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专利名称：一种转Bt作物生境中昆虫体内痕量Bt毒蛋白的检测方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及ー种转Bt作物生境中昆虫体内痕量Bt毒蛋白的检测方法。
背景技术：
现有技术中，对作物中Bt蛋白含量的检测通常采用酶联免疫吸附剂测定法(简称 ELISA)来检测，其中双抗体夹心法酶联免疫试剂盒较为常用，其測定原理是抗原的固相化及抗原的酶标记。该方法中，结合在固相载体表面的抗原仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性；在测定时，受检标本(測定其中的抗体或抗原)与固相载体表面的抗原或抗体起反应，用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开；再加入酶标记的抗原或抗体通过反应而结合在固相载体上。此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例；加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性和定量分析。但是，其不足在于很难測定到非靶标害虫或天敌昆虫体内的Bt毒蛋白含量。因为一些非靶标天敌昆虫间接取食Bt作物，或ー些害虫因为取食方式的不同，如取食Bt作物的不同部位，导致摄入Bt毒蛋白的含量很少，这些害虫或天敌昆虫体内的Bt毒蛋白含量一般在1纳克每克体重以下，而现有的酶联免疫吸附剂测定法最低检测限在1. 2纳克每克体重以上。

发明内容
本发明的目的在于发明ー种新型的转Bt作物生境中昆虫体内痕量Bt毒蛋白的检测方法，解决上述问题。为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下ー种转Bt作物生境中昆虫体内痕量Bt毒蛋白的检测方法，包括步骤如下第一歩，采集在转Bt作物田间生长的待测昆虫，制作待测虫液；第二歩，取在实验室中非转Bt基因植物中生长的与所述待测昆虫同种或同类昆虫，制作对照虫液；第三歩，用所述对照虫液配置系列浓度的标准Bt毒蛋白；第四歩，利用酶联免疫方法测得标准Bt毒蛋白和待测虫液在波长为650纳米处的光密度值； 第五歩，根据标准Bt毒蛋白的浓度和相对应的光密度值得到一个标准方程，根据所述标准方程计算待测虫液的Bt毒蛋白浓度。在所述第一歩中，首先用1倍PBST冲洗缓冲液研磨虫体获得研磨液，然后离心所述研磨液取其上清液作为所述待测虫液。在所述第一歩中，所述1倍PBST冲洗缓冲液按虫体(克)比冲洗缓冲液(毫升)
3为1 10的比例使用，在IOOOOrpm的情况下离心所述研磨液5min，取其上清液作为所述待测虫液。在所述第二步中，制作所述对照虫液的方法与所述第一步中制作所述待测虫液的方法相同。所述系列浓度的标准Bt毒蛋白的浓度系列为2. 5纳克/毫升、1. 25纳克/毫升，0. 625纳克/毫升、0. 3125纳克/毫升、0. 15625纳克/毫升和0纳克/毫升。本发明的有益效果如下(1)极高的灵敏度。按照本发明的操作方法可以测定昆虫体内1纳克每克体重以下的Bt毒蛋白含量，而目前的检测方法最低检测限在1. 2纳克每克体重以上。(2)本发明所测的Bt含量在0至2. 5纳克范围内与在波长为650纳米处的光密度值(0D650)存在良好的线性相关性，其相关系数(R2)达到0.99 ，重现性好。


图1所示的是实施例中标准Bt蛋白浓度和其对应的平均OD65tl值之间的线性关系的示意图。
具体实施例方式下面详细说明本发明优选的技术方案。目前转Bt基因棉大量种植，以防治棉铃虫对棉花的危害。但有些害虫如棉蚜也取食棉花的汁液，转Bt基因棉却不能杀死棉蚜。在棉蚜取食棉花汁液的同时，也会取食部分Bt毒蛋白。一些天敌昆虫以棉蚜为食，就会间接取食Bt毒蛋白。本发明用于测定棉蚜和取食棉蚜天敌体内的Bt毒蛋白含量，采用以下测定步骤(1)首先采集在转Bt棉田中生长的待测棉蚜，用1倍PBST冲洗缓冲液按1 10的比例研磨虫体，虫体(克)冲洗缓冲液(毫升)=1 10，离心研磨液(10000rpm，5min)，取上清液作为待测虫液。(2)然后，取自实验室在非转Bt基因棉上生长的棉蚜按上述方法处理，得到对照虫液。(3)用对照虫液配置系列标准Bt毒蛋白浓度，其浓度系列为:2.5,1.25,0. 625,0. 3125,0. 15625，Oppb (纳克 / 毫升)。(4)再根据试剂公司(如Agdia公司)提供的酶联免疫试剂盒进行如下的步骤操作A.在酶联免疫试剂盒酶标板的每个小孔中加IOOul共轭酶；B.再在酶标板小孔中加入IOOul待测虫液或系列浓度标准Bt毒蛋白；每个待测虫液和每一个标准Bt毒蛋白浓度各占一孔，三个重复。(也就是每个待测虫液和每一个标准Bt毒蛋白浓度各占三个孔)。C.将上述加液的酶标板放到湿润的盒子里，室温放置2小时；D.洗盘将酶标板孔里的液体倒入废液缸，倒时要避免一个孔的液体进入另一个孔；用1倍PBST冲洗缓冲液加满所有的孔，很快倒掉，重复7次；洗完后把板倒置在纸巾上，用手轻扣，使残余液体全部流出；
E.加底物在酶标板每个孔里加入IOOul反应底物TMB ；F.将酶标板放在湿润盒子里放置20min ；G.用酶标仪测定酶标板每孔中在波长为650纳米处的光密度值(见下表)。表1.标准Bt蛋白浓度和其对应的平均OD65tl值
权利要求
1.ー种转Bt作物生境中昆虫体内痕量Bt毒蛋白的检测方法，其特征在干，包括步骤如下第一歩，采集在转Bt作物田间生长的待测昆虫，制作待测虫液； 第二歩，取在实验室中非转Bt基因植物中生长的与所述待测昆虫同种或同类昆虫，制作对照虫液；第三歩，用所述对照虫液配置系列浓度的标准Bt毒蛋白；第四歩，利用酶联免疫方法测得标准Bt毒蛋白和待测虫液在波长为650纳米处的光密度值；第五歩，根据标准Bt毒蛋白的浓度和相对应的光密度值得到一个标准方程，根据所述标准方程计算待测虫液的Bt毒蛋白浓度。
2.根据权利要求1所述的转Bt作物生境中昆虫体内痕量Bt毒蛋白的检测方法，其特征在于在所述第一歩中，首先用1倍PBST冲洗缓冲液研磨虫体获得研磨液，然后离心所述研磨液取其上清液作为所述待测虫液。
3.根据权利要求2所述的转Bt作物生境中昆虫体内痕量Bt毒蛋白的检测方法，其特征在于在所述第一歩中，所述1倍PBST冲洗缓冲液按虫体(克)比冲洗缓冲液(毫升) 为1 10的比例使用，在IOOOOrpm的情况下离心所述研磨液5min，取其上清液作为所述待测虫液。
4.根据权利要求1所述的转Bt作物生境中昆虫体内痕量Bt毒蛋白的检测方法，其特征在于在所述第二步中，制作所述对照虫液的方法与所述第一歩中制作所述待测虫液的方法相同。
5.根据权利要求1所述的转Bt作物生境中昆虫体内痕量Bt毒蛋白的检测方法，其特征在于所述系列浓度的标准Bt毒蛋白的浓度系列为2. 5纳克/毫升、1. 25纳克/毫升， 0. 625纳克/毫升、0. 3125纳克/毫升、0. 15625纳克/毫升和0纳克/毫升。
全文摘要
一种转Bt作物生境中昆虫体内痕量Bt毒蛋白的检测方法，包括步骤如下第一步，采集在转Bt作物田间生长的待测昆虫，制作待测虫液；第二步，取在实验室中非转Bt基因植物中生长的与所述待测昆虫同种或同类昆虫，制作对照虫液；第三步，用所述对照虫液配置系列浓度的标准Bt毒蛋白；第四步，利用酶联免疫方法测得标准Bt毒蛋白和待测虫液在波长为650纳米处的光密度值；第五步，根据标准Bt毒蛋白的浓度和相对应的光密度值得到一个标准方程，根据所述标准方程计算待测虫液的Bt毒蛋白浓度。本法的检测方法具有极高的灵敏度和良好的重现性。
文档编号G01N33/543GK102590523SQ20111000172
公开日2012年7月18日 申请日期2011年1月6日 优先权日2011年1月6日
发明者卢延, 宋敦伦, 肖达, 薛丽, 高希武 申请人:宋敦伦