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专利名称：检测基因点突变的液相芯片和方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种检测基因点突变的液相芯片和方法。
背景技术：
随着人类基因组计划研究进展，越来越多的证据表明基因突变在人类疾病中具有重要作用，通过对基因突变的检测，可以对疾病进行有效的预防、诊断和治疗。基因突变是指由于DNA碱基对的置换、增添或缺失而引起的基因结构的变化，它包括单个碱基改变所引起的点突变，或多个碱基的缺失、重复和插入，其中以点突变最为常见。点突变所造成的基因理化特性改变甚微，无疑使点突变的检测非常困难。特别是当待检测的突变基因丰度较低，且存在于大量未发生突变的野生型基因背景中时，对点突变的检测变得更加困难。传统的基因点突变检测方法操作复杂，测定结果需经电泳、测序获得，费时繁琐，且特异性、敏感性差。液相芯片技术的出现提高了基因点突变的检测灵敏度，其原理是将与待检测突变基因互补的一段寡核苷酸序列固定在微球表面，通过微球表面寡核苷酸与突变基因的反向杂交过程，检测突变基因。相比将寡核苷酸序列固定在玻片表面的传统生物芯片，液相芯片更有利于提高待检测基因与寡核苷酸的杂交效率。但是，如果检测样本中存在大量未发生突变的野生型基因时，由于野生型基因与寡核苷酸间的竞争杂交反应，使得直接通过液相芯片反向杂交方法检测低丰度点突变基因难以实现。在这种情况下，需要通过扩增反应提高突变基因的丰度。然而，由于大量野生型基因背景的存在，普通的聚合酶链式反应(PCR)不仅无法提高突变基因的相对丰度，反而可能进一步降低检测样本中突变基因的比例。因此，本领域迫切需要一种检测低丰度基因点突变的液相芯片和方法
发明内容
本发明要解决目前基因点突变检测灵敏度不高、检测过程易受样本中野生型基因干扰的技术问题，提供一种检测基因点突变的液相芯片，该液相芯片适用于大量野生型基因背景下低丰度点突变基因的检测。此外，还需要提供一种检测基因点突变的方法，该方法显著提高了突变基因的检测灵敏度。为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现:在本发明的一个方面，提供了一种检测基因点突变的液相芯片，包括:针对基因突变位点设计的引物对、微球、以及信号报告分子；所述引物对中的正向引物具有下述式I所示的结构:5，-S2-B2-S1-B1-3，(式 I)，式I 中，BI表不正向引物3’端最后一个喊基，该喊基与待检测基因突变位点的喊基互补，与野生型基因不互补；
B2表示人工引入的一个与突变型和野生型基因均不互补的碱基；SI表示与突变型基因互补的结合区3’端序列，长度为0_4bp ；S2表示与突变型基因互补的结合区5’端序列，长度为10_39bp ；该正向引物5’端设有连接臂，用于与微球相连接；所述引物对中的反向引物与突变型基因完全互补，其5’端标记有信号报告分子。优选的，所述SI序列的长度为l_2bp。 所述连接臂的序列选自下述任意一种:长度为10_30bp的多聚A、长度为10_30bp的多聚T、或长度为6-12个碳原子的序列。所述反向引物的长度为15_40bp ;该反向引物5’端标记的信号报告分子包括:生物素、地高辛、核酸适配体、或荧光染料分子。在本发明的另一方面，还提供了一种检测基因点突变的方法，包括以下步骤:针对基因突变位点设计权利要求1所述的引物对，该引物对中的正向引物与微球通过连接臂相连接，反向引物的5’端标记信号报告分子；用所述引物对在油包水乳液中对待检测突变基因进行扩增；检测微球表面的荧光信号，得检测结果。在本发明中，突变基因的扩增在油包水乳液中进行。油包水乳液由水相和油相组成，水相的体积比为10-35% (v/v)，其中包括待检测的突变基因、特异性引物，以及其它基因扩增所需的反应物。油相由一种或多种有机烃类组成，体积比为65-90%。将水相滴加入油相中，并通过外力使之混合均匀，形成平均粒径为5-10 μ m的油包水乳液滴。在形成的油包水液滴中，至少有一部分液滴内同时包含待检测的一条突变基因、一个微球，液滴内还包括若干特异性引物，以及其它基因扩增所需的反应物。液滴内的突变基因经过扩增后，在微球表面形成的突变基因的扩增产物的长度为80-120bp，且带有信号报告分子。通过上述扩增过程，检测样本中起始的突变分子数量被转化成了发生扩增的微球数量。再通过流式细胞仪检测微球表面的信号报告分子即可检测出样本中是否包含突变基因，以及表面发生扩增的微球数量，从而获得样本中突变基因的相对含量。本发明检测基因点突变的液相芯片，对现有的液相芯片技术进行了改进，在油包水乳液中，通过设计的特异性引物有效地扩增了样本中的低丰度突变基因，排除了野生型基因背景的影响，将突变的数量转化为发生扩增的微球数量，实现了微量突变的定量检测，同时显著提高了突变基因检测灵敏度，增强了检测信号的信噪比，使得检测结果更加准确可靠。


下面结合附图和具体实施方式
对本发明作进一步详细的说明。图1是本发明基于液相芯片的检测基因点突变的方法示意图；图2是本发明针对基因突变位点设计的引物对与突变基因模板结合示意图；图3是本发明实施例1流式细胞仪得到的突变比例(MT% )与PE荧光阳性区磁珠比例(M2% Gated)间的线性相关图；图4是本发明实施例2流式细胞仪得到的突变比例(MT% )与CY5荧光阳性区磁珠比例(M2% Gated)间的线性相关图5是本发明实施例3中采用等位基因特异性延伸反应(ASPE)与采用本发明方法时对样本中低丰度突变基因的检测结果比较图。
具体实施例方式为了提高大量野生型基因背景下低丰度基因点突变的检测灵敏度，本发明研制出了检测基因点突变的液相芯片，包括:针对基因突变位点设计的引物对、微球、以及信号报告分子；引物对中的正向引物具有下述式I所示的结构:
权利要求
1.一种检测基因点突变的液相芯片，其特征在于，包括:针对基因突变位点设计的引物对、微球、以及信号报告分子； 所述引物对中的正向引物具有下述式I所示的结构: 5，-S2-B2-S1-B1-3，(式 I)， 式I中， BI表示正向引物3’端最后一个碱基，该碱基与待检测基因突变位点的碱基互补，与野生型基因不互补； B2表示人工引入的一个与突变型和野生型基因均不互补的碱基； SI表示与突变型基因互补的结合区3’端序列，长度为0-4bp ； S2表示与突变型基因互补的结合区5’端序列，长度为10-39bp ； 该正向引物5’端设有连接臂，用于与微球相连接； 所述引物对中的反向引物与突变型基因完全互补，其5’端标记有信号报告分子。
2.根据权利要求1所述的液相芯片，其特征在于，所述SI序列的长度为l_2bp。
3.根据权利要求1所述的液相芯片，其特征在于，所述连接臂的序列选自下述任意一种:长度为10-30bp的多聚A、长度为10-30bp的多聚T、或长度为6_12个碳原子的序列。
4.根据权利要求1所述的液相芯片，其特征在于，所述反向引物的长度为15-40bp。
5.根据权利要求1 所述的液相芯片，其特征在于，所述信号报告分子包括:生物素、地高辛、核酸适配体、或荧光染料分子。
6.一种检测基因点突变的方法，其特征在于，包括以下步骤: 针对基因突变位点设计权利要求1所述的引物对，该引物对中的正向引物与微球通过连接臂相连接，反向引物的5’端标记信号报告分子； 用所述引物对在油包水乳液中对待检测突变基因进行扩增； 检测微球表面的荧光信号，得检测结果。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述油包水乳液由水相和油相组成，水相的体积比为10-35%，油相的体积比为65-90%。
8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于，所述油包水乳液的液滴平均粒径为5-10 μ m0
9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述扩增产物的长度为80-120bp。
全文摘要
本发明公开了一种检测基因点突变的液相芯片，包括针对基因突变位点设计的引物对、微球、以及信号报告分子，该引物对中，正向引物3’端最后一个碱基与待检测基因突变位点的碱基互补，与野生型基因不互补，该正向引物序列中还人工引入的一个与突变型和野生型基因均不互补的碱基，该正向引物与微球通过连接臂相连接；反向引物与突变型基因完全互补，其5’端标记有信号报告分子。本发明还公开了检测基因点突变的方法，包括步骤针对基因突变位点设计上述引物对；用该引物对在油包水乳液中对待检测突变基因进行扩增；检测微球表面的荧光信号。本发明检测基因点突变的液相芯片和方法，显著提高了大量野生型基因背景下低丰度基因点突变的检测灵敏度。
文档编号G01N21/64GK103103248SQ20111033484
公开日2013年5月15日 申请日期2011年10月28日 优先权日2011年10月28日
发明者程昌明 申请人:上海生物芯片有限公司