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专利名称：Dna微阵列中的探针设计方法、具有利用该方法设计的探针的dna微阵列的制作方法
技术领域：
本发明涉及例如设计用于检测基因组DNA中的突变的DNA微阵列中的探针的方法、具有利用该方法设计的探针的DNA微阵列、使用该DNA微阵列的突变检测方法。
背景技术：
在以单核苷酸多态性(SNP)为代表的多态性中，有可将同种生物中的变异作为带有特征的突变而利用的多态性。即，同种生物的规定的变异可通过检测、鉴定所谓多态性的基因组DNA中的特定的突变从而与其它突变区别。另外，通过检测、鉴定该突变，从而能指定供试的生物的变异。作为这种检测基因组DNA中的突变的方法，已知有对突变位置进行直接 序列确定的方法，利用限制性内切酶片段长度多态性(RFLP)的方法，利用扩增片段长度多态性(AFLP)的方法等。另外，已知有利用被称为DArT (Diversity ArrayTechnology)法的DNA微阵列的、基于多态性鉴定的突变的解析方法(Nucleic AcidsResearch, 2001, Vol. 29, No. 4, e25)。将DArT法所使用的DNA微阵列的制作方法示于图9。首先，从特定生物种中提取基因组DNA，使用限制性内切酶A和限制性内切酶B将基因组DNA片段化。接着，在由限制性内切酶处理得到的基因组DNA片段的两端部连结接头，将各基因组DNA片段克隆到载体上。然后，使用能与该接头杂交的引物利用PCR扩增各基因组DNA片段。接着，将扩增的各基因组DNA片段作为探针在基板上点样，由此制作DNA微阵列。使用这样制作的DNA微阵列，可以解析供试生物种的突变。首先，由供试生物提取基因组DNA，使用DNA微阵列制作时利用的限制性内切酶A和限制性内切酶B将基因组DNA片段化。对于片段化的基因组DNA，与DNA微阵列制作时同样地连结接头，通过PCR进行扩±曾。用荧光标记等将扩增的基因组DNA片段标记化，与在DNA微阵列上点样的探针杂交。检测标记化的基因组DNA片段与探针的杂交的有无，由此能解析DNA微阵列制作时所使用的特定的生物种与所述供试生物种的区别。

发明内容
根据DArT法，通过使用如上所述制作的DNA微阵列，能够在基因组DNA中的基因型水平判定生物种的多样性。但是，在如上所述制作的DNA微阵列中，存在作为被限制性内切酶识别部位夹入的区域而规定的探针的检测能力不充分的问题。即，即使在来自供试生物种的基因组DNA片段中包含例如SNP等细微突变，也有时对DNA微阵列中的探针发生杂交。换言之，DArT法中，存在如果不是在限制性内切酶识别部位存在多态性等突变、或者不是在数百碱基对范围存在缺失时就不能检测的检测极限。因此，本发明鉴于上述情况，目的在于提供基因组DNA所含有的SNP等多态性的检测效率优异的DNA微阵列中的探针的设计方法、具有利用该方法设计的探针的DNA微阵列以及使用了该DNA微阵列的突变检测方法。鉴于上述情况，本发明人等进行了认真研究，研究出了即使是基因组DNA中的SNP等的细微突变也能以优异的灵敏度进行检测的探针的设计方法、以及使用了固定有该探针的DNA微阵列的突变检测方法。本发明包含以下内容。S卩，本发明的探针的设计方法，包括对于来源于对象生物的基因组DNA所含有的、被限制性内切酶识别部位夹入的基因组DNA片段，指定具有比该基因组DNA片段短的碱基长度且覆盖该片段内的至少一部分的I个或多个区域的步骤；将指定的I个或多个区域作为用于检测供试生物中的上述片段的探针来进行设计的步骤。所述I个或多个区域能够通过以下工序指定。 (Ia)提取所述基因组DNA的工序，(Ib)用所述限制性内切酶将提取的基因组DNA消化的工序，(Ic)将接头连结到所述(Ib)中得到的基因组DNA片段的工序，(Id)使用与所述接头杂交的引物将所述基因组DNA片段扩增的工序，(Ie)确定扩增的所述基因组DNA片段的碱基序列的工序，(If)基于确定的碱基序列来确定所述I个或多个区域的工序。在此，在所述(Ib)中，可以用多种限制性内切酶消化所述基因组DNA，也可以用单独的限制性内切酶消化所述基因组DNA。另外，在所述(Ic)中，作为所述接头，优选使用具有与所述(Ib)中得到的基因组DNA片段的突出末端互补序列的接头。另外，在所述(If)中确定的区域例如是20 10000碱基长度，优选是100 8000碱基长度，更优选是200 6000碱基长度。另外，所述I个或多个区域可以使用与所述基因组DNA相关的碱基序列信息通过以下工序而指定。(2a)由与所述基因组DNA相关的碱基序列信息检索所述限制性内切酶的识别序列，指定用所述限制性内切酶消化所述基因组DNA时产生的基因组DNA片段的碱基序列的
工序，(2b)基于所述指定的碱基序列来确定所述I个或多个区域的工序。在此，所述(2b)中确定的区域例如是20 10000碱基长度，优选是100 8000碱基长度，更优选是200 6000碱基长度。另外，所述I个或多个区域可以通过以下工序指定。(3a)提取所述基因组DNA的工序，(3b)用所述限制性内切酶将提取的基因组DNA消化的工序，(3c)将接头连结到所述(3b)中得到的基因组DNA片段的工序，(3d)使用与所述接头杂交的引物将所述基因组DNA片段扩增的工序，(3e)用其它限制性内切酶消化扩增的所述基因组DNA片段的工序，(3f)分离所述(3e)中消化得到的DNA片段而作为探针的工序。另外，在本发明的探针的设计方法中，被所述限制性内切酶识别部位夹入的片段可以是由识别序列不同的多种限制性内切酶夹入的片段。在此，在所述(3b)中，可以用多种限制性内切酶消化所述基因组DNA，也可以用单独的限制性内切酶消化所述基因组DNA。另外，在所述(3c)中，作为所述接头，优选使用具有与所述(Ib)中得到的基因组DNA片段的突出末端互补的序列的接头。另一方面，本发明的DNA微阵列是将利用上述的本发明的探针的设计方法设计的探针固定在载体上而形成的。特别优选本发明的DNA微阵列中所述探针是在所述载体上基于序列信息而合成的。另一方面，使用了本发明的DNA微阵列的突变检测方法是使用上述的本发明的DNA微阵列检测来自检测对象的生物的基因组DNA中的突变的方法。尤其，本发明的使用了DNA微阵列的突变检测方法包括以下工序提取来自检测对象的生物的基因组DNA的工序；利用具有与本发明的探针的设计方法中使用的限制性内切酶相同的识别序列的限制性内切酶来消化该基因组DNA的工序；将接头连结到用限制性内切酶处理而得到的基因组DNA片段的工序；使用与所述接头杂交的引物将所述基因组DNA片段扩增的工序；使扩增的所述基因组DNA片段与本发明的DNA微阵列接触，检测该基因组DNA片段与探针的杂交的工序。
在此，在利用所述限制性内切酶消化基因组DNA的工序中，与所述探针的设计方法同样地，可以用多种限制性内切酶消化所述基因组DNA，也可以用单独的限制性内切酶消化所述基因组DNA。另外，在所述连结接头的工序中，作为所述接头，优选使用具有与在利用所述限制性内切酶消化基因组DNA的工序中得到的基因组DNA片段的突出末端互补的序列的接头。另外，扩增所述基因组DNA片段的工序可以进一步具有在扩增的基因组DNA片段附加标记分子的工序，可以在扩增所述基因组DNA片段时引入标记分子。本说明书包含作为本申请优先权基础的日本国专利申请2009-283430号的说明书和/或附图记载的内容。根据本发明，可以提供基因组DNA所含有的SNP等多态性的检测效率优异的、DNA微阵列中的探针的设计方法。另外，根据本发明，能提供基因组DNA所含有的SNP等多态性的检测效率优异的DNA微阵列以及使用了该DNA微阵列的突变检测方法。通过应用本发明，从而以往方法中难以检测的、基于基因型的生物种的判定、鉴定之类的解析成为可能。


图I是示意性地表示应用了本发明的探针的设计方法的一个例子的流程图。图2是示意性地表示应用了本发明的探针的设计方法的其它例子的流程图。图3是示意性地表示应用了本发明的探针的设计方法的其它例子的流程图。图4是示意性地表示使用具有应用本发明设计而成的探针的DNA微阵列，检测突变的工序的流程图。图5是表示A I和A 2的比对和设计的探针的位置的特性图。图6是表示B I和B 2的比对和设计的探针的位置的特性图。图7是表示导入探针的突变比例与检测的信号强度的关系的特性图。图8是表示实施例3中制作的探针的突变部位探针的比例与序列信息中检测到突变的比例的关系的特性图。图9是示意性地表示以往的DArT法中使用的DNA微阵列的制作工序的特性图。
具体实施例方式以下，参照附图详细地说明本发明的DNA微阵列中的探针的设计方法、具有利用该设计方法设计的探针的DNA微阵列以及使用了该DNA微阵列的突变检测方法。探针的设计方法本发明中设计的探针特别优选适用于所谓的寡核苷酸微阵列。所谓寡核苷酸微阵列是指在载体上合成具有目的碱基序列的寡核苷酸并将其作为探针的微阵列。在此，作为探针的合成寡核苷酸例如是20 100碱基长度，优选是30 90碱基长度，更优选是50 75碱基长度。应予说明，本发明中设计的探针也可以适用于与所谓的斯坦福型微阵列同样地通过将具有所述碱基长度的合成寡核苷酸点样而固定在载体上的类型的微阵列。S卩，本发明中设计的探针可以适用于以往公知的任何微阵列。因此，本发明中设计的探针也可以适用于以玻璃、聚硅氧烷等平面基板为载体的微阵列，以微球为载体的微球·阵列。具体而言，本发明的探针的设计方法，如图I所示，首先，从规定的生物提取基因组DNA (工序la)。作为生物，可以是细菌、真菌等微生物、昆虫、植物以及动物中的任一种。应予说明，图I表示的探针的设计方法是适合于使用基因组DNA的碱基序列信息不明的生物的情况的例子。另外，基因组DNA的提取方法没有特别限定，可以使用以往公知的方法。接着，用I种或多种限制性内切酶将提取的基因组DNA消化(工序lb)。应予说明，在图I表示的例子中，依次使用限制性内切酶A和限制性内切酶B这2种限制性内切酶来消化基因组DNA。在此，作为限制性内切酶，没有特别限定，例如可以使用PstI、EcoRI,Hindi 11、BstNI、HpaI I、HaeII I等。尤其，作为限制性内切酶，可以考虑识别序列的出现频率等而进行适当选择使得完全消化基因组DNA时形成20 10000碱基长度的基因组DNA片段。另外，使用多种限制性内切酶时，优选使用全部的限制性内切酶后的基因组DNA片段形成200 6000碱基长度。另外，使用多种限制性内切酶时，供处理的限制性内切酶的顺序没有特别限定，另外，处理条件(溶液组成、温度等)相同时，可以在同一反应系中使用多种限制性内切酶。即，在图I所示的例子中，虽然依次使用限制性内切酶A和限制性内切酶B消化基因组DNA，但也可以在相同反应系同时使用限制性内切酶A和限制性内切酶B来消化基因组DNA，也可以依次使用限制性内切酶B和限制性内切酶A来消化基因组DNA。另外，使用的限制性内切酶的数目可以是3种以上。接着，对限制性内切酶处理后的基因组DNA片段结合接头(工序lc)。在此，所谓接头，只要能与由上述的限制性内切酶处理而得到的基因组DNA片段的两端结合的接头则没有特别限定。作为接头，例如可以使用具有与由限制性内切酶处理形成在基因组DNA的两末端的突出末端(粘性末端)互补的一条主链，具有详细内容后述的扩增处理时使用的引物能够杂交的引物结合序列的接头。另外，作为接头，也可以使用具有与所述突出末端(粘接末端)互补的一条主链并具有用于编入克隆时的载体的限制性内切酶识别部位的接头。另外，使用多种限制性内切酶消化基因组DNA时，可以准备与各限制性内切酶对应的多种接头来使用。即，可以使用分别对于用多种限制性内切酶消化基因组DNA时生成的多种突出末端具有互补的一条主链的多种接头。此时，与多种限制性内切酶对应的多种接头可以具有共同的引物结合序列使得能够杂交共同的引物，也可以具有不同引物结合序列使得能够杂交各自不同的引物。另外，使用多种限制性内切酶消化基因组DNA时，作为接头，也可以准备与选自使用的多种限制性内切酶中的I种限制性内切酶或使用的限制性内切酶中的一部分限制性内切酶对应的接头来使用。接着，将在两末端附加有接头的基因组DNA片段扩增(工序Id)。使用具有引物结合序列的接头时，通过使用能与该引物结合序列杂交的引物，从而可以扩增所述基因组DNA片段。或者，利用接头序列将附加接头的基因组DNA片段克隆到载体上，使用能与该载体的规定的区域杂交的引物来扩增基因组DNA片段。应予说明，作为使用了引物的基因组DNA片段的扩增反应，可以使用PCR作为一个例子。另外，使用多种限制性内切酶消化基因组DNA，而且将与各限制性内切酶对应的多种接头连结在基因组DNA片段时，通过使用多种限制性内切酶的处理而得到的全部基因组DNA片段连结有接头。此时，通过使用接头所含的引物结合序列进行核酸扩增反应，从而可 以扩增得到的全部基因组DNA片段。或者，使用多种限制性内切酶消化基因组DNA，而且将与选自使用的多种限制性内切酶中的I种限制性内切酶或使用的限制性内切酶中一部分限制性内切酶对应的接头连结到基因组DNA片段时，在得到的基因组DNA片段中，可以仅扩增两末端具有选出的限制性内切酶的识别序列的基因组DNA片段。接着，确定扩增的基因组DNA片段的喊基序列(工序Ie),指定具有比该基因组DNA片段短的碱基长度且覆盖基因组DNA片段内的至少一部分的I个或多个区域，将指定的I个或多个区域作为用于检测供试生物中的所述扩增的基因组DNA片段的探针进行设计(工序If)。确定基因组DNA片段的碱基序列的方法没有特别限定，可使用适用了 Sanger法等的利用了 DNA序列的以往公知的方法。在本工序(工序Ie和If)中，将比扩增的基因组DNA片段短的碱基长度的I个或多个区域作为用于检测该基因组DNA片段的探针进行设计。在此，对于规定的基因组DNA片段设计多个区域时，意图使用多种探针检测该基因组DNA片段。另外，也可以对于某个基因组DNA片段设计I个区域，对于其它基因组DNA片段设计2个以上的规定数目的区域。即，可以对每个基因组DNA片段设计不同数目的区域。在此，作为设计的区域，如上所述，例如是20 10000碱基长度，优选是100 8000碱基长度，更优选是200 6000碱基长度。另外，设计多种区域时，相邻区域可以部分重复，也可以离开数个碱基。尤其，优选按照用多个区域覆盖确定了碱基序列的基因组DNA片段的全部区域的方式设定多个区域。此时，关于来自规定生物的基因组DNA，多种探针与通过限制性内切酶处理而得到的基因组DNA片段对应，用这些多种探针检测该基因组DNA片段。但是，本发明的探针的设计方法不限定于如上述所的包含使用限制性内切酶消化基因组DNA的工序的方法，也可以如图2所示利用对象生物的基因组信息。在图2表示的方法中，首先，获取与来自对象生物的基因组相关的碱基序列信息(工序2a)。与基因组相关的碱基序列信息可以从以往公知的各种数据库获取。作为数据库，没有特别限定，可以适当使用DNAData Bank of Japan提供的DDBJ数据库、EuropeanBioinformatics Institute 提供的 EMBL 数据库、National Center for BiotechnologyInformation 提供的 Genbank 数据库、Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes 提供的KEGG数据库或综合了这些各种数据库的数据库。本方法中，接着，从与获取的基因组DNA相关的碱基序列信息中检索所述限制性内切酶的识别序列(工序2a)，指定用所述限制性内切酶消化所述基因组DNA时产生的基因组DNA片段的碱基序列。在此，作为检索的识别序列，是与图I表示的方法中使用的限制性内切酶对应的限制性内切酶。即，本工序中，对于I种或多种限制性内切酶检索其识别序列。接着，基于确定的基因组DNA片段的碱基序列来确定覆盖该基因组DNA片段内的至少一部分的I个或多个区域(工序2b)。本工序(工序2b)中，将比碱基序列确定的基因组DNA片段短的碱基长度的I个或多个区域作为用于检测该基因组DNA片段的探针进行设计。在此，对规定的基因组DNA片段设计多个区域时，意图使用多种探针检测该基因组DNA片段。另外，也可以对某个基因组DNA片段设计I个区域，对其它基因组DNA片段设计2个以上的规定数目的区域。即，可以对每个基因组DNA片段设计不同数目的区域。在此，作为设计的区域，如上所述，例如是20 100碱基长度，优选是30 90碱基长度，更优选是 50 75碱基长度。另外，优选按照用多个区域覆盖确定了碱基序列的基因组DNA片段的全部区域的方式设定多个区域。此时，关于来自规定生物的基因组DNA，多种探针与通过限制性内切酶处理而得到的基因组DNA片段对应，用这些多种探针检测该基因组DNA片段。另外，如图3所示，本发明的探针的设计方法也可以是不具有确定碱基序列的工序和使用数据库的碱基序列信息的获取工序的方法，可以是包括进一步用不同的限制性内切酶消化基因组DNA片段的工序的方法。即，在图3表示的方法中，首先，适用从图I表示的方法中的工序Ia到工序ld，扩增两末端附加有接头的基因组DNA片段(工序3a 3d)。接着，用具有与工序3b中使用的限制性内切酶不同的识别序列的其它限制性内切酶(以下，限制性内切酶C)消化扩增的所述基因组DNA片段(工序3e)。利用本工序，工序3d中扩增的PCR片段被消化至更短的片段。由此，可以在不确定碱基序列的情况下以多个DNA片段指定用限制性内切酶A和限制性内切酶B消化基因组DNA而得到的覆盖基因组DNA片段内的至少一部分的多个区域。作为指定的区域，如上所述，例如是20 100碱基长度，优选是30 90碱基长度，更优选是50 75碱基长度。换言之，作为限制性内切酶C，可使用能将用限制性内切酶A和限制性内切酶B消化基因组DNA而得到的基因组DNA片段例如切断成20 100碱基长度、优选为30 90碱基长度、更优选为50 75碱基长度的DNA片段的限制性内切酶。接着，将以限制性内切酶C消化而得到的DNA片段按照每种分离而作为探针序3f)。在该工序中，可以将以限制性内切酶C消化而得到的DNA片段通过电泳、其后的切出等进行分离。另外，分离的DNA片段可以在进一步克隆到载体的状态下作为探针，也可以克隆后进一步扩增作为探针。本方法中，关于来自规定的生物的基因组DNA，多种探针与工序3d中得到的基因组DNA片段对应。DNA微阵列具有如上设计的探针的DNA微阵列可以利用以往公知的方法制作。例如，基于由图I或图2表示的方法设计的各探针的碱基序列，在载体上合成具有目的碱基序列的寡核苷酸，由此可以制作具有由图I或图2所示的方法设计的探针的DNA微阵列。在此，作为合成寡核苷酸的方法，没有特别限定，可以使用以往公知的方法。例如可以适用组合光刻技术和光照射化学合成技术而在载体上合成寡核苷酸的方法。另外，也可以适用基于由图I或图2表示的方法设计的各探针的碱基序列信息而另外合成末端附加有与载体表面亲和性高的连接分子的寡核苷酸，之后固定在载体表面的规定位置的方法。另外，通过将由图3表示的方法设计并制作的探针固定在载体上，从而可以制作具有由图3表示的方法设计的探针的DNA微阵列。此时，例如使用针型点样仪(C >夕4:/7 ^ \ 一)或喷嘴型点样仪(7 O夕4 7° 7 X \—)将以图3表示的方法制作的探针在载体上点样，由此可以制作DNA微阵列。如上制作的DNA微阵列是相对于将来自规定生物的基因组DNA进行限制性内切酶处理而得到的基因组DNA片段具有比该基因组DNA片段短的碱基长度的I种或多种探针的DNA微阵列。即，如上制作的DNA微阵列是用比该基因组DNA片段短的碱基长度的I种或多种探针检测规定基因组DNA片段的DNA微阵列。特别地作为DNA微阵列，优选是相对于规定基因组DNA片段具有多种探针，用这些多种探针检测该基因组DNA片段的DNA微阵列。·
应予说明，作为DNA微阵列，可以是将玻璃、聚硅氧烷等的平面基板作为载体的微阵列，将微球作为载体的微球阵列、或在中空纤维的内壁固定探针的3维微阵列等的任何类型的微阵列。突变检测方法通过使用如上制作的DNA微阵列，可以检测存在于基因组DNA的突变。在此，突变是指同种生物间存在的单核苷酸多态性等的多态性、近缘种间存在的碱基序列的区别、或对规定生物人为性导入的突变。更具体而言，如图4所示，首先，从供试生物提取基因组DNA。该供试生物是指与制作DNA微阵列时使用的生物进行比较的生物。接着，用制作DNA微阵列时使用的限制性内切酶将提取的基因组DNA消化而调整多个基因组DNA片段。接着，连结得到的基因组DNA片段与制作DNA微阵列时使用的接头。接着，使用制作DNA微阵列时使用的引物而扩增两末端附加有接头的基因组DNA片段。由此，可以将与制作DNA微阵列时的工序Id中扩增的基因组DNA片段、工序2a中指定了碱基序列的基因组DNA片段、工序3d中扩增的基因组DNA片段对应的、来自供试生物的基因组DNA片段进行扩增。在该工序中，附加了接头的基因组DNA片段中，可以选择性扩增规定基因组DNA片段。例如使用与多种限制性内切酶对应的多种接头时，可以选择性扩增附加有特定的接头的基因组DNA片段。另外，用多种限制性内切酶消化基因组DNA时，在得到的基因组DNA片段中，通过仅在具有与规定的限制性内切酶对应的突出末端的基因组DNA片段附加接头，从而可以选择性地扩增附加了接头的基因组DNA片段。这样，通过选择性地扩增规定的基因组DNA片段，从而能够浓缩。接着，对扩增的基因组DNA片段附加标记。作为标记，可以使用以往公知的任何物质。作为标记，例如可以使用荧光分子、色素分子、放射性分子等。应予说明，通过在扩增基因组DNA片段的工序中使用具有标记的核苷酸而可以省略本工序。通过使用所述工序中具有标记的核苷酸来扩增基因组DNA片段，从而扩增的DNA片段被标记化。接着，在规定的条件下使具有标记的基因组DNA片段接触DNA微阵列，使固定于DNA微阵列的探针与具有标记的基因组DNA片段杂交。此时，探针对基因组DNA片段的一部分杂交，但优选为存在I个碱基的不匹配时不发生杂交，仅在完全匹配时杂交的高度严格条件。通过是这样的高度严格条件，从而能检测单核苷酸多态性等细微突变。应予说明，严格条件可以用反应温度和盐浓度调节。即，通过形成更高温从而得到更高的严格条件，或用更低的盐浓度得到更高的严格条件。例如，使用50 75碱基长度的探针时，作为杂交条件，可以在40 44°C、0. 21SDS、6 X SSC的条件下形成更高的严格条件。另外，探针与具有标记的基因组DNA片段的杂交可以基于标记进行检测。S卩，具有上述标记的基因组DNA片段与探针的杂交反应后，清洗未反应的基因组DNA片段等，之后，观察对探针特异性杂交的基因组DNA片段的标记。例如在标记是荧光物质时，检测其荧光波长；如果标记是色素分子，则检测其色素波长。更具体而言，可使用用于通常的DNA微阵列解析的荧光检测装置、图像分析仪等装置。尤其，如果使用上述的DNA微阵列，则将来自供试生物的基因组DNA片段利用碱基长度比该基因组DNA片段短的I种或多种探针进行检测。在以往的DArT法(图9)中，利用 PCR将来自规定的生物的基因组DNA片段扩增而作为探针，所以有时即使是具有数十个碱基不匹配的来自供试生物的基因组DNA片段，也进行杂交(假阳性)。但是，在如上述的DNA微阵列中，利用碱基长度比该基因组DNA片段短的I种或多种探针进行检测，所以可以减少这种假阳性的发生概率，可以更高精度地检测来自供试生物的基因组DNA片段。尤其，利用多种探针检测来自供试生物的基因组DNA片段时，通过检测这些多种探针中有无杂交，从而能检测来自供试生物的基因组DNA片段所含的细微突变。另外，在上述的DNA微阵列中，能够检测未知的突变。以往，在载体上合成寡核苷酸而形成突变检测用的探针的DNA微阵列，仅能将已知序列信息的已知突变作为检测对象。但是，根据上述的探针的设计方法，即使在基因组DNA片段含有序列信息未知的突变，也可以将这些未知的突变作为检测对象。换言之，通过使用具有上述探针的DNA微阵列，从而可以鉴定未知的突变。如上所述，根据本发明的DNA微阵列，能在与制作DNA微阵列时使用的规定生物的比较中检测供试生物的基因组DNA所含的突变，所以例如可以在基因水平解析同种生物的多样性。另外，通过针对同种生物所包含的各种突变体预先制作本发明的DNA微阵列，从而可以在基因水平解析供试生物归属于何种突变体。实施例以下，使用实施例更加详细地说明本发明，本发明的技术范围不限定于以下的实施例。〔实施例I〕本实施例中，不使用全序列信息和突变信息，通过按照图I表示的顺序设计探针，从而能检测甘蔗品种NiF8和Ni9的等位基因中的突变。(I)材料使用甘蔗品种NiF8和Ni9。(2)限制性内切酶处理按照常法分别从甘蔗品种NiF8和Ni9中提取基因组DNA。用限制性内切酶PstI(NEB公司，25unit)在37°C处理基因组DNA (750ng) 2小时后，添加限制性内切酶BstNI(NEB 公司，25unit)，60°C处理 2 小时。(3)接头连接在(2)中处理的基因组DNA片段(120ng)中，添加PstI序列接头(5，-CACGATGGATCCAGTGCA-3’(序列编号 1)、5’ -CTGGATCCATCGTGCA-3’(序列编号 2))和T4DNA Ligase (NEB公司，800unit)，在16°C处理一昼夜。由此，在(2)中处理的基因组DNA片段中，对两末端具有PstI识别序列的基因组DNA片段选择性地附加接头。(4) PCR 扩增在具有(3)中得到的接头的基因组DNA片段(15ng)中添加PstI序列接头识别引物(5 ’ -GATGGATCCAGTGCAG-3 ’(序列编号 3 ))和 Taq 聚合酶(TAKALA 公司 PrimeSTAR，1.25unit)，用PCR(98°C处理10秒，55°C处理15秒，72°C处理I分钟，30循环后，在72°C处理3分钟后，在4°C保存)扩增基因组DNA片段。
(5)基因组序列获取对于(4)中PCR扩增的基因组DNA片段，利用Sanger法确定碱基序列。其结果，获得了来自NiF8的2种基因组序列信息(A_l (序列编号4)和B_1 (序列编号5))。另外，使用基因组序列A_1和B_1的序列信息，获得了 Ni9的等位基因座区域的基因组序列信息(A_2 (序列编号6)和[2 (序列编号7))(6)探针设计基于(5)的基因组序列信息(A_l、B_l)来分别设计5和6个50 70bp的探针。即，本实施例中，对甘蔗品种NiFS设计探针。将八_1和八_2的比对以及设计的探针的位置示于图5。另外，将B_1和B_2的比对以及设计的探针的位置示于图6。(7)微阵列制造基于设计的探针的碱基序列信息而制作具有这些探针的DNA微阵列(委托Roche公司)。(8)样品的调整利用上述的(2) (4)的方法，由甘蔗品种NiF8和Ni9分别调整PCR扩增片段。用色谱柱(Qiagen公司)纯化PCR扩增片段后,加入Cy3-labeled 9mers (TriLink公司，10. D.)，在98°C处理10分钟后，在冰上静置10分钟。之后，加入Klenow (NEB公司，lOOunit)，在37°C处理2小时。接着，利用乙醇沉淀调整标记化样品。(9)杂交 信号检测使用(8)的标记化样品，按照NimbleGen Array User’s Guide,使用(7)中制作的DNA微阵列进行杂交，检测基于标记的信号。(10)突变比例的算出突变比例基于各探针内的NiF8和Ni9的等位基因座区域的基因组序列的相同性来算出。(11)信号强度比的算出信号强度比使用以NiFS作为样品的阵列的信号强度除以以Ni9作为样品的阵列的信号强度而得的值。(12)结果和考察将测定信号强度而得到的结果和由其算出的信号强度比示于表I和表2。
[表 I]
权利要求
1.一种探针的设计方法，包括 对于来源于对象生物的基因组DNA所含有的、被限制性内切酶识别部位夹入的基因组DNA片段，指定具有比该基因组DNA片段短的碱基长度且覆盖该基因组DNA片段内的至少ー部分的I个或多个区域的步骤； 将指定的I个或多个区域作为探针来进行设计的步骤。
2.如权利要求I所述的探针的设计方法，其特征在于，所述I个或多个区域通过以下エ序指定， (Ia)提取所述基因组DNA的エ序， (Ib)用所述限制性内切酶将提取的基因组DNA消化的エ序， (Ic)将接头连结到所述(Ib)中得到的基因组DNA片段的エ序， (Id)使用与所述接头杂交的引物将所述基因组DNA片段扩增的エ序， (Ie)确定扩增的所述基因组DNA片段的碱基序列的エ序， (If)基于确定的碱基序列来确定所述I个或多个区域的エ序。
3.如权利要求2所述的探针的设计方法，其特征在于，所述(Ib)中，用多种限制性内切酶消化所述基因组DNA。
4.如权利要求3所述的探针的设计方法，其特征在于，所述(Ic)中，连结与选自所述多种限制性内切酶中的I种限制性内切酶或使用的所述多种限制性内切酶中的一部分限制性内切酶对应的接头。
5.如权利要求2所述的探针的设计方法，其特征在干，作为所述接头，具有与所述(Ib)中得到的基因组DNA片段的突出末端互补的序列。
6.如权利要求I所述的探针的设计方法，其特征在于，所述I个或多个区域使用与所述基因组DNA相关的喊基序列/[目息通过以下エ序指定， (2a)由与所述基因组DNA相关的碱基序列信息检索所述限制性内切酶的识别序列，指定用所述限制性内切酶消化所述基因组DNA时产生的基因组DNA片段的碱基序列的エ序，(2b)基于所述指定的碱基序列来确定所述I个或多个区域的エ序。
7.如权利要求6所述的探针的设计方法，其特征在于，所述(2a)中，确定用多种限制性内切酶消化所述基因组DNA时产生的基因组DNA片段的碱基序列。
8.如权利要求7所述的探针的设计方法，其特征在于，所述(2b)中，针对被选自所述多种限制性内切酶中的I种限制性内切酶或使用的所述多种限制性内切酶中的一部分限制性内切酶夹入的基因组DNA片段，确定所述I个或多个区域。
9.如权利要求I所述的探针的设计方法，其特征在于，所述I个或多个区域通过以下エ序指定， (3a)提取所述基因组DNA的エ序， (3b)用所述限制性内切酶将提取的基因组DNA消化的エ序， (3c)将接头连结到所述(3b)中得到的基因组DNA片段的エ序， (3d)使用与所述接头杂交的引物将所述基因组DNA片段扩增的エ序， (3e)用其它限制性内切酶消化扩增的所述基因组DNA片段的エ序， (3f)分离所述(3e)中消化得到的DNA片段而作为探针的エ序。
10.如权利要求9所述的探针的设计方法，其特征在于，在所述(3b)中，用多种限制性内切酶消化所述基因组DNA。
11.如权利要求3所述的探针的设计方法，其特征在于，在所述(3c)中，连结与选自所述多种限制性内切酶中的I种限制性内切酶或使用的所述多种限制性内切酶中的一部分限制性内切酶对应的接头。
12.如权利要求9所述的探针的设计方法，其特征在干，作为所述接头，具有与所述(3b)中得到的基因组DNA片段的突出末端互补的序列。
13.如权利要求I所述的探针的设计方法，其特征在于，设计20 100碱基长度的探针。
14.ー种DNA微阵列，具备利用权利要求I 13中任一项所述的探针的设计方法而设计的探针和固定该探针的载体。
15.如权利要求14所述的DNA微阵列，其特征在于，所述探针是在所述载体上基于序列信息而合成得到的。
16.ー种使用了 DNA微阵列的突变检测方法，包括 提取来自检测对象的生物的基因组DNA的エ序， 利用具有与权利要求I 13中任一项所述的探针的设计方法中使用的限制性内切酶相同的识别序列的限制性内切酶来消化该基因组DNA的エ序， 将接头连结到用限制性内切酶处理而得到的基因组DNA片段的エ序， 使用与所述接头杂交的引物将所述基因组DNA片段扩增的エ序；以及 使扩增的所述基因组DNA片段与权利要求14或15所述的DNA微阵列接触，检测该基因组DNA片段与探针的杂交的エ序。
17.如权利要求16所述的使用了DNA微阵列的突变检测方法，其特征在于，在消化所述基因组DNA的エ序中，用多种限制性内切酶消化所述基因组DNA。
18.如权利要求17所述的使用了DNA微阵列的突变检测方法，其特征在于，在所述连结接头的エ序中，连结与选自所述多种限制性内切酶中的I种限制性内切酶或使用的所述多种限制性内切酶中的一部分限制性内切酶对应的接头。
19.如权利要求16所述的使用了DNA微阵列的突变检测方法，其特征在于，作为所述接头，具有与所述(3b)中得到的基因组DNA片段的突出末端互补的序列。
20.如权利要求16所述的使用了DNA微阵列的突变检测方法，其特征在于，所述检测对象的生物是与制作所述DNA微阵列时使用的生物不同种的生物。
全文摘要
本发明提供基因组DNA所含有的SNP等多态性的检测效率优异的DNA微阵列中的探针。本发明的探针的设计方法包括对于来源于对象生物的基因组DNA所包含的、限制性内切酶识别的限制性内切酶识别部位夹入的片段，指定覆盖该片段内的至少一部分的1个或多个区域的步骤；将指定的1个或多个区域作为用于检测供试生物中的上述片段的探针来进行设计的步骤。
文档编号G01N33/53GK102753686SQ20108006366
公开日2012年10月24日 申请日期2010年12月13日 优先权日2009年12月14日
发明者村上亚矢, 榎宏征, 西村哲 申请人:丰田自动车株式会社