯5000，叶黄素分子在四氢呋喃中溶解性最好，在石油醚和乙酸乙酯中溶解性较差，而叶黄素酯在石油醚和乙酸乙酯中溶解性很好，在四氢呋喃中溶解性较差。本发明就是利用叶黄素酯和叶黄素在不同溶剂中的溶解性，采用薄层层析法快速简便的测定叶黄素酯皂化程度，具体步骤为:
a)取金盏花浸膏皂化过程中生成的皂化液1.0Og溶于IOml四氢呋喃中，制成样液；
选用平整光滑的玻璃板(规格为IOcmX20cm)，用洗液洗净，干燥；
称取7 g硅胶，加适量0.1 mo I.Γ1硼酸溶液于研钵中充分研磨，形成粘稠状的硅胶糊，当该硅胶糊发出脂肪光泽时 ，停止研磨；
b)将硅胶糊均匀涂布在干燥后的玻璃板上，硅胶糊的铺层厚度为0.4 _ ;将铺层后的玻璃板置于100°C烘箱中烘干，制成层析板，置于干燥器中备用；
c)用微量进样器抽取样液，在距离层析板底边2cm的水平线上轻轻接触铺层表面，在铺层表面点样，点样的样液量不超过300 μ L，吹风机冷风吹干；
点样的液体量超过300 μ L,易出现拖尾或扩散。d)按体积比4: 1，将沸程为60 90°C的石油醚和乙酸乙酯配成展开剂，所用试剂均为分析纯；将点样后的层析板放入注有展开剂的层析缸中，展开剂液面低于样点1cm，层析板上的样液不能渗入展开剂中，于暗处展开，当展开剂达到层析板顶部时，取出层析板，暗处风干；
e)若风干层析板上的样斑没有展开，则说明金盏花浸膏完全皂化，停止金盏花浸膏的皂化；若风干层析板上的样斑展开，则说明金盏花浸膏未完全皂化，继续皂化金盏花浸膏，并按上述步骤重复检测金盏花浸膏的皂化进程，直至风干层析板上的样斑不再展开，停止皂化。
实施例取金盏花浸膏皂化过程中生成的皂化液1.0Og溶于IOml四氢呋喃中，制成样液；用洗液洗净平整光滑的玻璃板(规格为IOcmX 20cm)，干燥；称取7 g硅胶，加适量0.1mol.L-1硼酸溶液于研钵中充分研磨，形成粘稠状的硅胶糊，当该硅胶糊发出脂肪光泽时，停止研磨，将硅胶糊均匀涂布在干燥后的玻璃板上，硅胶糊的铺层厚度为0.4 mm ;将铺层后的玻璃板置于100°C烘箱中烘干，制成层析板，置于干燥器中备用；用微量进样器抽取样液，在距离层析板底边2 cm的水平线上轻轻接触铺层表面，在铺层表面点样，点样的液体量不超过300 μ L，吹风机冷风吹干；按体积比4: 1，将沸程为60 90°C的石油醚和乙酸乙酯配成展开剂，所用试剂均为分析纯；将点样后的层析板放入注有展开剂的层析缸中，展开剂液面低于样点1cm，层析板上的样液不能渗入展开剂中，于暗处展开，当展开剂达到层析板顶部时，取出层析板，暗处风干；若风干层析板上的样斑没有展开，如图1所示，则说明金盏花浸膏完全皂化，停止金盏花浸膏的皂化；若风干层析板上的样斑展开，如图2所示，则说明金盏花浸膏未完全皂化，继续皂化金盏花浸膏，并按上述步骤重复检测金盏花浸膏的皂化进程，直至风干层析板上的样斑不再展开，停止皂化。未阜化金盖花浸膏样斑在层析板上向前伸展出很长距离，而完全阜化金盖花浸膏在层析板上几乎没动，这是因为叶黄素酯在展开剂中溶解性好，而叶黄素单体在展开剂中溶解性差，展开剂在层析板上向上渗析时，含有叶黄素酯的未皂化金盏花浸膏样液随展开剂向上伸展，其色谱图如图3，未皂化金盏花浸膏样在进样0.715min时出现一最高峰，峰面积占全部峰面积的84.50%。而含有叶黄素单体的完全皂化金盏花浸膏样液在层析板上则几乎不移动，其色谱图如图4，完全皂化金盏花浸膏样在进样3.496min时现一最高峰，峰面积占全部峰面积的87.15%，在0.715min附近并没有出现任何峰，说明浸膏中的叶黄素酯全部皂化。因此，可以用样液在层析板上的伸展程度定性表示金盏花浸膏的皂化程度，样液不伸展，说明皂化完全，样液伸展，说明金盏花浸膏皂化不完全，样液伸展的程度可以表示金盏花浸膏皂化的程度。对比例
用HPLC法检测金盏花浸膏的皂化程度时:
I)试剂配制 按体积比10: 7: 6: 7将正己烷(分析纯)、丙酮(分析纯)、纯酒精(分析纯)和甲苯(分析纯)混匀，配成HEAT混合物；
将10.0Og无水Na2SO4 (分析纯)溶解，定容至100ml，配成10%硫酸钠溶液。2)色谱分析条件
色谱柱:TR-413212 (TRACEREXTRSIL SI) 3ym 15X04。检测波长:486nm。流动相:正已烷(色谱纯):乙酸乙酯(色谱纯)=75:25 (体积比)。流速:2.5ml/min,进样量:25.00 μ 1，时间:8min。3)样品的制备
3.1用精密天平(灵敏度0.1毫克)分别准确称取30mg未皂化的金盏花浸膏和实施例中制成的样液，分别放入50ml容量瓶底部，加入15 ml HEAT混合物，摇动3分钟，使样品全部溶解。3.2旋转I分钟后置于56°C热水中10分钟。3.3冷却后，加入15ml正己烷于容量瓶内，然后用10%硫酸钠溶液准确定容至50ml ;摇动3分钟后置于黑暗中，直至清澈为止。3.4用移液管吸取上层清液1ml，置于25ml容量瓶内，用正己烷定容。
3.5用移液管吸取上述液Iml置于一小试管中，真空干燥,直至试管中液体全部蒸发。3.6在干燥后的试管中加入V(正已烷):V(乙酸乙酯)=75:25 (色谱纯，过25μπι滤膜)的混合液1ml，轻轻摇动，使试管中的样品全部溶解，用固相柱过滤，取25 μ I滤液分析。从实施例和对比例可以看出，本发明方法可以定性地测定金盏花浸膏的皂化程度，测定结果与HPLC法测定结果相符，可以用样斑在层析板上的伸展程度定性表示金盏花浸膏皂化程度，样斑不伸展，说明皂化完全，样斑伸展，说明浸膏皂化不完全，样斑伸展的程度可以表示浸膏皂化的程度。
权利要求
1.一种叶黄素酯皂化程度快速测定方法，利用叶黄素酯和叶黄素在不同溶剂中的溶解性，采用薄层层析法快速简便的测定叶黄素酯皂化程度，其特征在于，该快速测定方法的具体步骤为: a)取金盏花浸膏皂化过程中生成的皂化液溶于四氢呋喃中，制成样液； 清洗玻璃板，干燥； 将硅胶研磨成粘稠状的硅胶糊； b)将硅胶糊均匀涂布在干燥后的玻璃板上，烘干，制成层析板； c)用微量进样器抽取样液，在层析板的娃胶铺层表面点样，冷风吹干； d)将石油醚和乙酸乙酯配成展开剂，将点样后的层析板放入注有展开剂的层析缸中，展开剂液面低于样点，层析板上的样液不能渗入展开剂中，于暗处展开，当展开剂到达层析板顶部时，取出层析板暗处风干； e)若风干层析板上的样斑没有展开，则说明金盏花浸膏完全皂化，停止金盏花浸膏的皂化；若风干层析板上的样斑展开，则说明金盏花浸膏未完全皂化，继续皂化金盏花浸膏，并按上述步骤重复检测金盏花浸膏的皂化进程，直至风干层析板上的样斑不再展开，停止皂化。
2.按照权利要求1所述的叶黄素酯皂化程度快速测定方法，其特征在于，所述步骤a)中，将1.0Og皂化液溶于IOml四氢呋喃中制成样液。
3.按照权利要求1所述的叶黄素酯皂化程度快速测定方法，其特征在于，所述步骤a)中，称取7 g硅胶，加适 量0.1 mol.!/1硼酸溶液于研钵中充分研磨，形成粘稠状的硅胶糊。
4.按照权利要求1所述的叶黄素酯皂化程度快速测定方法，其特征在于，所述步骤b)中，将硅胶糊均匀涂布在干燥后的玻璃板上，硅胶糊的铺层厚度为0.4 mm ;将铺层后的玻璃板置于100°C烘箱中烘干，制成层析板。
5.按照权利要求1所述的叶黄素酯皂化程度快速测定方法，其特征在于，所述步骤c)中，用微量进样器抽取样液，在距离层析板底边2 cm的水平线上点样，点样的样液量不超过300 μ L，吹风机冷风吹干。
6.按照权利要求1所述的叶黄素酯皂化程度快速测定方法，其特征在于，所述步骤d)中，按体积比4: 1，将沸程为60 90°C的石油醚和乙酸乙酯配成展开剂；将点样后的层析板放入展开剂中，展开剂液面低于样点1cm。
全文摘要
本发明提供了一种叶黄素酯皂化程度快速测定方法，将金盏花浸膏皂化过程中的皂化液溶于四氢呋喃，制成样液；将硅胶糊均匀涂布于清洗干燥后的玻璃板上，制成层析板；用微量进样器抽取样液，在层析板上点样后吹干；用石油醚和乙酸乙酯配成展开剂，将点样后的层析板放入展开剂，于暗处展开，当展开剂到达层析板顶部时，取出层析板暗处风干；若风干层析板上的样斑没有展开，则金盏花浸膏完全皂化；若风干层析板上的样斑展开，则金盏花浸膏未完全皂化，继续皂化，重复检测金盏花浸膏的皂化进程，直至风干层析板上的样斑不再展开，停止皂化。本检测方法利用叶黄素酯和叶黄素分子溶解性的不同，快速简便的测定叶黄素酯皂化程度，测定结果准确，效果显著。
文档编号G01N30/90GK103091446SQ20131003807
公开日2013年5月8日 申请日期2013年1月31日 优先权日2013年1月31日
发明者杨宪忠, 周彦芳, 刘强, 何岩, 朱亚, 何友萍, 陈志国 申请人:甘肃省农垦农业研究院