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一种金属纳米岛载体及其制备方法和在免疫检测中的应用的制作方法
【专利摘要】一种金属纳米岛载体及其制备方法和在免疫检测中的应用，涉及金属纳米岛载体及其制备方法和在免疫检测中的应用的领域。本发明解决了现有荧光免疫分析中背景噪声大、检测灵敏度低的问题。一种金属纳米岛载体是在载体材料表面形成金属纳米岛而得到的。制备方法：一、在载体材料表面吸附金纳米种子；二、配置生长金属纳米岛反应液；三、在载体材料表面生长金属纳米岛；四、清洗、干燥。金属纳米岛载体在免疫检测中的应用，使用金属纳米岛载体作为捕获分子的修饰载体制成生物芯片，进行荧光扫描和数据分析，进而完成免疫检测。本发明具有高灵敏度、大大降低背景荧光噪声，实现了fm级的超灵敏检测。本发明适用于功能材料、生物芯片和免疫检测领域。
【专利说明】一种金属纳米岛载体及其制备方法和在免疫检测中的应用
【技术领域】:
[0001]本发明涉及金属纳米岛载体及其制备方法和在免疫检测中的应用的领域。
【背景技术】:
[0002]体液免疫检查在在生物医学研究和疾病早期诊断中具有极为重要的研究价值，尤其是实现对心脑血管、癌症等一系列重大疾病的早期检测和筛查的关键所在。然而要实现对这些体液中较低浓度目标分子的分析检测，现有的免疫检测技术如放射免疫分析(RIA)、酶联免疫吸附分析(ELISA)、荧光免疫分析(FIA)、胶体金免疫层析技术(GICA)还存在着灵敏度低、特异性差等一些问题。尤其是荧光免疫检测技术，虽然理论上能够实现对单分子水平的标记，但由于受到生物分子背荧光、激光散射噪声等影响而严重降低了其检测灵敏度(通常只能到几十Pg数量级)。

【发明内容】
:
[0003]本发明是要解决现有的荧光免疫分析中背景噪声大、检测灵敏度低的问题，而提供了一种金属纳米岛载体及其制备方法和在免疫检测中的应用。
[0004]—种金属纳米岛载体，是在载体材料表面形成金属纳米岛而得到的，所述的金属纳米岛是分立的，所述的金属纳米岛的尺寸为10?500nm,所述的金属纳米岛之间的间隙为 5 ?200nm。
[0005]所述的载体材料为固相材料或悬浮材料。
[0006]所述的固相材料为二维平面结构。
[0007]所述的固相材料可以为玻片、硅片、石英、聚偏二氟乙烯膜或硝酸纤维素膜。
[0008]所述的悬浮材料可以为玻璃微珠、磁珠、聚苯乙烯微球、聚甲基丙烯酸甲酯微球、聚苯乙烯磁性微球或聚甲基丙烯酸甲酯磁性微球。
[0009]所述的金属可以为银、金-银合金或银/金核壳结构。
[0010]制备金属纳米岛载体的方法，具体是按照以下步骤进行的:
[0011]一、在载体材料表面吸附一层金纳米种子，得到了表面吸附金纳米种子的载体材料；
[0012]二、配置生长金属纳米岛的反应溶液:将还原剂加入到含有金属离子的溶液中，混合均匀；其中，所述的还原剂与含有的金属离子的摩尔比为(0.5?2): I ;所述的金属离子的溶液的浓度为0.1?5mM ；
[0013]三、将步骤一中得到的表面吸附一层金纳米种子的载体材料放入步骤二中得到的生长金属纳米岛的反应溶液中，在18?30°C下振荡反应2?60min ；
[0014]四、将步骤三中反应完成的载体材料取出，用水清洗，干燥，即得到金属纳米岛载体。
[0015]所述的步骤一中的金纳米种子是通过化学还原法还原Au3+得到的，然后利用物理吸附或化学偶联相互作用结合到载体材料表面的。[0016]所述的步骤一中的载体材料表面吸附的金纳米种子的粒径为I?20nm。
[0017]所述的步骤一中的载体材料为固相材料或悬浮材料。
[0018]所述的固相材料为二维平面结构。
[0019]所述的固相材料可以为玻片、硅片、石英、聚偏二氟乙烯膜或硝酸纤维素膜。
[0020]所述的悬浮材料可以为玻璃微珠、磁珠、聚苯乙烯微球、聚甲基丙烯酸甲酯微球、聚苯乙烯磁性微球或聚甲基丙烯酸甲酯磁性微球。
[0021]所述的金属可以为银、金-银合金或银/金核壳结构。
[0022]所述的步骤二中的还原剂为NaBH4, NH2OH, N2H4, CH2O或C6H1206。
[0023]所述的金属离子溶液为Ag+溶液或Au3+溶液中的一种或两种的混合溶液。
[0024]所述的步骤二中的还原剂与含有的金属离子的摩尔比为(0.7?1.5): I。
[0025]所述的步骤二中的还原剂与含有的金属离子的摩尔比为1:1。
[0026]所述的步骤二中的金属离子的溶液的浓度为0.3?5mM。
[0027]所述的步骤二中的金属离子的溶液的浓度为0.5?ImM。
[0028]所述的步骤四中的水为去离子水。
[0029]金属纳米岛载体在免疫检测中的应用，是生物芯片中的捕获分子捕获相应的物质，进行荧光扫描和数据分析，进而完成免疫检测，其中使用所述金属纳米岛载体作为捕获分子的修饰载体制成生物芯片。
[0030]所述的金属纳米岛载体表面修饰肿瘤标志物抗体分子制备成生物芯片实现在肿瘤的早期检测中的应用。
[0031]所述的金属纳米岛载体表面修饰自体免疫疾病相关的抗原、抗体分子制备成生物芯片实现在自体免疫疾病检测中的应用。
[0032]所述的金属纳米岛载体表面修饰乙肝抗体分子、流感病毒DNS序列、结合病抗体、疟原虫抗原(或抗体)、大肠杆菌抗体制备成生物芯片实现在传染性疾病的检测中的应用。
[0033]所述的金属纳米岛载体表面修饰白细胞介素、干扰素、肿瘤坏死因子超家族、集落刺激因子、趋化因子或生长因子的单克隆抗体制备成生物芯片实现在细胞因子的检测中的应用。
[0034]所述的金属纳米岛载体表面修饰对不同疾病的单克隆抗体制备成生物芯片实现在对捕获的目标细胞分泌物进行Elispot检测中的应用。
[0035]所述的生物芯片为微阵列生物芯片或悬浮式生物芯片。
[0036]本发明的优点:一、本发明是基于湿化学合成方法，通过金纳米种子诱导的原位还原生长过程在载体材料表面实现了不同种类金属纳米岛功能载体的制备，并进一步利用制备的金属纳米岛载体表面等离子体共振效应进行高灵敏度的免疫检测分析，尤其是利用近红外荧光增强技术大大降低了背景荧光噪声，实现了 fm级的超灵敏检测；
[0037]二、本发明是通过控制金属的种类以及纳米岛的尺寸、形貌、间距等来实现调控金属纳米岛载体的等离子体共振吸收峰的连续可调，涵盖了从可见光到近红外区域(420?1700nm)的一系列波段，满足免疫检测的需求。
【专利附图】

【附图说明】:
[0038]图1为试验一的载玻片银纳米岛载体的扫描电子显微镜图；[0039]图2为试验三的载玻片银/金核壳结构纳米岛载体的扫描电子显微镜图；
[0040]图3为试验一的载玻片银纳米岛载体和试验三的载玻片银/金核壳结构纳米岛载体的等离子吸收光谱曲线对比图；
[0041]图4为普通玻璃、试验一的载玻片银纳米岛载体和试验三的载玻片银/金核壳结构纳米岛载体的荧光扫描对比图；
[0042]图5为普通玻璃和试验一的载玻片银纳米岛载体表面荧光强度的对比图；
[0043]图6为试验五中步骤一得到的聚苯乙烯微球的扫描电子显微镜图；
[0044]图7为试验六中步骤一得到的磁性聚苯乙烯微球和试验六中步骤五得到的磁性聚苯乙烯微球金纳米岛载体在磁铁富集作用前后的效果对比图；
[0045]图8为试验六得到的磁性聚苯乙烯微球金纳米岛载体的紫外吸收光谱图。
【具体实施方式】:
[0046]本发明技术方案不局限于以下所列举【具体实施方式】，还包括各【具体实施方式】间的任意组合。
[0047]【具体实施方式】一:本实施方式是一种金属纳米岛载体，是在载体材料表面形成金属纳米岛而得到的，所述的金属纳米岛是分立的，所述的金属纳米岛的尺寸为10?500nm,所述的金属纳米岛之间的间隙为5?200nm。
[0048]【具体实施方式】二:本实施方式与【具体实施方式】一的不同点是:所述的载体材料为固相材料或悬浮材料。其它与【具体实施方式】一相同。
[0049]【具体实施方式】三:本实施方式与【具体实施方式】一或二的不同点是:所述的固相材料为二维平面结构。其它与【具体实施方式】一或二相同。
[0050]【具体实施方式】四:本实施方式与【具体实施方式】一至三之一的不同点是:所述的固相材料可以为玻片、硅片、石英、聚偏二氟乙烯膜或硝酸纤维素膜。其它与【具体实施方式】一至三相同。
[0051]【具体实施方式】五:本实施方式与【具体实施方式】一至四之一的不同点是:所述的悬浮材料可以为玻璃微珠、磁珠、聚苯乙烯微球、聚甲基丙烯酸甲酯微球、聚苯乙烯磁性微球或聚甲基丙烯酸甲酯磁性微球。其它与【具体实施方式】一至四相同。
[0052]【具体实施方式】六:本实施方式与【具体实施方式】一至五之一的不同点是:所述的金属可以为银、金-银合金或银/金核壳结构。其它与【具体实施方式】一至五相同。
[0053]【具体实施方式】七:本实施方式是制备金属纳米岛载体的方法，具体是按照以下步骤进行的:
[0054]一、在载体材料表面吸附一层金纳米种子，得到了表面吸附金纳米种子的载体材料；
[0055]二、配置生长金属纳米岛的反应溶液:将还原剂加入到含有金属离子的溶液中，混合均匀；其中，所述的还原剂与含有的金属离子的摩尔比为(0.5?2): I;所述的金属离子的溶液的浓度为0.1?5mM ；
[0056]三、将步骤一中得到的表面吸附一层金纳米种子的载体材料放入步骤二中得到的生长金属纳米岛的反应溶液中，在18?30°C下振荡反应2?60min ；
[0057]四、将步骤三中反应完成的载体材料取出，用水清洗，干燥，即得到金属纳米岛载体。
[0058]所述的金属纳米岛功能载体是通过金纳米种子诱导的原位化学还原生长实现的。
[0059]所述的单位mM为mmol / L。
[0060]【具体实施方式】八:本实施方式与【具体实施方式】七的不同点是:所述的步骤一中的金纳米种子是通过化学还原法还原Au3+得到的，然后利用物理吸附或化学偶联相互作用结合到载体材料表面的。其它与【具体实施方式】七相同。
[0061]所述的步骤一中的操作方法，具体按照以下步骤完成的:
[0062]a、将Iml的THPC还原剂加入到含有ImM NaOH的水溶液中，剧烈搅拌30min，待用；b、向步骤a中迅速注入ImL的AuHCl4溶液,室温下剧烈搅拌反应30min ;c、将得到的金纳米种子溶液置于室温下避光熟化24h ;d、将载体材料放入步骤c得到的金纳米种子溶液中，室温下反应10~300min,即得到表面吸附金纳米种子的载体材料
[0063]【具体实施方式】九:本实施方式与【具体实施方式】七至八之一的不同点是:所述的步骤一中的载体材料表面吸附的金纳米种子的粒径为I~20nm。其它与【具体实施方式】七至八相同。[0064]【具体实施方式】十:本实施方式与【具体实施方式】七至九之一的不同点是:所述的步骤一中的载体材料为固相材料或悬浮材料。其它与【具体实施方式】七至九相同。
[0065]【具体实施方式】十一:本实施方式与【具体实施方式】七至十之一的不同点是:所述的固相材料为二维平面结构。其它与【具体实施方式】七至十相同。
[0066]【具体实施方式】十二:本实施方式与【具体实施方式】七至十一之一的不同点是:所述的固相材料可以为玻片、硅片、石英、聚偏二氟乙烯膜或硝酸纤维素膜。其它与【具体实施方式】七至十一相同。
[0067]【具体实施方式】十三:本实施方式与【具体实施方式】七至十二之一的不同点是:所述的悬浮材料可以为玻璃微珠、磁珠、聚苯乙烯微球、聚甲基丙烯酸甲酯微球、聚苯乙烯磁性微球或聚甲基丙烯酸甲酯磁性微球。其它与【具体实施方式】七至十二相同。
[0068]【具体实施方式】十四:本实施方式与【具体实施方式】七至十三之一的不同点是:所述的金属可以为银、金-银合金或银/金核壳结构。其它与【具体实施方式】七至十三相同。
[0069]【具体实施方式】十五:本实施方式与【具体实施方式】七至十四之一的不同点是:所述的步骤二中的还原剂为NaBH4,NH2OH,N2H4, CH2O或C6H1206。其它与【具体实施方式】七至十四相同。
[0070]【具体实施方式】十六:本实施方式与【具体实施方式】七至十五之一的不同点是:所述的金属离子溶液为Ag+溶液或Au3+溶液中的一种或两种的混合溶液。其它与【具体实施方式】七至十五相同。
[0071]【具体实施方式】十七:本实施方式与【具体实施方式】七至十六之一的不同点是:所述的步骤二中的还原剂与含有的金属离子的摩尔比为(0.7~1.5): I其它与【具体实施方式】七至十六相同。
[0072]【具体实施方式】十八:本实施方式与【具体实施方式】七至十七之一的不同点是:所述的步骤二中的还原剂与含有的金属离子的摩尔比为1:1。其它与【具体实施方式】七至十七相同。
[0073]【具体实施方式】十九:本实施方式与【具体实施方式】七至十八之一的不同点是:所述的步骤二中的金属离子的溶液的浓度为0.3~5mM。其它与【具体实施方式】七至十八相同。
[0074]【具体实施方式】二十:本实施方式与【具体实施方式】七至十九之一的不同点是:所述的步骤二中的金属离子的溶液的浓度为0.5~ImM。其它与【具体实施方式】七至十九相同。
[0075]【具体实施方式】二十一:本实施方式与【具体实施方式】七至二十之一的不同点是:所述的步骤四中的水为去离子水。其它与【具体实施方式】七至二十相同。
[0076]【具体实施方式】二十二:本实施方式是一种金属纳米岛载体在免疫检测中的应用，是生物芯片中的捕获分子捕获相应的物质，进行荧光扫描和数据分析，进而完成免疫检测，其中使用所述金属纳米岛载体作为捕获分子的修饰载体制成生物芯片。
[0077]【具体实施方式】二十三:本实施方式与【具体实施方式】二十二的不同点是:所述的金属纳米岛载体表面修饰肿瘤标志物抗体分子制备成生物芯片实现在肿瘤的早期检测中的应用。其它与【具体实施方式】二十二相同。
[0078]【具体实施方式】二十四:本实施方式与【具体实施方式】二十二或二十三的不同点是:所述的金属纳米岛载体表面修饰自体免疫疾病相关的抗原、抗体分子制备成生物芯片实现在自体免疫疾病检测中的应用。其它与【具体实施方式】二十二或二十三相同。
[0079]【具体实施方式】二十五:本实施方式与【具体实施方式】二十二至二十四之一的不同点是:所述的金属纳米岛载体表面修饰乙肝抗体分子、流感病毒DNS序列、结合病抗体、疟原虫抗原(或抗体)、大肠杆菌抗体制备成生物芯片实现在传染性疾病的检测中的应用。其它与【具体实施方式】二十二至二十五相同。
[0080]【具体实施方式】二十六:本实施方式与【具体实施方式】二十二至二十五之一的不同点是:所述的金属纳米岛载体表面修饰白细胞介素、干扰素、肿瘤坏死因子超家族、集落刺激因子、趋化因子或生长因子的单克隆抗体制备成生物芯片实现在细胞因子的检测中的应用。其它与【具体实施方式】二十二至二十五相同。
`[0081]【具体实施方式】二十七:本实施方式与【具体实施方式】二十二至二十六之一的不同点是:所述的金属纳米岛载体表面修饰对不同疾病的单克隆抗体制备成生物芯片实现在对捕获的目标细胞分泌物进行Elispot检测中的应用。其它与【具体实施方式】二十二至二十六相同。
[0082]【具体实施方式】二十八:本实施方式与【具体实施方式】二十二至二十七之一的不同点是:所述的生物芯片为微阵列生物芯片或悬浮式生物芯片。其它与【具体实施方式】二十二至二十七相同。
[0083]采用下述试验验证本发明的效果:
[0084]试验一:银纳米岛载体，在载玻片表面形成银纳米岛而得到的，所述的银纳米岛是分立的，所述的银纳米岛的平均尺寸在100~500nm之间，所述的银纳米岛之间的间隙为30 ~IOOnm0
[0085]银纳米岛载体的制备方法，具体是按照以下步骤进行的:
[0086]一、在载玻片表面吸附一层金纳米种子，得到了表面吸附金纳米种子的载玻片；
[0087]二、配置生长银纳米岛的反应溶液:将CH2O加入到AgNO3溶液中，混合均匀；其中，所述的CH2O与AgNO3的摩尔比为0.5:1 ;所述的AgNO3溶液的摩尔浓度为ImM ；
[0088]三、将步骤一中得到的表面吸附一层金纳米种子的载玻片放入步骤二中得到的生长银纳米岛的反应溶液中，在20°C下反应30min ；[0089]四、将步骤三中反应完成的载玻片取出，用水清洗，干燥，即得到银纳米岛载体。
[0090]对试验一得到的银纳米岛载体进行扫描电子显微镜测试，得到图1。图1为试验一的银纳米岛载体的扫描电子显微镜图。从图1中，可以看出银纳米岛的平均尺寸在100?500nm之间，银纳米岛之间的间隙为30?IOOnm。
[0091]试验二:金-银合金纳米岛载体，在载玻片表面形成金-银合金纳米岛而得到的，所述的金-银合金纳米岛是分立的，所述的金-银合金纳米岛的平均尺寸在100?500nm之间，所述的金-银合金纳米岛之间的间隙为30?lOOnm。
[0092]金-银合金纳米岛载体的制备方法，具体是按照以下步骤进行的:
[0093]一、在载玻片表面吸附一层金纳米种子，得到了表面吸附金纳米种子的载玻片；
[0094]二、配置生长金-银合金纳米岛的反应溶液:将NH2OH加入到AgNO3溶液和AuHCl4溶液的混合溶液中，混合均匀；其中，所述的NH2OH与AgNO3的摩尔比为2: I ;所述的AuHCl4与AgNO3的摩尔比为1:1 ;所述的AgNO3溶液的摩尔浓度为0.5mM ;所述的AuHCl4溶液的摩尔浓度为0.5mM ；
[0095]三、将步骤一中得到的表面吸附一层金纳米种子的载玻片放入步骤二中得到的生长金-银合金纳米岛的反应溶液中，在20°C下震荡反应30分钟；
[0096]四、将步骤三中反应完成的载玻片取出，用水清洗，干燥，即得到金-银合金纳米岛载体。
[0097]试验三:银/金核壳结构纳米岛载体
[0098]银/金核壳结构纳米岛载体，在载玻片表面形成银/金核壳结构纳米岛而得到的，所述的银/金核壳结构纳米岛是分立的，所述的银/金核壳结构纳米岛的平均尺寸在100?500nm之间,所述的银/金核壳结构纳米岛之间的间隙为30?lOOnm。
[0099]银/金核壳结构纳米岛载体的制备方法，具体是按照以下步骤进行的:
[0100]一、在载玻片表面吸附一层金纳米种子，得到了表面吸附金纳米种子的载玻片；
[0101]二、配置生长银纳米岛的反应溶液:将CH2O加入到AgNO3溶液中，混合均匀；其中，所述的CH2O与AgNO3的摩尔比为1:1 ;所述的AgNO3溶液的摩尔浓度为ImM ；
[0102]三、将步骤一中得到的表面吸附一层金纳米种子的载玻片放入步骤二中得到的生长银纳米岛的反应溶液中，在20°C下反应30min ；
[0103]四、将步骤三中得到的载玻片放入AuHCl4溶液中，继续反应I小时，使银纳米岛表面包覆一层金纳米壳层；所述的AuHCl4溶液的摩尔浓度为10 μ M ;
[0104]五、将步骤四中反应完成的载玻片取出，用水清洗，干燥，即得到银/金核壳结构纳米岛载体。
[0105]对试验三得到的银纳米岛载体进行扫描电子显微镜测试，得到图2。图2为试验三的银/金核壳结构纳米岛载体的扫描电子显微镜图。从图2中，可以看出银/金核壳结构纳米岛的平均尺寸在100?500nm之间，银纳米岛之间的间隙为30?lOOnm。
[0106]对试验一得到的银纳米岛载体和试验三得到的银/金核壳结构纳米岛载体进行等离子吸收光谱测试，得到图3。图3是等离子吸收光谱曲线；其中，实线为银纳米岛载体等离子吸收光谱曲线，虚线为银/金核壳结构纳米岛载体等离子吸收光谱曲线。从图3中，可以得到两个载体的吸收峰分别位于450nm和420nm附近，OD值为0.60上下，可以看出包覆金壳层会引起银本征等离子吸收峰的变化，因此理论上通过改变银-金纳米岛的化学计量比和结构能够实现等其离子共振吸收峰从可见光到近红外区的调控，从而实现对宽光谱范围的荧光增强和超灵敏免疫检测分析。
[0107]对普通玻璃、试验一得到的银纳米岛载体和试验三得到的银/金核壳结构纳米岛载体进行荧光强度测试。测试方法:采用Cy5.5标记的BSA按一定的浓度梯度在普通玻璃和银纳米岛及银/金核壳结构纳米岛等不同载体上进行了点样测试:100，10，1,0.1,0.01，Oug/ ml,然后用商品化的Odyssey突光扫描仪(Licor)进行分析,扫描结果如图4所示。从图4中，可以观察到银纳米岛载体和银/金核壳结构纳米岛都有明显的荧光增强效果。将此图片通过分析软件测量后得到的普通玻璃和银纳米岛载体表面荧光强度信号结果如图5所示；其中，为普通玻璃，▲为银纳米岛载体。从图5中，可以观察到银纳米岛载体相对于普通玻璃的荧光强度约增强了 10倍，检测限约提高了 2个量级。
[0108]试验四:玻璃微珠银纳米岛载体
[0109]玻璃微珠银纳米岛载体的制备方法，具体是按照以下步骤进行的:
[0110]一、将玻璃微珠加入到金纳米种子溶液中，室温下搅拌反应30min，然后离心清洗3次，得到了表面吸附金纳米种子的玻璃微珠；
[0111]二、配置生长银纳米岛的反应溶液:将CH2O加入到AgNO3溶液中，混合均匀；其中，所述的CH2O与AgNO3的摩尔比为1:1 ;所述的AgNO3溶液的摩尔浓度为0.5mM ；
[0112]三、将步骤一中得到的表面吸附一层金纳米种子的玻璃微珠放入步骤二中得到的生长银纳米岛的反应溶液中，在20°C下反应60min ；
[0113]四、将步骤三中反应完成的玻璃微珠离心，用水清洗，重新分散到水溶液中，即得到玻璃微珠银纳米岛载体。
[0114]试验五:聚苯乙烯微球银纳米岛载体
[0115]聚苯乙烯微球银纳米岛载体的制备方法，具体是按照以下步骤进行的:
[0116]—、利用分散聚合法制备聚苯乙烯微球，聚苯乙烯微球尺寸均匀，直径约为3.5 μ m ；
[0117]二、将聚苯乙烯微球加入到金纳米种子溶液中，室温下搅拌12小时，使材料表面吸附一层金纳米种子，得到了表面吸附金纳米种子的聚苯乙烯微球；
[0118]三、配置生长银纳米岛的反应溶液:将CH2O加入到AgNO3溶液中，混合均匀；其中，所述的CH2O与AgNO3的摩尔比为1:1 ;所述的AgNO3溶液的摩尔浓度为0.5mM ；
[0119]四、将步骤二中得到的表面吸附一层金纳米种子的聚苯乙烯微球放入步骤三中得到的生长银纳米岛的反应溶液中，在20°C下反应60min ；
[0120]五、将步骤四中反应完成的聚苯乙烯微球离心，用水清洗，重新分散到水溶液中，即得到聚苯乙烯微球银纳米岛载体。
[0121]对试验五中步骤一得到的聚苯乙烯微球进行扫描电子显微镜的测试，得到图6。从图6中，可以观察到制备得到的聚苯乙烯微球的尺寸分布非常均匀，直径约为3.5μπι。
[0122]试验六:磁珠金纳米岛载体
[0123]磁珠银纳米岛载体的制备方法，具体是按照以下步骤进行的: [0124]一、制备磁性Fe3O4纳米粒子，并将其吸附到聚苯乙烯小球表面，得到磁珠；
[0125]二、将磁珠加入到金纳米种子溶液中，室温下搅拌12小时，使材料表面吸附一层金纳米种子，得到了表面吸附金纳米种子的磁珠；[0126]三、配置生长金纳米岛的反应溶液:将NH2OH加入到AuHCl4溶液中，混合均匀；其中，所述的NH2OH与AuHCl4的摩尔比为1:1 ;所述的AuHCl4溶液的摩尔浓度为ImM ；
[0127]四、将步骤二中得到的表面吸附一层金纳米种子的磁珠放入步骤三中得到的生长金纳米岛的反应溶液中，在20°C下搅拌反应60min ；
[0128]五、将步骤四中反应完成的磁珠离心，用水清洗，重新分散到水溶液中，即得到磁珠金纳米岛载体。
[0129]对试验六步骤一制备得到的磁性聚苯乙烯微球和试验六步骤五得到的磁性聚苯乙烯微球金纳米岛载体在磁铁富集作用前后分别进行了扫描电子显微镜测试，对比后得到图7。从图7中，可以看出磁性聚苯乙烯小球在吸附金纳米种子功能载体后仍具有很强的磁富集效果。
[0130]对试验六得到的磁性聚苯乙烯微球金纳米岛载体进行紫外吸收光谱测试，得到图
8。从图8中，可以观察到在540nm处具有明显的金等离子吸收峰，因此可以证明磁性聚苯乙烯小球表面可以吸附金纳米种子，从而为后面进一步生长金纳米岛膜提供材料支撑。
[0131]试验七:金属纳米岛载体表面修饰肿瘤标志物抗体分子制备成微阵列生物芯片在肿瘤的早期检测中的应用，具体操作方法如下:首先将12种不同的肿瘤标志物抗体:糖类抗原CA19-9，糖类抗原CA125，癌胚抗原CEA，铁蛋白Ferritin，人类绒毛膜性腺激素Beta-HCG,甲型胎儿蛋白AFP，前列腺等异性抗原PSA，生长激素HGH，糖类抗原CA15-3，神经元特异烯醇化酶NSE等按不同的阵列修饰到金属纳米岛功能载体表面，再利用5% BSA室温下封闭2h，制备成微阵列生物芯片。然后将病人血清样品滴加到芯片表面，抗体就会把相关的肿瘤标志抗原捕获在表面，最后加入荧光标记的二抗，利用共聚焦扫描仪进行荧光信号扫描和数据分析，即可快速完成对肿瘤的筛查。
[0132]试验八:金属纳米岛载体制备成微阵列生物芯片在系统性红斑狼疮的检测中的应用。(细胞因子分析)
[0133]红斑狼疮患者体内存在多种自身抗体，95%以上病人抗核抗体阳性，可出现抗DNA (双股、单股)、抗组蛋白、抗RNA —非组蛋白、抗核糖核蛋白(主要为Smith抗原)、抗粒细胞、抗血小板、抗平滑肌等抗体，其中抗双股DNA和抗Smith抗原具相对特异性，阳性率分别为60%和30%，而在其他结缔组织病的阳性率，均低于5%。利用玻片金属纳米岛载体表面修饰相应的单克隆抗体分子微阵列，制作生物芯片，实现对系统性红斑狼疮的检测。
[0134]试验九:金属纳米岛载体制备成微阵列生物芯片在类风湿性关节炎的检测中的应用。(细胞因子分析)
[0135]类风湿性关节炎是常见的以关节滑膜慢性炎症病变为主要表现的自身免疫性疾病。检测RA病人免疫球蛋白及补体，对了解RA患者体液免疫功能及在RA诊断、判断预后及治疗效果等方面的作用具有重要作用。利用金属纳米岛载体表面修饰不同的单克隆抗体阵列，可以提高RA患者血清中的免疫球蛋白及补体、类风湿因子(RF)、抗环瓜氨酸肽抗体(抗-CCP)、C-反应蛋白(CRP)、抗链球菌溶血素(ASO)的检测灵敏度。
[0136]试验十:金属纳米岛载体制备成微阵列生物芯片在乙型肝炎病毒的检测中的应用。(传染病检测)
[0137]HBsAg是乙型肝炎病毒(HBV)的外膜蛋白，是血清中首先出现的标志物。在急性肝炎时它很快消失，若6个月以后仍不消失者，可成为慢性肝炎(CH)或HBsAg携带者，并可持续几年或几十年。HBsAg的检测对于乙型肝炎的诊断和鉴别、流行病学的调查、献血员的筛选、预后判断及治疗效果的考察和药物的筛选具有重要的意义。在金属纳米岛载体表面上包被HBs单抗，制备乙肝病毒检测试剂盒，利用夹心法原理检测血清中HBsAg。若样本中含有HBsAg,则被载体表面结合,再加入突光标记的抗HBs多抗,形成夹心复合物,最后通过扫描仪读数，从而判定结果。
[0138] 试验十一:金属纳米岛载体表面修饰肿瘤标志物抗体分子制备成悬浮式生物芯片在肿瘤的早期检测中的应用，具体操作方法如下:首先在以不同尺寸的磁性聚苯乙烯小球等为基底制备金属纳米岛功能载体，然后利用具有不同荧光发射的量子点(如600，700，SOOnm)分别对不同尺寸的聚苯乙烯小球进行编码，并在载体表面分别标记针对不同检测物的核酸、抗体、抗原等分子，从而实现对不同疾病的检测。在捕获目标分子后用荧光标记的二抗对微球进行进一步的标记显色，并利用自主研发的近红外流式细胞计数系统进行数据采集和分子，最终给出诊断结果。
【权利要求】
1.一种金属纳米岛载体，其特征在于:金属纳米岛载体是在载体材料表面形成金属纳米岛而得到的，所述的金属纳米岛是分立的，所述的金属纳米岛的尺寸为10~500nm,所述的金属纳米岛之间的间隙为5~200nm。
2.根据权利要求1所述的一种金属纳米岛载体，其特征在于所述的载体材料为固相材料或悬浮材料；所述的固相材料为二维平面结构；所述的固相材料可以为玻片、硅片、石英、聚偏二氟乙烯膜或硝酸纤维素膜；所述的悬浮材料可以为玻璃微珠、磁珠、聚苯乙烯微球、聚甲基丙烯酸甲酯微球、聚苯乙烯磁性微球或聚甲基丙烯酸甲酯磁性微球；所述的金属可以为银、金-银合金或银/金核壳结构。
3.一种制备金属纳米岛载体的方法，其特征在于:制备方法具体是按照以下步骤进行的: 一、在载体材料表面吸附一层金纳米种子，得到了表面吸附金纳米种子的载体材料； 二、配置生长金属纳米岛的反应溶液:将还原剂加入到含有金属离子的溶液中，混合均匀；其中，所述的还原剂与含有的金属离子的摩尔比为(0.5~2): I ;所述的金属离子的溶液的浓度为0.1~5mM ； 三、将步骤一中得到的表面吸附一层金纳米种子的载体材料放入步骤二中得到的生长金属纳米岛的反应溶液中，在18~30°C下振荡反应2~60min ； 四、将步骤三中反应完成的载体材料取出，用水清洗，干燥，即得到金属纳米岛载体。
4.根据权利要求3所述的制备金属纳米岛载体的方法，其特征在于所述的步骤一中的金纳米种子是通过化学还原法还原Au3+得到的，然后利用物理吸附或化学偶联相互作用结合到载体材料表面的；所述的步骤一中的载体材料表面吸附的金纳米种子的粒径为I~20nmo
5.根据权利要求3所述的制备金属纳米岛载体的方法，其特征在于所述的步骤一中的载体材料为固相材料或悬浮材料；所述的固相材料为二维平面结构；所述的固相材料可以为玻片、硅片、石英、聚偏二氟乙烯膜或硝酸纤维素膜；所述的悬浮材料可以为玻璃微珠、磁珠、聚苯乙烯微球、聚甲基丙烯酸甲酯微球、聚苯乙烯磁性微球或聚甲基丙烯酸甲酯磁性微球；根据权利要求7所述的制备金属纳米岛载体的方法，其特征在于所述的金属可以为银、金-银合金或银/金核壳结构。
6.根据权利要求3所述的制备金属纳米岛载体的方法，其特征在于所述的步骤二中的还原剂为NaBH4, NH2OH, N2H4, CH2O或C6H12O6 ;所述的步骤二中的金属离子溶液为Ag+溶液或Ag+与Au3+的混合溶液。
7.根据权利要求3或6所述的制备金属纳米岛载体的方法，其特征在于所述的步骤二中的还原剂与含有的金属离子的摩尔比为(0.7~1.5): I ;所述的步骤二中的金属离子的溶液的浓度为0.3~5mM。
8.如权利要求1或2所述的金属纳米岛载体在免疫检测中的应用，其特征在于:生物芯片中的捕获分子捕获相应的物质，进行荧光扫描和数据分析，进而完成免疫检测，其中使用所述金属纳米岛载体作为捕获分子的修饰载体制成生物芯片。
9.根据权利要求8所述的金属纳米岛载体在免疫检测中的应用，其特征在于金属纳米岛载体在免疫检测中的应用包括:所述的金属纳米岛载体表面修饰肿瘤标志物抗体分子制备成生物芯片实现在肿瘤的早期检测中的应用；所述的金属纳米岛载体表面修饰自体免疫疾病相关的抗原、抗体分子制备成生物芯片实现在自体免疫疾病检测中的应用；所述的金属纳米岛载体表面修饰乙肝抗体分子、流感病毒DNS序列、结合病抗体、疟原虫抗原(或抗体)、大肠杆菌抗体制备成生物芯片实现在传染性疾病的检测中的应用；所述的金属纳米岛载体表面修饰白细胞介素、干扰素、肿瘤坏死因子超家族、集落刺激因子、趋化因子或生长因子的单克隆抗体制备成生物芯片实现在细胞因子的检测中的应用；所述的金属纳米岛载体表面修饰对不同疾病的单克隆抗体制备成生物芯片实现在对捕获的目标细胞分泌物进行Elispot检测中的应用。
10.根据权利要求8或9中所述的金属纳米岛载体在免疫检测中的应用，其特征在于所述的生物芯片为微阵列生物芯片或悬浮式生物芯片。
【文档编号】G01N33/577GK103837676SQ201410106206
【公开日】2014年6月4日 申请日期:2014年3月20日 优先权日:2014年3月20日
【发明者】刘开, 袁超, 刘庄, 赵信博 申请人:苏州纳达生物科技有限公司