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专利名称：对谷类中b型单端孢霉烯族毒素的提取纯化检测方法
技术领域：
本发明涉及谷类中B型单端孢霉烯族毒素的提取纯化检测方法，属于分析测试领域。
背景技术：
由镰刀菌引起的赤霉病是禾谷类作物上非常重要的病害之一，严重影响了世界粮食安全。镰刀菌毒素是镰刀菌产生的一类次生代谢产物。单端孢霉烯族毒素包含有200余种化合物，是镰刀菌毒素中非常重要的一类。脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenoLDON)、 雪腐镰刀菌烯醇(Nivalenol，NIV)及其衍生物属于单端孢霉烯族B类，基本结构为四环的倍半萜，以C8位上的羰基为特征。其中，脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)对谷物污染率和污染水平居于镰刀菌毒素之首，给人、家畜的健康造成巨大威胁。Miller依据DON乙酰化的位置不同，将DON的化学型又分为3-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇(3-acetyldeoxynivalenol， 3-ACD0N)和 15-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇(15-acetyldeoxynivalenol，15-ACD0N)。单端孢霉烯族类化合物较为耐热，需超过200°C才能被破坏，对酸和碱也较稳定， 因此，经过通常烹调加工难以破坏其活性。易受污染的食品主要包括玉米、小麦、黑麦、燕麦等谷物。检测DON等单端孢霉烯族毒素在粮食中存在情况，并进行监控，对保证人类食品的安全是非常必要的。镰刀菌毒素的检测方法较多，可分为3类①生物检测法，包括皮肤毒性试验、种子发芽试验等；②理化检测法，包括薄层层析、高效液相色谱、气相色谱、气(液)质联用等； ③免疫化学检测法，包括放射性免疫法、荧光极性免疫分析法和酶联免疫吸附(ELISA)法。 其中，高效液相色谱对样品的应用性广，不受分析对象挥发性和热稳定性的限制，而被广泛使用，检测B型单端孢霉烯族毒素多是用香豆素衍生荧光检测器检测，杂峰干扰少，但需要繁琐的衍生步骤。使用紫外检测器检测时，对于自然污染的粮食样品，经多功能柱和免疫亲和柱净化后出现毒素和粮食基体物质共提取、谱图分离度差的问题，如Klotzel等曾报道过应用当前市面上常用的已进行商品化生产的净化柱对自然污染的小麦样品净化检测实验，包括两种免疫亲和柱和基于活性炭和氧化铝柱子作为填料的MycoSep多功能柱的净化效果，实验结果表明，经过这三种常用净化柱净化后用紫外检测器检测，杂质峰较多，受基质干扰严重。毒素存在和粮食基体物质共提取的非特异性相互作用，共提取的峰和毒素信号重叠、覆盖，而且HPLC色谱柱要每个序列结束后冲洗，保护柱也须经常替换。

发明内容
本发明的目的是针对紫外检测器检测中存在杂质峰较多，受基质干扰严重等问题而提供的一种新的B型单端孢霉烯族毒素的分离纯化及检测方法，主要针对D0N、3-ACD0N、 15-ACD0N的检测。本发明是这样实现的所述的一种对谷类中B型单端孢霉烯族毒素的提取纯化检测方法，其特征在于首先将被测谷类样品粉碎后用水振荡提取，然后对提取液进行纯化，再采用HPLC-UV法进行检测，可对谷类样品中的B型单端孢霉烯族化合物进行定性定量分析。在本发明中，所述的对谷类中B型单端孢霉烯族毒素的提取纯化方法，其特征在于称取粉碎后的谷类样品5. Og于50ml的离心管中，加入25ml的H2O漩涡振荡提取30min， 提取液用布氏漏斗抽滤，取IOml滤液加入等体积的无水乙醇4°C沉淀池，在IOOOOrpm下离心lOmin，弃沉淀，取上清液旋转蒸干，加入15ml乙腈-H2O,乙腈和H2O的体积比为2 1， 再加入NaCL，漩涡振荡后静止乙腈和H2O分层，在80°C水浴中加热2min，冷却后弃水相，向乙腈相中加入无水硫酸钠脱水，取5ml乙腈相旋转蒸干，0. 5mlH20分两次振荡提取，合并提取液，经规格为:3ml/60mg的Waters OASISHLB固相萃取小柱进一步纯化，按照小柱使用说明书的要求对小柱进行活化和上样，然后用Iml的乙酸乙酯解析，自然流速，获得解析液， 将解析液旋转蒸干后，用0. 5ml水溶解，最后过0. 22 μ m微孔滤膜，上机待测。在本发明中，所述的对谷类中B型单端孢霉烯族毒素的HPLC-UV检测方法，其特征在于色谱柱C18 ；流动相A乙腈，B 0. 001%的磷酸水溶液；梯度洗脱程序为0 6min， 92. 5 90. 0% 乙腈；6 18min，90% 60% 乙腈；18 22min，60% 乙腈；22 25min， 60% 92. 5 % 乙腈；25 35min，92. 5 % 乙腈；流速0. 8ml/min ；柱温30°C ；进样量 15 μ 1 ；紫外检测器:224nm0在本发明中，所述的对谷类中B型单端孢霉烯族毒素的纯化检测方法，所述的谷类是指玉米或麦类。在本发明中，所述的对谷类中B型单端孢霉烯族毒素的定性定量分析是指对被测谷类样品中B型单端孢霉烯族毒素中的DON或3-ACD0N或15-ACD0N进行定性定量分析。在本发明中，所述的对谷类中B型单端孢霉烯族毒素的定性定量分析是指在高效液相色谱图中，将B型单端孢霉烯族毒素的标样D0N、3-ACD0N和15-ACD0N与被测谷类样品进行对比，根据标样的出峰时间定性，根据峰面积进行定量分析。本发明的优点在于所采用的提取纯化方法使图谱的杂峰干扰少，无需经常更换保护柱，可省去繁琐的衍生化操作步骤；可同时检测B型单端孢霉烯族毒素中的DON、 3-A⑶0N、15-A⑶ON。通过优化流动相等色谱条件，在不衍生的条件下，可以使同分异构体 3-A⑶ON和15-A⑶ON有较好的分离度；虽然梯度洗脱程序A、B相比例波动较大，但基线平稳。


图1是小麦样品1和标准品的高效液相色谱图；图2是小麦样品2和标准品的高效液相色谱图。
具体实施例方式下面通过实施例对本发明进行具体的描述，有必要在此指出的是以下实施例只用于对本发明进行进一步的说明，但不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练人员可以根据上述本发明的内容作出一些非本质的改进和调整。实施例11、标样的选择
标样购于Sigma-Aldrich公司(下同)。2、小麦中B型单端孢霉烯族毒素的提取纯化方法(1)样品制备称取粉碎后的2010年收获的宁麦13号小麦样品5. Og于50ml的离心管中，加入25ml的H2O漩涡振荡提取30min，提取液用布氏漏斗抽滤，取IOml滤液加入等体积的无水乙醇4°C沉淀2h，在IOOOOrpm下离心lOmin，弃沉淀，取上清液旋转蒸干，加入 15ml乙腈-H20(2 1，V/V)，再加入NaCL，漩涡振荡后静止乙腈和H2O分层，在80°C水浴中加热2min，冷却后弃水相，向乙腈相中加入无水硫酸钠脱水，取5ml乙腈相旋转蒸干，0. 5ml H2O分两次振荡提取，合并提取液，在进行OASIS固相萃取小柱纯化 (2)OASIS固相萃取小柱的使用步骤如下a.小柱的活化2ml甲醇淋洗后，再加入2ml H2O淋洗，均为自然流速，之后真空抽干；b.上样上样量为1ml，自然流速，之后真空抽干30min ；c.解析1ml的乙酸乙酯解析， 自然流速。将解析液旋转蒸干后，用0. 5ml水溶解，过0. 22 μ m微孔滤膜，上机待测。3、采用HPLC-UV进行检测，其检测条件色谱柱:C18(250mmX4. 6,5ym)；流动相=A乙腈，B 0. 001%的磷酸水溶液；梯度 O 6min，92. 5 90. 0% 乙腈；6 18min，90% 60% 乙腈；18 22min，60% 乙腈；22 25min，60% 92. 5% 乙腈；25 35min，92. 5 % 乙腈；流速0. 8ml/min ；柱温:30°C ；进样量15 μ 1 ；紫外检测器:224歷。4、图谱分析由图1可见在标样中标准品纯度分别为DON彡99. 4%、3_ACD0N彡98%、15-ACD0N ^ 98. 8% (购于 Sigma-Aldrich)。图谱中 DON、15-ACD0N 和 3-ACD0N 的出峰时间分别为13. 94min、 19. 86min、20. 17min。在样品1中检测到DON，含量为498 μ g/kg，符合我国限量标准ΙΟΟΟμ g/kg，未检测到15-A⑶ON和3-A⑶0N，证明2010年收获的宁麦13号这一批小麦种子可以食用。实施例21、小麦中B型单端孢霉烯族毒素的提取纯化方法(1)样品制备称取粉碎后的2007年收获的宁麦11号小麦样品5. Og于50ml的离心管中，加入25ml的H2O漩涡振荡提取30min，提取液用布氏漏斗抽滤，取IOml滤液加入等体积的无水乙醇4°C沉淀2h，在IOOOOrpm下离心lOmin，弃沉淀，取上清液旋转蒸干，加入 15ml乙腈-H20(2 1，V/V)，再加入NaCL，漩涡振荡后静止乙腈和H2O分层，在80°C水浴中加热2min，冷却后弃水相，向乙腈相中加入无水硫酸钠脱水，取5ml乙腈相旋转蒸干，0. 5ml H2O分两次振荡提取，合并提取液，在进行OASIS固相萃取小柱纯化(2)OASIS固相萃取小柱的使用步骤如下a.小柱的活化2ml甲醇淋洗后，再加入2ml H2O淋洗，均为自然流速，之后真空抽干；b.上样上样量为1ml，自然流速，之后真空抽干30min ；c.解析1ml的乙酸乙酯解析， 自然流速。将解析液旋转蒸干后，用0. 5ml水溶解，过0. 22 μ m微孔滤膜，上机待测。2、采用HPLC-UV进行检测，其检测条件色谱柱:C18(250mmX4. 6,5ym)；流动相=A乙腈，B 0. 001%的磷酸水溶液；梯度 0 6min，92. 5 90. 0 % 乙腈；6 18min，90 % 60 % 乙腈；18 22min，60 % 乙腈；22 25min,60%~ 92. 5% 乙腈；25 35min，92. 5 % 乙腈；流速0. 8ml/min ；柱温:30°C ；进样量15 μ 1 ；紫外检测器:224nm03、图谱分析由图2可见在标样中标准品纯度分别为DON彡99. 4%、3_ACD0N彡98%、15-ACD0N ^ 98. 8% (购于 Sigma-Aldrich)。图谱中 DON、15-ACD0N 和 3-ACD0N 的出峰时间分别为13. 94min、 19.86min、20. 17min。在样品2中检测到DON，含量为1248 μ g/kg，超过我国限量标准1000 μ g/kg, 说明2007年收获的这一批宁麦11号小麦种子不可以食用，同时，还检测到15-A⑶ON和 3-ACD0N 的含量分别为 182 μ g/kg、96 μ g/kg。
权利要求
1.一种对谷类中B型单端孢霉烯族毒素的提取纯化检测方法，其特征在于首先将被测谷类样品粉碎后用水振荡提取，然后对提取液进行纯化，再采用HPLC-UV法进行检测，可对谷类样品中的B型单端孢霉烯族毒素进行定性定量分析。
2.根据权利要求1所述的对谷类中B型单端孢霉烯族毒素的提取纯化检测方法，其特征在于称取粉碎后的谷类样品5. Og于50ml的离心管中，加入25ml的H2O漩涡振荡提取30min，提取液用布氏漏斗抽滤，取IOml滤液加入等体积的无水乙醇4°C沉淀池，在 IOOOOrpm下离心lOmin，弃沉淀，取上清液旋转蒸干，加入15ml乙腈-H2O,乙腈和H2O的体积比为2 1，再加入NaCL，漩涡振荡后静止乙腈和H2O分层，在80°C水浴中加热aiiin，冷却后弃水相，向乙腈相中加入无水硫酸钠脱水，取5ml乙腈相旋转蒸干，0. 5ml H2O分两次振荡提取，合并提取液，经规格为3ml/60mg的Waters OASIS HLB固相萃取小柱进一步纯化，按照小柱使用说明书的要求对小柱进行活化和上样，然后用Iml的乙酸乙酯解析，自然流速， 获得解析液，将解析液旋转蒸干后，用0. 5ml水溶解，最后过0. 22 μ m微孔滤膜，上机待测。
3.根据权利要求1所述的对谷类中B型单端孢霉烯族毒素的提取纯化检测方法，其特征在于色谱柱C18 ；流动相·Λ乙腈，B 0. 001%的磷酸水溶液；梯度洗脱程序为0 6min，92. 5 90. 0 % 乙腈；6 18min，90 % 60 % 乙腈；18 22min，60 % 乙腈；22 25min，60% 92. 5% 乙腈；25 35min，92. 5 % 乙腈；流速0. 8ml/min ；柱温:30°C ；进样量15 μ 1 ；紫外检测器:224nm0
4.根据权利要求1所述的对谷类中B型单端孢霉烯族毒素的提取纯化检测方法，其特征在于所述的谷类是指玉米或麦类。
5.根据权利要求1 4所述的对谷类中B型单端孢霉烯族毒素的提取纯化检测方法， 其特征在于所述的对谷类中B型单端孢霉烯族毒素的定性定量分析是指对被测谷类样品中B型单端孢霉烯族毒素中的DON或3-A⑶ON或15-A⑶ON进行定性定量分析。
6.根据权利要求5所述的对谷类中B型单端孢霉烯族毒素的提取纯化检测方法，其特征在于所述的对被测谷类样品中B型单端孢霉烯族毒素中的DON或3-ACD0N或15-ACD0N 进行定性定量分析是指在高效液相色谱图中，将B型单端孢霉烯族毒素的D0N、3-ACD0N和 15-ACD0N标样与被测谷类样品进行对比，根据标样的出峰时间定性，根据峰面积进行定量分析。
全文摘要
本发明涉及对谷类中B型单端孢霉烯族毒素的提取纯化检测方法，主要针对DON、3-ACDON、15-ACDON的检测。它是将被测样品的水提取液中加入等体积无水乙醇，可沉淀去除大部分的蛋白质和多糖，低温旋转蒸干上清液，加入乙腈-Nacl水溶液，有机相和水相分层，弃水相，可去除强极性的杂质。有机相旋转蒸干后用水溶解，过OASIS固相萃取小柱纯化，包括活化、上样和解析等程序，制得的样品经HPLC-UV检测，参照DON、3-ACDON和15-ACDON标样进行定性定量分析，本方法中，杂质峰对被测样品没有干扰，并且可以使同分异构体3-ACDON、15-ACDON有较好的分离度。
文档编号G01N30/88GK102213656SQ20111008995
公开日2011年10月12日 申请日期2011年4月8日 优先权日2011年4月8日
发明者姚金保, 张平平, 张旭, 杨丹, 耿志明, 马鸿翔 申请人:江苏省农业科学院