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专利名称：一种基于重组ul55蛋白的鸭瘟病毒抗体检测方法
技术领域：
本发明涉及动物医学领域，特别涉及应用重组UL55原核表达蛋白作为包被抗原而建立检测的鸭瘟病毒抗体方法。
背景技术：
鸭瘟(duck plague, DP)是由疱疹病毒科中的DPV引起的常见于鸭、鹅、天鹅等水禽的一种高度致死性传染病。本病死亡率高，传播迅速，自1923年在荷兰首次发生后，已蔓延至世界许多国家和地区，严重威胁着养鸭业的发展。因此迫切需要建立有效可靠的监测手段，以便能及时正确地了解鸭群的健康状态和免疫抗体水平。本病的经典诊断方法为中和试验，但因繁琐耗时(约1 2周)，敏感性较差且实验要求严格，不适于大批量血清样品的检测和在基层推广。用ELISA方法检测病毒特异抗体已被公认为是一种敏感的方法，它比中和试验和血凝抑制试验敏感，而且对不易培养的病毒，或培养周期长、不易引起细胞病变、无法用中和试验检测的病毒，ELISA检测更具有意义，不仅能检测某种病毒的总抗体，而且还可检测针对病毒某一抗原成分的抗体。但是由于DPV全病毒纯化方法的复杂性以及纯度不够理想，阻碍了包被全病毒的ELISA方法(DPV-ELISA)的大规模应用。

发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种基于重组UL55蛋白为抗原的鸭瘟病毒抗体检测方法，所述重组UL55蛋白的获得是通过构建原核表达质粒pET3h-UL55、转化表达菌并发酵培养，收集到大量的含有重组UL55蛋白的菌体沉淀，再通过超声波破碎菌体、重组UL55蛋白包涵体冼涤、纯化及梯度透析而获得的；同时，用Wfestern blotting分析证实该蛋白可与抗DPV阳性血清发生强烈的免疫反应；进一步确定了重组UL55蛋白的包被浓度及一抗、二抗的稀释度，制备了鸭瘟病毒抗体检测方法，该方法避免了繁琐的病毒纯化步骤，且操作简单，特异性、灵敏性较高。为实现上述目的，本发明的技术方案为基于重组UL55蛋白的鸭瘟病毒抗体检测方法，具体步骤为a固相抗原的制备将包被浓度为0. 2mg/ml浓度重组UL55蛋白液固相载体连接， 用封闭液封闭，洗涤去除未结合的抗原及杂质，得固相抗原；b —抗结合将待检血清作160倍的稀释，得稀释血清，即一抗，通过保温反应使所述稀释血清与所述固相抗原结合形成固相抗原抗体复合物，洗涤去除固相载体上杂质；c 二抗结合将酶标二抗作2000倍的稀释，得酶标二抗稀释液，将所述酶标二抗稀释液与所述固相抗原抗体复合物结合，得抗原-抗体-二抗复合物；d显色在步骤c所得抗原-抗体-二抗复合物加入色原底物避光显色后，加入终止液终止反应得显色样品液；e检测并判定将步骤d所述显色样品液用酶标仪测OD45tlnm值，所述OD45tlnm值> 0. 330为阳性，所述OD450nm ( 0. 330则为阴性。
进一步，所述的鸭瘟病毒抗体检测方法的具体步骤为a固相抗原的制备将包被浓度等于0. 2mg/ml的重组UL55蛋白液与固相载体连接，用封闭液封闭，洗涤去除未结合的抗原及杂质，得固相抗原；b —抗结合将待检血清作等于160倍的稀释，得稀释血清，即一抗，通过保温反应使所述稀释血清与所述固相抗原结合形成固相抗原抗体复合物，洗涤去除固相载体上杂质；c 二抗结合将酶标二抗作等于2000倍的稀释，得酶标二抗稀释液，将所述酶标二抗稀释液与所述固相抗原抗体复合物结合，得抗原-抗体-二抗复合物；d显色在步骤c所得抗原-抗体-二抗复合物加入色原底物避光显色后，加入终止液终止反应得显色样品液；e检测并判定将步骤d所述显色样品液用酶标仪测OD45tlnm值，所述OD45tlnm值> 0. 330为阳性，所述OD450nm彡0. 330则为阴性。进一步，步骤a中所述固相载体为酶标板；进一步，步骤a中所述的封闭液为体积浓度为1.0%的牛血清白蛋白；进一步，步骤e中避光显色的时间为30分钟；进一步，步骤a中所述重组UL55蛋白液、步骤b中所述稀释血清及步骤c中所述酶标二抗稀释液的加入量为等体积且大于或等于100μ 1 ；进一步，步骤c中所述酶标二抗为羊抗鸭IgG-HRP ；进一步，步骤d中所述色原底物为四甲基联苯胺；进一步，所述方法还包括空白对照实验和阴性对照实验。本发明的有益效果在于本方法是基于纯化的重组UL55蛋白建立的间接ELISA 法，其特异性好，对鸭病毒性肝炎病毒(DHV)、鸭疫里默氏菌(RA)、鸭大肠杆菌(E. coli), 鸭源沙门氏菌(Salmonella)、鸭肿头性出血症病毒和鸭源流感病毒的阳性血清进行检测， 结果均为阴性；该方法的对酶标板内或板间重复试验显示变异系数均小于10%，能检出经 1 6400倍稀释的DPV弱毒疫苗免疫鸭的阳性血清


为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步的详细描述，凡是涉及蛋白表达的均同时提供原始彩照和黑白照。图中涉及标记及含义如下图I-A为DPV UL55基因的PCR扩增M指Maker III相对分子质量标准；1指以正常DEF基因组DNA为模板的PCR扩增产物；2指以DPV CHv毒株基因组DNA为模板的PCR 扩增产物(箭头所示的是其分子量大小，约为799bp)；图I-B为重组质粒pMD18-UL55的双酶切鉴定M1指相对分子质量标准III，M2为DL2000相对分子质量标准；1指重组质粒 PMD18-UL55用BamH I和Bio I双酶切得到的两个片段；2指UL55PCR扩增产物(箭头所示小片段的分子量大小约为799bp)；图I-C为重组表达载体pET3h-UL55的单酶切和双酶切鉴定M1为DL2000相对分子质量标准；M2指相对分子质量标准DL15000 ；1是UL55基因的 PCR产物；2指重组表达载体pET3h-UL55用BamH I和Bio I双酶切得到的两个片段(箭头所示小片段的分子量大小约为799bp) ；3指重组表达载体pET3h-UL55用BamH I单酶切后得到的线性质粒。图2-A为重组表达蛋白的SDS-PAGE鉴定M为蛋白质相对分子质量标准；1为以 BL21为表达宿主的pET3h空载加IPTG诱导；2、3分别为未加诱导剂的UL55表达产物的上清和包涵体；4、5分别为IPTG诱导所产生的上清和包涵体(箭头所示的蛋白质分子量大小约为40KD)；图2-B为诱导剂IPTG不同终浓度诱导表达结果1_6的IPTG浓度分别为1. 0、 0. 8、、0· 6,0. 4,0. 2、禾口 0. lmmol/L ；图 2-C 为不同温度诱导 pET3^i-UL55 表达结果:1_3 的温度分别为37、30和25°C;图2-D为不同时间诱导pET3h-UL55表达结果1_5的诱导时间分别为 4、5、6、7 和 8h。图3为重组UL55蛋白纯化效果和免疫原性的检测A，SDS-PAGE分析M为蛋白标准(KD) ；1为包涵体洗涤法纯化后再经透析复性的重组UL55蛋白；2为5次洗涤后的重组 UL55包涵体蛋白；Bjestern blotting分析箭头所指是以兔抗DPV抗体为一抗检测复性后的重组UL55蛋白(约为20KD)。
具体实施例方式为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合附图对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例1鸭瘟病毒UL55基因的克隆、原核表达及UL55蛋白的纯化1、材料方法以下将参照附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译，科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。1. 1菌株、质粒和毒株质粒pMD18-T，购自大连宝生物工程有限公司；原核表达质粒pET3h(+)，Novagen 公司产品；克隆宿主菌E. coli DH5a、表达宿主菌E. coli BL21(DE3)和DPV CHv强毒株，由四川农业大学禽病研究中心提供。1. 2试验鸭胚和血清10日龄鸭胚，其种鸭DPV和抗体均为阴性；兔抗DPV抗体，由四川农业大学禽病研究中心提供。1. 3主要试剂琼脂糖、2X傻瓜PCR Mixture、DNA连接酶Mixture、限制性内切酶BamH I和Xhol、 UltraPureTM质粒DNA小量提取试剂盒和UltraPure DNA回收试剂盒等分子生物学试剂及试剂盒购自大连宝生物公司、北京赛百盛基因技术有限公司、华美生物工程公司和Bio-Rad 公司；其它试剂均为分析纯，购自上海生工生物技术有限公司。2实验方法2. 1 DPV UL55 基因的克隆2. 1. 1引物设计利用Primer Premier5. 0 软件，参考 UL55 基因序列(GenBank 登录号EU071034)， 由宝生物生物技术有限公司合成。引物序列F :5，-GGATCCATGGCCGACGCGAAGGCGGT-3’ (划线部分为 BamH I 位点)；
R :5，-CTCGAGGCTTGGGTCTTTACTTTTTGCGCGGAAC-3’ (划线部分为 Xho I 位点)。合成后，以适量灭菌去离子水溶解，使其终浓度为20mmol/L，_20°C保存备用。2. 1. 2DPV基因组DNA的提取2. 1. 2. IDEF的制作方法取IOd日龄健康鸭胚，分别用5%碘酒和75%酒精消毒蛋壳表面。无菌操作条件下将胚体取出并用PBS将胚体洗净，剪去头、翅、腿和内脏，PBS冲洗后将胚体剪成Imm大小的小块，加PBS适量，之后置于三角瓶内，加细胞分散剂(体积分数为2.5%的胰蛋白酶)15(^1/胚，于371水浴中消化；31^11。立即将细胞悬液以4000r/ min离心5min，倾弃上清，细胞沉淀用适量的MEM悬浮后，用5层纱布过滤，向滤液中加入 10%小牛血清和100IU/ml双抗后，分装于IOOml细胞培养瓶中，7ml/瓶，水平静置于37°C 细胞培养箱中进行培养。2. 1. 2. 2 DPV增殖取刚刚长成致密单层的DEF，弃生长营养液，用灭菌PBS清洗细胞表面2次后，加入DPV病毒液2 3ml覆盖细胞表面进行吸附，37°C吸附120min后弃病毒液，然后加含3%小牛血清和100IU/ml双抗的MEM维持营养液，之后37°C培养。同时做未接毒的DEF对照。2. 1. 2. 3 DNA提取方法直接从感染细胞中提取DPV基因组DNA的具体步骤如下 (1)选取用DPV种毒感染后细胞病变(CPE)达60% 70%的DEF (IOOml细胞瓶)；同时选取细胞形态正常的DEF作对照；(2)倾去细胞培养液，加入500 μ 1的细胞裂解液，同时加蛋白酶K(10mg/ml)至终浓度为200 μ g/ml，轻轻混勻后，37°C孵育IOmin ； (3)将细胞悬浮液倒入EP离心管中，并用500μ 1的饱和酚洗涤残存于细胞瓶内的裂解物，倒入离心管中； (4)用饱和酚/氯仿及氯仿抽提2次，再用水饱和乙醚处理2次；(5)加1/10倍体积3mol/ L NaAC,混勻后，加入2倍体积冷无水乙醇，_20°C放置30 60min ； (6) 13000r/min离心 20min，沉淀用预冷的70%乙醇洗涤两次；(7)真空抽干后，溶于适量TE缓冲液中，加入1 μ 1 RNA酶，37°C作用30min，_20°C保存备用。2. 1. 3PCR 扩增 DPV UL55 基因PCR反应体系为
权利要求
1.基于重组UL55蛋白的鸭瘟病毒抗体检测方法，其特征在于，具体步骤为a固相抗原的制备将包被浓度为0. 2mg/ml的重组UL55蛋白液固相载体连接，用封闭液封闭，洗涤去除未结合的抗原及杂质，得固相抗原；b —抗结合将待检血清作160倍的稀释，得稀释血清，即一抗，通过保温反应使所述稀释血清与所述固相抗原结合形成固相抗原抗体复合物，洗涤去除固相载体上杂质；c 二抗结合将酶标二抗作2000倍的稀释，得酶标二抗稀释液，将所述酶标二抗稀释液与所述固相抗原抗体复合物结合，得抗原-抗体-二抗复合物；d显色在步骤c所得抗原-抗体-二抗复合物加入色原底物避光显色后，加入终止液终止反应得显色样品液；e检测并判定将步骤d所述显色样品液用酶标仪测OD45tlnm值，所述OD45tlnm值> 0. 330 为阳性，所述OD45tlnm ( 0. 330则为阴性。
2.根据权利要求1所述的鸭瘟病毒抗体检测方法，其特征在于步骤a中所述固相载体为酶标板。
3.根据权利要求1所述的鸭瘟病毒抗体检测方法，其特征在于步骤a中所述的封闭液为体积浓度为1.0%的牛血清白蛋白。
4.根据权利要求1所述的鸭瘟病毒抗体检测方法，其特征在于步骤d中避光显色的时间为30分钟。
5.根据权利要求1所述的鸭瘟病毒抗体检测方法，其特征在于步骤a中所述重组 UL55蛋白液、步骤b中所述稀释血清及步骤c中所述酶标二抗稀释液的加入量为等体积且大于或等于100 μ 1。
6.根据权利要求1所述的用于检测鸭瘟病毒抗体的方法，其特征在于步骤c中所述酶标二抗为羊抗鸭IgG-HRP。
7.根据权利要求1所述的鸭瘟病毒抗体检测方法，其特征在于步骤d中所述色原底物为四甲基联苯胺。
8.根据权利要求1所述的鸭瘟病毒抗体检测方法，其特征在于所述方法还包括空白对照实验和阴性对照实验。
全文摘要
本发明涉及动物医学领域，特别涉及用于检测鸭瘟病毒抗体的方法，具体包括固相抗原的制备、一抗结合、二抗结合、显色及检测并判定等步骤，本方法是基于纯化的重组UL55蛋白建立的间接ELISA法，其特异性好，对鸭病毒性肝炎病毒(DHV)、鸭疫里默氏菌(RA)、鸭大肠杆菌(E.coli)、鸭源沙门氏菌(Salmonella)、鸭肿头性出血症病毒和鸭源流感病毒的阳性血清进行检测，结果均为阴性；该方法的对酶标板内或板间重复试验显示变异系数均小于10％，能检出经1∶6400倍稀释的DPV弱毒疫苗免疫鸭的阳性血清。
文档编号G01N33/531GK102183658SQ20111004706
公开日2011年9月14日 申请日期2011年2月28日 优先权日2011年2月28日
发明者吴英, 汪铭书, 程安春, 陈孝跃 申请人:四川农业大学实验动物工程技术中心