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专利名称：一种时间分辨荧光法综合检测胃癌试剂盒及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物和医学检测技术领域，具体涉及一种在同一反应体系内同时综合检测胃癌肿瘤标志物指标CA724、CEA、CA 199的时间分辨荧光免疫检测试剂盒，同时还涉及该试剂盒在综合检测胃癌肿瘤标志物CA724、CEA、CA 199中的应用。
背景技术：
全球每年新发胃癌100余万，中国占42%,死亡约80万，中国占35%,是胃癌发病率和死亡率最高的国家之一，发病率和死亡率均是世界平均水平两倍多。资料显示，2007年，在我国前10位癌症中，胃癌发病率为第二位，死亡率为第二位；胃癌发病率和死亡率的男女之比均为2比I ;农村的发病率是城市的1.6倍、农村的死亡率是城市的1.9倍；死亡/发病比率(相当于患病后的病死风险)为第八位。胃癌的发病率随着年龄的增加而显著升高，发病的高峰年龄在50岁 80岁，但已逐年呈现年轻化趋势，胃癌中19 35岁患者的比例40年来已从1.7%升至当前的3.3%。目前国人死因1/4是癌症,癌症死因的1/4是胃癌，在消化系统恶性肿瘤死亡病例中，约半数死于胃癌。胃癌疗效与病期早晚和诊治方法及手段密切相关，早期胃癌经足够的治疗后90%以上患者能生存5年以上或治愈，而晚期胃癌患者，治疗后5年生存率不足5%，因此早期确诊依然是治疗该病的关键。目前，诊断胃癌的常用检测指标有CA724、CEA、CA199等几种。在实际诊断胃癌时，一般是用CA724、CEA、CA 199三种指标综合确诊胃癌，因为三项指标综合分析在特异性和敏感度上明显高于单一指标。目前常规实验室或医疗单位用于检测该三项指标通常分别采用单一试剂盒，即一个试剂盒针对一种肿瘤标记物进行检测，此种方式存在的缺点是:1、检测步骤繁多，费时费力；2、几种标记物分别采用几种单指标试剂盒检测，由于不同生产厂家的试剂盒存在差异，且同一厂家的不同试剂盒由于检测的标记物不同可能会存在控制条件、参数的差异而导致检测结果存在误差，此种误差在综合分析三种标记物的特异性和敏感性上会产生较大的影响，可能导致判断结果相差甚远。因此，开发一种能够在相对同一的检测条件下同时能够检测该三种肿瘤标记物的试剂盒，就能降低由于人为原因造成的检测误差，大大提高综合分析检测结果的特异性和敏感性，为下一步的研究或判断做出准确的结论提供更充分的依据。

发明内容
本发明的目的是为了解决现有技术中存在的问题，提供一种在同一反应体系内同时综合检测胃癌肿瘤标志物指标CA724、CEA、CA199的时间分辨荧光免疫检测试剂盒。本发明的目的还在于提供一种该试剂盒的应用。为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案是:一种时间分辨荧光法综合检测胃癌试剂盒，把三种胃癌肿瘤标志物CA724、CEA、CA 199综合在同一微孔的同一反应体系内，采用时间分辨荧光免疫法检测，该试剂盒包括:分别抗CA724、CEA、CA199第一株单克隆抗体混合抗体包被的微孔板；用Eu3+标记的抗CA724、Tb3+标记的抗CA199、Sm3+标记的抗CEA第二株单克隆抗体混合抗体；分析缓冲液；共用荧光增强剂；洗涤液；质控品。所述的第一株单克隆抗体混合抗体包被的微孔板的制备方法为:把分别抗CA724、CEA、CA199第一株单克隆抗体混合抗体用包被缓冲液稀释，制得抗体包被液，然后向微孔板的每个孔中分别加入100 μ I的所述抗体包被液，于37°C包被2小时，然后用生理盐水冲洗微孔板三次，然后再向微孔板的每个孔中分别加入200 μ I的封板液，于室温封闭2小时或于4°C封闭过夜，然后用生理盐水冲洗微孔板两次，冷冻干燥，制得第一株单克隆抗体混合抗体包被的微孔板。其中，所述抗体包被液中，分别抗CA724、CEA、CA 199的第一株单克隆抗体的浓度均为 0.010 0.019g/L。所述用Eu3+标记的抗CA724、Tb3+标记的抗CA199、Sm3+标记的抗CEA第二株单克隆抗体混合抗体中，用Eu3+标记的抗CA724抗体、Tb3+标记的抗CA199抗体、Sm3+标记的抗CEA抗体的质量配比为:Eu3+标记的抗CA724抗体:Tb3+标记的抗CA199抗体:Sm3+标记的抗 CEA 抗体=(3 6): (3 7): (5 9)。分析缓冲液的制备方法为:向每升浓度为0.05mol/L、pH值为8.0的Tris-Hcl缓冲液中加入9g NaCU0.5g NaN3UOg BSA、0.1ml吐温_40、5g聚乙二醇，混合均匀，即制得分析缓冲液。所述共用荧光增强剂的制备方法为:解离部分:将70 200 μ mol的PTA、2 7 μ mo I的氧化乾、0.6g的Triton X-100和300ml的乙醇混合,用水定容至I升,用乙酸调pH值至3.5，制得解离部分；增强部分:将0.1 0.4mmol的邻菲罗啉和0.2mol的Tris混合，用水定容至1L，制得增强部分。所述洗涤液的制备方法为:在浓度为0.01mol/L、pH值为7.4的PBS缓冲液中加入吐温-20，混匀，制得吐温-20质量百分比浓度为0.05%的PBS溶液，然后用质量百分比浓度为0.2%的NaN3溶液防腐处理，制得洗涤液。所述质控品为CA724、CEA、CA 199标准品的混合物。一种时间分辨荧光法综合检测胃癌试剂盒在综合检测胃癌肿瘤标志物CA724、CEA, CA 199中的应用。所述的试剂盒在综合检测胃癌肿瘤标志物CA724、CEA、CA 199中的应用，包括以下步骤:(I)用分析缓冲液稀释质控品，制成具有系列浓度梯度包含有CA724、CEA、CA199标准品的混合溶液；(2)将待测样品与步骤(I)制备的标准品混合溶液分别加入抗CA724、CEA、CA 199第一株单克隆抗体混合抗体包被的微孔板的不同孔中，然后再向孔中加入能分别与CA724、CEA、CA 199结合的标记有稀土离子螯合物的第二株单克隆抗体混合抗体，之后加入共用荧光增强剂，进行时间分辨荧光免疫检测，得到发光值；(3)根据测定的具有系列浓度梯度的包含CA724、CEA、CA199标准品的混合溶液的发光值做标准曲线；(4)以测定的待测样品中的CA724、CEA、CA 199发光值和标准品中CA724、CEA、CA 199各自的标准曲线的发光值做比较，得出待测样品中CA724、CEA、CA 199各自的含量。所述待测样品为人体血清。
进一步的，所述包被缓冲液的制备方法为:取浓度为0.07mol/L、pH值为9.3的碳酸盐缓冲液，然后用质量百分比浓度为0.2%的NaN3溶液防腐处理，制得包被缓冲液。所述封板液的制备方法为:向浓度为0.05mol/L、pH值为7.4的PBS缓冲液中加入BSA,配制成BSA质量百分比浓度为1%的BSA的PBS缓冲液，然后用质量百分比浓度为0.2%的NaN3溶液防腐处理，制得封板液。本发明提供的试剂盒，采用时间分辨荧光免疫检测方法，实现同时综合检测三项胃癌肿瘤标志物CA724、CEA、CA199的目的。时间分辨荧光免疫分析(TRFIA)是一种以稀土离子为标记物，根据稀土离子螯合物的发光特点，用时间分辨技术测定特异性荧光的技术方法。TRFIA利用稀土离子的激发光和发射光的波长不同，同时发射光具有长的衰减时间，这样可以有效的排除非特异性荧光的干扰，具有线性范围宽、灵敏度高和稳定性好等优点，另外，可以利用不同的稀土离子的不同的发射光波长和不同的衰减时间，实现同一反应体系内同时检测多个标志物，这样和单个指标分开检测相比可以节约时间、人员、试剂等，这些特点正好适合本发明的同时在同一反应体系内检测多指标。本发明提供的胃癌肿瘤标志物CA724、CEA、CA 199时间分辨荧光免疫检测试剂盒，具有非常好的线性范围，检测CA724的线性范围为2U/ml 300U/ml，检测限为lU/ml ;检测CEA的线性范围为2.0ng/ml 120ng/ml，检测限为0.5ng/ml ;检测CA199的线性范围为12U/ml 400U/ml，检测限为6U/ml。各检测指标的阳性参考值分别为:CA724 > 7U/ml ；CEA > 5ng/ml ；CA199 > 30U/ml。本发明提供的胃癌肿瘤标志物CA724、CEA、CA199时间分辨荧光免疫检测试剂盒可用于胃癌的临床辅助诊断、疗效观察及预后判断，对胃癌肿瘤的治疗和预防具有重要意义。采用本发明提供的试剂盒可实现在同一反应体系内同时综合检测胃癌肿瘤标志物指标CA724、CEA、CA199，检测操作简单，步骤少，所需时间短，方便快捷；检测结果准确，避免了现有的采用三种单项试剂盒分别检测指标CA724、CEA、CA199，再进行综合判断而引起的判断误差，大大提高了检测结果的特异性和敏感性，为下一步的研究或判断做出准确的结论提供了可靠依据。


图1为本发明实施例1提供的试剂盒同一微孔内同一反应体系反应原理不意图；图2为本发明实施例1提供的试剂盒与深圳新产业公司的单指标试剂盒测试CA724相关回归分析图；图3为本发明实施例1提供的试剂盒与深圳新产业公司的单指标试剂盒测试CA199相关回归分析图；图4为本发明实施例1提供的试剂盒与Abbott公司的单指标试剂盒测试CEA相关回归分析图。
具体实施例方式下面通过具体实施例对本发明的技术方案进行详细说明。实施例1本实施例提供的胃癌肿瘤标志物CA724、CEA、CA 199时间分辨荧光免疫检测试剂盒，包括:抗CA724的抗体C7189、抗CA199的抗体ab3982、抗CEA的抗体MAM02-008三种单克隆抗体组成的混合抗体包被的微孔板；用Eu3+标记的C7164抗体(抗CA724的抗体)、用Tb3+标记的ab116024抗体(抗CA199的抗体)、用Sm3+标记的MAM02-881抗体(抗CEA的抗体)三种单克隆抗体组成的混合抗体；分析缓冲液；共用荧光增强剂；洗涤液；CA724、CEA、CA199三种标准品混合组成的质控品。该试剂盒还包括阴性对照、阳性对照、底物等其它相关试剂。所述试剂盒中，C7189、C7164抗体为自制；ab3982、abl 16024抗体购自abeam公司；MAM02-008.MAM02-881 抗体购自 Meridian 公司。C7189、ab3982、MAM02-008混合抗体包被的微孔板的制备方法为:把混合抗体用包被缓冲液稀释，制得混合抗体包被液，混合抗体包被液中，分别抗CA724、CEA、CA199的第一株单克隆抗体的浓度均为0.014g/L，即混合抗体包被液中，抗体C7189、ab3982、MAM02-008的浓度均为0.014g/L，然后向微孔板的每个孔中分别加入100 μ I的混合抗体包被液，于37°C包被2小时，然后用生理盐水冲洗微孔板三次，然后再向微孔板的每个孔中分别加入200 μ I的封板液,于室温封闭2小时,然后用生理盐水冲洗微孔板两次,冷冻干燥，制得混合抗体包被的微孔板，密封于铝箔袋中，4°C保存备用。其中，包被缓冲液的制备方法为:取浓度为0.07mol/L、pH值为9.3的碳酸盐缓冲液，然后用质量百分比浓度为0.2%的NaN3溶液防腐处理，制得包被缓冲液。封板液的制备方法为:向浓度为0.05mol/L、pH值为7.4的PBS缓冲液中加入BSA，配制成BSA质量百分比浓度为1%的BSA的PBS缓冲液，然后用质量百分比浓度为0.2%的NaN3溶液防腐处理，制得封板液。用Eu3+标记的C7164抗体、用Tb3+标记的abl 16024抗体、用Sm3+标记的MAM02-881抗体三种单克隆抗体组成的混合抗体的制备方法为:将Eu3+标记的C7164抗体、Tb3+标记的abll6024抗体、Sm3+标记的MAM02-881抗体以质量比:Eu3+标记的C7164抗体:Tb3+标记的abl 16024抗体:Sm3+标记的MAM02-881抗体=5:5:7混合，制得混合抗体。其中用Eu3+标记的C7164抗体、用Tb3+标记的abl 16024抗体、用Sm3+标记的MAM02-881抗体的制备方法为:每种抗体的标记流程步骤相同，只是分别抗CA724、CEA、CA 199的抗体分别对应的稀土离子螯合物标记物为N1-对异硫氰酸苄基-DTTA-Eu、N1-对异硫氰酸苄基-DTTA-Sm、N1-对异硫氰酸苄基-DTTA-Tb。下面以N1-对异硫氰酸苄基-DTTA-Eu标记的C7164抗体为例，其标记的具体制备方法和步骤为:(I)标记前应用截留分子量为50kDa的离心柱对C7164抗体进行标记前纯化处理，具体步骤如下:悬空加入Img C7164抗体于50kDa的离心柱中，9000rpm离心8分钟,弃掉滤液；往离心柱中加入200 μ I标记缓冲液，9000rpm离心8分钟，弃掉滤液，该步骤重复四次，最后一次将离心管取出，弃掉滤液；往离心柱中加入50 μ I标记缓冲液，让其静置I分钟，然后将离心柱的滤膜反转装入离心管中，SOOOrpm离心6分钟，收集滤液，即得到待标记的C7164抗体；其中，标记缓冲液为50mmol/L、pH值为9.0的碳酸盐缓冲液；(2)称取稀土离子螯合物标记物N1-对异硫氰酸苄基-DTTA-Eu 0.2mg，W；V80yl超纯水进行溶解，制成螯合试剂；将螯合试剂加入到盛有待标记抗体C7164的EP管中，混合均匀；置于摇床上4°C过夜，制得标记好的抗体C7164，即用Eu3+标记的C7164抗体；用三倍柱体积的PBS缓冲液作为柱平衡液平衡Superdex 200 I X 30cm柱，用移液器吸取用Eu3+标记的C7164抗体缓慢上样，用洗脱液进行洗脱，流速控制在lml/min，蛋白检测仪检测到蛋白峰收集样品，将收集的目的产物经过0.22 μ m滤膜除菌；用比活度测定方法对标记抗体进行标记率的计算与分析。长期储存标记抗体可以将高纯度的BSA加入到标记抗体溶液中，BSA的终浓度为0.1%，可置于4°C或_20°C进行保存。分析缓冲液的制备方法为:向每升浓度为0.05mol/L、pH值为8.0的Tris-Hcl缓冲液中加入9g NaCU0.5g NaN3UOg BSA、0.1ml吐温_40、5g聚乙二醇，混合均匀，即制得分析缓冲液。共用荧光增强剂的制备方法为:解离部分:将100 μ mol的ΡΤΑ、4 μ mol的氧化钇、
0.6g的Triton X-100和300ml的乙醇混合,用水定容至I升,用乙酸调pH值至3.5,制得解离部分；增强部分:将0.3mmol的邻菲罗啉和0.2mol的Tris混合,用水定容至I升，制得增强部分。洗涤液的制备方法为:在浓度为0.0lmol/L、pH值为7.4的PBS缓冲液中加入吐温-20，混匀，制得吐温-20质量百分比浓度为0.05%的PBS溶液，然后用质量百分比浓度为
0.2%的NaN3溶液防腐处理，制得洗涤液。质控品为CA724、CEA、CA199标准品的混合物。CA724自制，CEA购自Abnova公司，CA199购自Acris公司。实施例2本发明实施例1提供的试剂盒在综合检测胃癌肿瘤标志物CA724、CEA、CA 199中的应用，即采用本发明实施例1提供的试剂盒，同时综合检测胃癌肿瘤标志物CA724、CEA、CA199时间分辨荧光免疫检测方法，其反应原理如图1所示，采用双抗体夹心法，包括以下步骤:(I)用分析缓冲液稀释CA724、CEA、CA199蛋白标准品混合物，即质控品，制成具有系列浓度梯度包含有CA724、CEA、CA199蛋白标准品的混合溶液；(2)分别取100 μ I待测样品人体血清和步骤(I)制备的蛋白标准品混合溶液，力口入抗体C7189、ab3982、MAM02-008三种单克隆抗体组成的混合抗体包被的微孔板的不同孔中，37°C温育I小时，三次洗涤(洗涤时所用洗涤液的配制方法为:每升PBS缓冲液中加入9g氯化钠、0.5ml吐温-20，摇匀，即可)，之后加入100 μ I混合标记抗体工作液(用分析缓冲液以体积比1:3000稀释混合标记抗体储存液，制得混合标记抗体工作液，每100 μ I该混合标记抗体工作液中含有Eu3+标记的C7164抗体50ng、Tb3+标记的abll6024抗体50ng、Sm3+标记的MAM02-881抗体70ng，其余为分析缓冲液)，震荡均匀，37°C温育I小时，用洗涤液洗5次，在吸水纸上控干，加入200 μ I共用荧光增强剂的解离部分，震荡5分钟，加入20 μ I共用荧光增强剂的增强部分，震荡8分钟，在时间分辨荧光仪上测量荧光强度，激发光波长为315nm ;647nm、612nm、544nm 分别为 Sm3+、Eu3+、Tb3+ 的最强的发射光峰；500 微秒、200 微秒、50微秒分别为Eu3+、Tb3+、Sm3+的延迟时间；分别测量各自的发光值。把不同浓度的CA724、CEA、CA199蛋白混合标准品中各指标分别和各自的发光值做标准曲线，得到不同指标的各自标准曲线，待测样品人体血清的浓度按标准曲线计算得出。得到试剂盒的精密度:CA724分析内和分析间的变异系数分别为2.9% 4.8%、4.1% 6.5% ；CA199分析内和分析间的变异系数分别为3.9% 6.7%、4.8% 7.6% ；CEA分析内和分析间的变异系数分别为4.7%
7.5%、5.9% 8.9%ο
实施例3用本发明的试剂盒检测40份血清样本得到的CA724、CEA、CA 199三个指标的数值和用同样的40份血清样本分别用深圳新产业公司的单指标试剂盒测试CA724、深圳新产业公司的单指标试剂盒测试CA199、Abbott公司的单指标试剂盒测试CEA所得到的数据分别做回归相关性分析，分别对应附图2、3、4，从附图可以看出，本发明试剂盒测试得到的各指标数据和分别用单指标试剂盒测试得到的数据具有很好的相关性。
权利要求
1.一种时间分辨荧光法综合检测胃癌试剂盒，把三种胃癌肿瘤标志物CA724、CEA、CA 199综合在同一微孔的同一反应体系内，米用时间分辨突光免疫法检测,其特征在于:该试剂盒包括:分别抗CA724、CEA、CA199第一株单克隆抗体混合抗体包被的微孔板；用Eu3+标记的抗CA724、Tb3+标记的抗CA199、Sm3+标记的抗CEA第二株单克隆抗体混合抗体；分析缓冲液；共用荧光增强剂；洗涤液；质控品。
2.根据权利要求1所述的时间分辨荧光法综合检测胃癌试剂盒，其特征在于:所述的第一株单克隆抗体混合抗体包被的微孔板的制备方法为:把分别抗CA724、CEA、CA199第一株单克隆抗体混合抗体用包被缓冲液稀释，制得抗体包被液，然后向微孔板的每个孔中分别加入100 μ I的所述抗体包被液，于37°C包被2小时，然后用生理盐水冲洗微孔板三次，然后再向微孔板的每个孔中分别加入200 μ I的封板液,于室温封闭2小时或于4°C封闭过夜，然后用生理盐水冲洗微孔板两次，冷冻干燥，制得混合抗体包被的微孔板。
3.根据权利要求2所述的时间分辨荧光法综合检测胃癌试剂盒，其特征在于:所述抗体包被液中，分别抗CA724、CEA、CA 199的第一株单克隆抗体的浓度均为0.010 0.019g/L0
4.根据权利要求1所述的时间分辨荧光法综合检测胃癌试剂盒，其特征在于:所述用Eu3+标记的抗CA724、Tb3+标记的抗CA199、Sm3+标记的抗CEA第二株单克隆抗体混合抗体中，用Eu3+标记的抗CA724抗体、Tb3+标记的抗CA199抗体、Sm3+标记的抗CEA抗体的质量配比为:Eu3+标记的抗CA724抗体:Tb3+标记的抗CA199抗体:Sm3+标记的抗CEA抗体=(3 6): (3 7): (5 9)。
5.根据权利要求1所述的时间分辨荧光法综合检测胃癌试剂盒，其特征在于:所述共用荧光增强剂的制备方法为:解离部分:将70 200 μ mo I的PTA、2 7 μ mol的氧化钇、0.6g的Triton X-100和300ml的乙醇混合,用水定容至I升，用乙酸调pH值至3.5,制得解离部分；增强部分:将0.1 0.4mmol的邻菲罗啉和0.2mol的Tris混合,用水定容至1L,制得增强部分。
6.根据权利要求1所述的时间分辨荧光法综合检测胃癌试剂盒，其特征在于:所述洗涤液的制备方法为:在浓度为0.01mol/L、pH值为7.4的PBS缓冲液中加入吐温_20，混匀，制得吐温-20质量百分比浓度为0.05%的PBS溶液，然后用质量百分比浓度为0.2%的NaN3溶液防腐处理，制得洗涤液。
7.根据权利要求1所述的时间分辨荧光法综合检测胃癌试剂盒，其特征在于:所述质控品为CA724、CEA、CA 199标准品的混合物。
8.—种权利要求1-7任一所述的时间分辨荧光法综合检测胃癌试剂盒在综合检测胃癌肿瘤标志物CA724、CEA > CA 199中的应用。
9.根据权利要求8所述的试剂盒在综合检测胃癌肿瘤标志物CA724、CEA、CA199中的应用，其特征在于，包括以下步骤: (1)用分析缓冲液稀释质控品，制成具有系列浓度梯度包含有CA724、CEA、CA199标准品的混合溶液； (2)将待测样品与步骤(I)制备的标准品混合溶液分别加入抗CA724、CEA、CA199第一株单克隆抗体混合抗体包被的微孔板的不同孔中，然后再向孔中加入能分别与CA724、CEA、CA 199结合的标记有稀土离子螯合物的第二株单克隆抗体混合抗体，之后加入共用荧光增强剂，进行时间分辨荧光免疫检测，得到发光值； (3)根据测定的具有系列浓度梯度的包含CA724、CEA、CA199标准品的混合溶液的发光值做标准曲线； (4)以测定的待测样品中的CA724、CEA、CA199发光值和标准品中CA724、CEA、CA199各自的标准曲线的发光值做比较，得出待测样品中CA724、CEA、CA 199各自的含量。
10.根据权利要求9所述的试剂盒在综合检测胃癌肿瘤标志物CA724、CEA、CA199中的应用，其特征在于:所述待测样品为人体血清。
全文摘要
本发明涉及生物和医学检测技术领域，具体涉及一种在同一反应体系内同时综合检测胃癌肿瘤标志物指标CA724、CEA、CA199的时间分辨荧光免疫检测试剂盒，同时还涉及该试剂盒在综合检测胃癌肿瘤标志物CA724、CEA、CA199中的应用。该试剂盒包括分别抗CA724、CEA、CA199第一株单克隆抗体混合抗体包被的微孔板；用Eu3+标记的抗CA724、Tb3+标记的抗CA199、Sm3+标记的抗CEA第二株单克隆抗体混合抗体；分析缓冲液；共用荧光增强剂；洗涤液；质控品。本发明提供的试剂盒可用于胃癌的临床辅助诊断、疗效观察及预后判断，对胃癌肿瘤的治疗和预防具有重要意义，同时检测三个肿瘤标志物，简化了检测步骤，提高了检测数据综合分析的特异性和灵敏性。
文档编号G01N33/577GK103116025SQ20121051056
公开日2013年5月22日 申请日期2012年12月4日 优先权日2012年9月20日
发明者王嘎, 程自卿 申请人:河南生生医疗器械有限公司