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专利名称：分泌性多肽的检测的制作方法
技术领域：
本发明涉及检测分泌性多肽的方法，更具体涉及选择产生高水平分泌性多肽的细胞的方法。
背景技术：
分泌性蛋白质通常在它们的氨基末端包含信号序列，该序列将合成它们的核糖体指引到内质网(ER)。在连接到粗面ER膜的核糖体上完成蛋白质合成。完成的多肽链移动到高尔基复合体，然后被分选(sort)到不同目的地。合成并在分泌途径中被分选的蛋白质不仅包括那些从细胞分泌的蛋白质，而且包括在ER的腔(lumen)、高尔基体和溶酶体中的蛋白质，以及在这些细胞器的膜和浆膜上的整合蛋白质。
大多数在ER新制成的蛋白质掺入(incorporated into)小转运小泡(vesicle)，所述小泡或者融合到高尔基体内侧(cis-Golgi)或者互相融合形成称为高尔基体内侧内质网的膜的堆积(stack)。一些蛋白质从所述高尔基体内侧通过不同组(set)的逆向(retrograde)转运小泡回收到(retrieved)ER。在称为潴泡迁移(cisternal migration)的过程中，新的高尔基体内侧膜集合及其携带的腔蛋白质从内侧位(离所述ER最近)物理移动到外侧位(离所述ER最远)，成功首先变成高尔基体中间(medial-Golgi)潴泡，然后变为高尔基体外侧(trans-Golgi)潴泡。在此过程中，膜和腔蛋白质不断通过小的逆向转运小泡从后期高尔基潴泡回收到早期高尔基体潴泡。通过此过程，酶和其它高尔基体居留蛋白质定位在高尔基体内侧潴泡、高尔基体中间潴泡、或高尔基体外侧。
最终要从细胞分泌的蛋白质通过潴泡迁移到高尔基体的外侧面，然后进入称为高尔基体外侧内质网的小泡复合体网络。从那里，分泌性蛋白质被分选到分泌小泡。在所有的细胞种类里，至少一些所述分泌性蛋白质是持续分泌的。这些蛋白质在高尔基体外侧网络中分选进入转运小泡，该小泡立即移动到浆膜并与之融合，通过胞吐作用(exocytosis)释放出它们的内容物。在一些细胞中，具体一系列(set)蛋白质的分泌不是持续的。这些蛋白质在高尔基体外侧网络分选进入分泌性小泡，所述分泌性小泡储藏在细胞内部等待刺激来进行胞吐，所述刺激例如激素与其受体的结合。

发明内容
本发明基于，至少部分基于可在产生分泌性多肽的细胞表面检测该多肽这一发现。分泌性多肽在细胞表面的检测可用作细胞产生分泌性多肽的标志。因此，此方法可用来选择产生高水平的给定分泌性多肽的细胞。
本发明一方面的涉及选择产生分泌性多肽的细胞的方法，所述方法包括提供细胞群(population)，其中所述细胞群包含含有编码分泌性多肽的异源核酸的细胞；使所述细胞群接触特异性结合所述分泌性多肽的化合物；检测所述化合物与所述细胞表面上的分泌性多肽的结合；并基于与所述细胞表面上的分泌性多肽结合的化合物的存在或量筛选所述细胞。
另一方面，本发明的特征是制备产生分泌性多肽的细胞的方法，所述方法包括将编码分泌性多肽的异源核酸引入细胞；在允许合成所述分泌性多肽的条件下培养所述细胞；使所述细胞接触特异性结合所述分泌性多肽的化合物；通过所述化合物与所述细胞表面上所述分泌性多肽的结合，检测所述分泌性多肽的表达；并通过荧光激活细胞分选筛选所述细胞。
“分泌性多肽”指合成并在细胞分泌途径中被分选的蛋白质，之后从所述细胞以可溶形式释放。“分泌性多肽”通常包含氨基末端信号序列，它在所述多肽从所述细胞释放前被切割。“分泌性多肽”不指这样一类蛋白质，其以完整的膜蛋白质的形式存在或通过切割完整的膜蛋白质从细胞释放，例如，所述切割事件释放完整膜蛋白质的可溶细胞外区域。
“选择细胞”指将细胞指定到(assign to)给定物理位置的过程。本发明上下文中，基于结合所述细胞表面上分泌性多肽的化合物的存在或量，细胞被指定到物理位置。不具有所需特征的细胞通常不被指定到与所选择的细胞相同的物理位置。术语“选择细胞”包括，例如，基于通过流式细胞法(flowcytometry)鉴定的细胞的荧光性质，将细胞(可选与其它具有相同或相似特征的细胞一起)保存在收集容器中。其它选择细胞的方法实例包括磁分离(magnetic separation)和淘选(panning)技术。
“异源核酸”指通过使用重组技术已被导入细胞的核苷酸序列。因此，存在于给定细胞中的“异源核酸”不天然地存在于所述细胞中(例如，在所述细胞的基因组中无对应的相同序列)，和/或存在于细胞中与对应相同序列天然存在的位置不同的位置(例如，所述核苷酸序列存在于所述细胞基因组的不同位置，或作为不整合到基因组的构建体存在所述细胞中)。“异源核酸”不指存在于两个或多个细胞的细胞融合事件所得细胞中的核苷酸序列。
所述细胞可以是，例如真核细胞(例如，哺乳动物细胞如中国仓鼠卵巢(Chinese Hamster Ovary)(CHO)细胞或COS细胞)或原核细胞。所述细胞可以衍生自细胞系或可以是原代细胞。一项实施方案中，所述细胞不是转化的细胞。另一实施方案中，所述细胞不是B细胞或通过B细胞和其它细胞融合形成的细胞。
所述分泌性多肽可以是抗体，例如人源化抗体。
所述化合物可以是标记的，例如荧光标记的。所述化合物可以是抗体，例如荧光标记的抗体。
一项实施方案中，通过流式细胞法来检测所述抗体与所述细胞表面上所述分泌性多肽的结合。通过荧光激活的细胞分选法可选地筛选所述细胞。
所述细胞可以与细胞群中多个细胞一起被选择，所述多个细胞显示与所述多个细胞的表面上的分泌性多肽结合的化合物。所述多个细胞可选包含，例如，所述细胞群中至少1％，5％，10％，20％，30％，40％，50％，或更多的细胞。所述多个细胞可选包含所述细胞群中不超过例如，至少1％，5％，10％，20％，30％，40％，或50％的细胞。
所述细胞可以被保存在包含所述细胞但不含其他细胞的容器中。
本文所述的方法可还包括培养所选择的细胞来产生所述分泌性多肽的第二细胞群；使该第二细胞群接触所述抗体；检测所述抗体与第二细胞群细胞表面上所述分泌性多肽的结合；并基于结合于所述细胞表面上所述分泌性多肽的抗体的存在或量，通过荧光激活的细胞分选法，筛选所述第二细胞群的细胞。一项实施方案中，在4℃到10℃，例如在大约4℃，使所述细胞群接触所述抗体。
本文所述的方法可还包括在允许所述分泌性多肽分泌到所述培养基的条件下培养基中培养所选择的细胞；并从所述培养基纯化所述分泌性多肽。
另一方面，本发明涉及确定细胞产生的分泌性多肽的存在或量的方法，所述方法包括使产生分泌性多肽的细胞接触特异性结合所述分泌性多肽的化合物，其中所述细胞不是B细胞或通过B细胞和其它细胞融合形成的细胞；并检测所述细胞表面上所述分泌性多肽与所述化合物的结合，从而确定由所述细胞产生的分泌性多肽的存在或量。
一项实施方案中，所述细胞包含编码所述分泌性多肽的异源核酸。
所述细胞可以是，例如真核细胞(例如，哺乳动物细胞如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或COS细胞)或原核细胞。所述细胞可以是衍生自细胞系或可以是原代细胞。一项实施方案中，所述细胞不是转化的细胞。
所述分泌性多肽可以是抗体，例如人源化抗体。
所述化合物可以是标记的，例如荧光标记的。所述化合物可以是抗体，例如荧光标记的抗体。
一项实施方案中通过流式细胞法来检测所述抗体与细胞表面上分泌性多肽的结合。通过荧光激活的细胞分选法可选地筛选所述细胞。
另一方面，本发明的特征是选择细胞的方法，所述方法包括提供细胞群，其包含经遗传改造为包含编码分泌性多肽的核酸的多个细胞；使所述细胞群接触特异性结合所述分泌性多肽的化合物；并选择有所述化合物结合于表面的细胞。
所述细胞可以是，例如真核细胞(例如，哺乳动物细胞如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或COS细胞)或原核细胞。所述细胞可以衍生自细胞系或可以是原代细胞。一项实施方案中，所述细胞不是转化的细胞。另一实施方案中，所述细胞不是B细胞或通过B细胞和其它细胞融合形成的细胞。
所述分泌性多肽可以是抗体，例如人源化抗体。
所述化合物可以是标记的，例如荧光标记的。所述化合物可以是抗体，例如荧光标记的抗体。
一项实施方案中，通过流式细胞法来检测所述抗体与所述细胞表面上所述分泌性多肽的结合。通过荧光激活的细胞分选法可选地筛选所述细胞。
所述细胞可以与所述细胞群中多个细胞一起被选择，所述多个细胞显示与多个细胞的表面的分泌性多肽结合的化合物。所述多个细胞可选包含，例如，所述细胞群中至少1％，5％，10％，20％，30％，40％，50％，或更多的细胞。所述多个细胞可选包含所述细胞群中不超过例如，至少1％，5％，10％，20％，30％，40％，或50％的细胞。
所述细胞可以被保存含有所述细胞但不含其它细胞的容器中。
本文所述方法可简单、快速并直接检测细胞表面上的分泌性多肽，可随后进行细胞分选。高速细胞分选仪(sorter)可以极高的准确性，分选成百成百万个细胞，极大富集(enrich)了高产细胞群。
本发明优点在于，借助于细胞表面存在的分泌性多肽来指导细胞选择，所述方法可极大便于选择产生给定分泌性多肽的细胞的方法。例如，本发明所述方法可减少进行大量工作繁琐且成本高的分析来检测分泌到细胞培养基的多肽的必要性。此外，本发明所述方法可在为鉴定高产细胞系而进行的全面细胞选择过程中减少分析的个体克隆数。
本发明所述方法另一优点在于，它们可以用于全面调查整个靶细胞群，因为很可能可检测所有存在于转染或扩增细胞群中的细胞对分泌性多肽的产生。依赖于例如克隆的方法，不直接检测群体中所有细胞分泌的多肽的相对量。本发明所述方法可直接分析大量细胞并测定给定分泌性多肽的相对表达水平。
本发明所述方法另一优点在于，到克隆为止(up to the point of cloning)(如果需要克隆的话)，所有靶细胞群中的细胞(例如，用编码分泌性多肽的核酸转染的细胞)可以单批处理。因为需要处理的靶细胞群中的所述细胞相对少，产生多个细胞系的制备就变得方便。免疫分析的劳动和花费也可大大减少，因为初始的筛选步骤可以用流式细胞仪(flow cytometer)进行。
本发明另一优点在于所述方法直接检测给定分泌性多肽的产生。然而依赖于检测替代(surrogate)标记物如选择标记物或报道物蛋白(reporter protein)的方法，可很好测量编码分泌性多肽的核酸的转录，但不一定很好测量所述分泌性多肽的分泌。例如，核酸转录增加不一定与其所编码多肽的翻译和分泌增加相关。本发明所述方法可直接选择具有适宜细胞结构(machinery)的细胞，和可高水平产生所述分泌性多肽的条件。
除非另外限定，所有本文所用的技术和科学术语与本发明所属领域普通技术人员通常理解的具有相同含义。尽管与本文所述类似或等同的方法和材料可以用于实践或检验本发明，举例的方法和材料将如下描述。所有本文提到的出版物，专利申请，专利和其它参考文献都全文引入作为参考。如有冲突，以本申请，包括定义为准。所述材料，方法和实施例只为说明而不为限定。
其它本发明的特征和优点将明显从如下的具体描述和权利要求可见。


图1A是描述未转染CHO细胞的图，该细胞用RPE标记的山羊抗人抗体染色。
图1B是描述CHO细胞的图，该细胞用pXLTBR.9转染并且用RPE标记的山羊抗人抗体染色。
图2A是描述pXLTBR.9-转染的CHO细胞的图，在一轮分选后，该细胞用RPE标记的山羊抗人抗体染色。
图2B是描述pXLTBR.9-转染的CHO细胞的图，在两轮分选后，该细胞用RPE标记的山羊抗人抗体染色。
图2C是描述pXLTBR.9-转染的CHO细胞的图，在三轮分选后，该细胞用RPE标记的山羊抗人抗体染色。
图3是描述细胞分选前(左)和细胞分选后(右)的CHO细胞的图，所述细胞用编码AQC2mAb的质粒转染并用RPE标记的山羊抗人抗体染色。
发明详述本发明提供在产生多肽的细胞表面检测分泌性多肽的方法。在细胞表面检测分泌性多肽可以用于基于由所述细胞产生的给定分泌性多肽的存在或量来选择细胞。
本文所述的筛选方法(例如，筛选相对高产异源多肽的细胞的转染细胞系)检测在蛋白质分泌过程中与浆膜一过性(transiently)相关的分泌性多肽。由此，所述分泌性多肽可以用化合物标记，例如，荧光试剂如蛋白质-特异性抗体。如下面实施例所述，将在所述细胞表面上标记的分泌性多肽的荧光强度用作选择克隆的主要标准，并选出具有所述分泌性多肽的相对高比产率(specific productivity)的克隆。
本文所述方法简单、直接检测所述细胞表面上的分泌性多肽，可选在随后进行细胞分选。高速细胞分选仪可以极高的准确性，分选上亿个细胞，极大富集了高产细胞群，并可以每孔一个细胞将细胞置于在板如96孔板中。如下面实施例所述，三轮反复分选后进行单个细胞接种，发现所得克隆的比产率比未经分选的转染细胞群高20倍。此外，通过细胞分选选择克隆后进行甲氨喋呤扩增，比产率会增加超过100倍。
分泌性多肽本发明包括鉴定并选择表达分泌性多肽的细胞的方法。所述分泌性多肽可以是天然存在或非-天然存在的蛋白质。所述分泌性多肽可以通过细胞天然产生(例如，不对所述细胞进行任何基因操作)，可以由引入细胞的异源核酸编码，或可以在插入或激活调节编码所述分泌性多肽的基因表达的序列后由细胞产生。
任何由细胞分泌的多肽可以用于本文所述方法。例如，可以产生分泌性多肽如细胞因子，淋巴因子，和/或生长因子，并且可以根据本文所述方法选择产生所述多肽的细胞。所述分泌性多肽的实例包括但不限于，红细胞生成素，白介素1-α，白介素1-β，白介素-2，白介素-3，白介素-4，白介素-5，白介素-6，白介素-7，白介素-8，白介素-9，白介素-10，白介素-11，白介素-12，白介素-13，白介素-14，白介素-15，淋巴细胞趋化因子(Lymphotactin)，淋巴毒素α，单核细胞化学引诱物蛋白-1，单核细胞化学引诱物蛋白-2，单核细胞化学引诱物蛋白-3，Megapoietin，制癌蛋白(Oncostatin)M，青灰因子(Steel Factor)，血小板生成素(Thrombopoietin)，血管内皮细胞生长因子，骨形态发生(Bone Morphogenetic)蛋白，白介素-1受体拮抗剂，粒细胞-集落刺激因子，白血病抑制因子，粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子，巨噬细胞集落刺激因子，干扰素γ，干扰素β，成纤维细胞生长因子，肿瘤坏死因子α，肿瘤坏死因子β，转化生长因子α，促性腺素(Gonadotropin)，神经生长因子，血小板来源的生长因子，巨噬细胞炎性蛋白1α，巨噬细胞炎性蛋白1β，及Fas配体。也可根据本文所述方法来鉴定并选择产生任何上述多肽的非-天然存在的分泌性变体的细胞。
除了上述分泌性多肽，本文所述方法也可用来产生融合蛋白，其包含所有或部分融合到氨基酸序列的给定蛋白，所述氨基酸序列指导所述融合蛋白从细胞分泌。一些情况下，所述融合蛋白可允许分泌通常不从细胞分泌的多肽序列。例如，所有或部分蛋白质(例如，膜结合的蛋白质如受体或细胞内蛋白质)可以融合到免疫球蛋白分子的一部分(例如，融合到人IgG1重链的铰链区以及恒定区CH2和CH3结构域)。除外，所有或部分的蛋白质可以融合到异源信号序列。可以融合到指导融合蛋白分泌的序列的蛋白质实例包括但不限于受体(例如，淋巴毒素-β受体)，包括任何本文所述天然存在的分泌性多肽的受体。制备编码融合蛋白的核苷酸时，可以去除细胞表面受体天然存在的跨膜节段来便于分泌所述核酸编码的融合蛋白。
所述分泌性多肽可以是抗体或抗体的抗原-结合片段。所述抗体可以针对抗原，例如，蛋白质抗原如可溶的多肽或细胞表面受体。例如，所述抗体可以针对参与免疫细胞活化的细胞表面受体(例如，CD3，CD4，CD8，CD40，或整联蛋白如α1β1整联蛋白)，疾病相关性抗原(例如，癌症相关性抗原，如HER2或前列腺特异性膜抗原)，或者病原体产生的抗原(例如，病毒或细菌抗原)。所述抗体结合的特定表位可以是由氨基酸，碳水化合物(例如，糖)，无机部分(moieties)(例如，磷酸盐)，或其组合。所述表位可见于N-或O-连接的糖蛋白，蛋白聚糖，及磷酸化的蛋白质。
术语“抗体”指免疫球蛋白分子或其抗原结合部分。本文所用术语“抗体”指的包含至少一个，例如两个重链可变区(“VH”)，和至少一个，例如两个轻链可变区(“VL”)蛋白质。所述VH和VL区域还可以被亚分选为高变区成为“互补确定区”(“CDR”)，其散布在(interspersed)更保守的称为“框架区”(FR)的区域。所述抗体可还包括重链和轻链恒定区，从而分别形成免疫球蛋白重链和轻链。一项实施方案中，所述抗体是两条免疫球蛋白重链和两条免疫球蛋白轻链的四聚体，其中所述免疫球蛋白重链和轻链通过例如，二硫键相互连接。所述重链恒定区包含三个功能域，CH1，CH2和CH3。所述轻链恒定区包含一个功能域CL。所述重链和轻链的可变区包含一个与抗原作用的结合功能域。
所述分泌性多肽可以是完全人抗体(例如，在小鼠中制造的抗体，该小鼠通过遗传改造从人免疫球蛋白序列产生抗体)，或非-人抗体，例如，啮齿动物(小鼠或大鼠)，山羊，或灵长类动物(例如猴)的抗体。
抗体可以是其可变区或其一部分，例如CDR，在非人生物体，例如小鼠或大鼠中产生的抗体。杂合的、CDR移植的、或人源化抗体可以在本文所述方法中用作分泌性多肽。
抗体可以用本领域给定方法人源化。例如人源化抗体可以通过将不直接参与抗原结合的Fv可变区序列置换为人Fv可变区的对等(equivalent)序列来制备。产生人源化抗体的常用方法见，例如，Morrison(1985)Science 2291202-1207所述。
编码分泌性多肽的核酸本发明包含鉴定并选择表达分泌性多肽的细胞的方法。一些实施方案中，所述分泌性多肽由引入细胞的异源核酸编码，或在插入或活化调节编码所述分泌性多肽的基因表达的序列之后由细胞产生。
任何将核酸引入细胞的方法可以用来产生异源核酸编码的分泌性多肽。所述核酸可以是裸露的或与运输载体相连(associated)或复合。使用裸DNA的描述，见例如，美国专利5,693,622。
核酸可以通过转染方法引入细胞，所述方法如磷酸钙转染，用DEAE-Dextran转染，通过电穿孔转染，或用阳离子脂质试剂转染。合适的转染方法见例如，Current Protocols in Molecular Biology(1999)John Wiley &Sons，Inc的描述。
核酸可以用递送载体递送到细胞，所述载体如脂类，贮存系统，水凝胶网络，微粒，脂质体，ISCOMS，微球体或纳米球，微胶囊，微颗粒，金颗粒，病毒样颗粒，纳米颗粒，聚合物，浓缩剂，多糖，多氨基酸，树状物，皂苷，吸收增强物，胶体悬液，分散，粉末，或脂肪酸。
也可用病毒颗粒，例如逆转录病毒，腺病毒，腺伴随病毒，痘苗病毒，SV40病毒，α病毒，慢病毒，或疱疹病毒，来将所述异源核酸引入细胞。
微颗粒或纳米微粒可以用作将核酸递送进入细胞的载体。微颗粒可包含包埋在聚合基质或包含在聚合物壳内的大分子。微颗粒会保持大分子的完整性，例如，通过保持DNA在非降解状态。
编码分泌性多肽的核酸构建体可可选包括编码选择性标记物或报道蛋白的核苷酸序列。一些情况下，编码选择性标记物或报道蛋白的核苷酸序列被包含在第二核酸构建体，所述第二核酸构建体与编码所述分泌性多肽的核酸构建体共同引入细胞。所述选择性标记物或报道蛋白可提供除了本文所述的筛选方法之外的其它机制，来鉴定包含编码所述分泌性多肽的核酸的细胞。选择性标记物包括，例如，对新霉素，卡那霉素，潮霉素，或甲氨喋呤具有抗性的蛋白质。报道蛋白包括，例如β半乳糖普酶，萤光素酶，和荧光蛋白如绿色荧光蛋白。本文所述的检测和选择方法可以在选择性标记物或报道蛋白存在或缺失时进行。
选择产生分泌性多肽的细胞鉴定产生分泌性多肽的细胞，可以通过使所述细胞接触特异性结合所述分泌性多肽的化合物，并检测所述化合物与所述细胞表面的分泌性多肽的结合。除外，可以基于在结合所述细胞表面的分泌性多肽的所述化合物的存在或量从其它细胞筛选所述细胞。“选择”细胞包括将单个细胞分离到包含那个细胞但不包含其它细胞的容器中(例如，为克隆细胞的单个细胞分选)，并基于所述细胞的相似特征，就具有所述化合物与细胞表面上的所述分泌性多肽的结合而言，将所述细胞与一群细胞一起分离。
可以通过使用流式细胞法和细胞分选技术从细胞群中的其它细胞选择细胞。在流式细胞法中，当所述细胞以单个细胞的流体流(fluid scream)的形式(file)流过光和/或电感受器时测定细胞。流式细胞器通常使用激光作为光源，测量被细胞散射的光(为它们的大小和内部结构提供信息)，并测量以下物质所发射的数个光区内的荧光染料，或标记的探针，或以特定的且化学计量(stoichiometrically)的方式结合细胞组分如抗原的试剂。流式分选(flowsort)使具有预选定特征的细胞从流(stream)转向(divert)并被收集作进一步分析。流式细胞器的光学装置类似于荧光显微镜。流式细胞法与细胞分选详细描述见例如，Darzynkiewicz等(2000)Flow Cytometry，3rd Edition，San Diego，Academic Press，2000；和Givan(2001)Flow CytometryFirst Principles，2nd Edition，New York，Wiley-Liss。
对于流式细胞法和细胞分选，特异性结合所述分泌性多肽的所述化合物可以是蛋白质，如抗体。所述抗体上可有标记，例如，荧光标记。或者，可用第二化合物(例如，第二抗体)特异性结合第一抗体，其中所述第二化合物包含标记或者与其它包含标记的化合物结合。例如，结合所述分泌性多肽的抗体可以被标记，例如，生物素化，然后与所述分泌性多肽接触。所述抗体-分泌性多肽复合物可以例如，用荧光标记偶联的抗生物素蛋白来检测。
可以根据本文所述方法进行一或多轮细胞分选。多轮分选可用于富集产生特别高水平的所述分泌性多肽的细胞。可以在每轮细胞分选的间期培养细胞，或者可以重新分选(resort)细胞，而在分选中没有任何培养期。细胞可选地基于它们表达的两或多种不同分泌性多肽或分泌性多肽和报道蛋白进行分选。分选过程中也可用的其他参数包括但不限于细胞大小，细胞生存力，或其它细胞表面标记物的表达。
除了流式细胞法和细胞分选法，可以用多种技术选择细胞，所述技术允许选择具有细胞表面上与分泌性多肽特异性结合的化合物的细胞。所述选择方法实例包括磁性分离技术(例如，用磁标记的化合物，如特定吸附到磁珠的抗体)或淘选技术。磁分离技术和淘选技术的描述见，例如，Murphy等(1992)J.Cell.Sci.1992 102789-98。
一些实施方案中，本文所述方法可在不向所述细胞添加物质的条件下检测所述化合物与所述细胞表面上所述分泌性多肽的结合，所述物质可包裹所述细胞(例如，形成围绕该细胞的基质)和/或将所述分泌性多肽固定在所述细胞附近。例如，用于使化合物接触细胞并从所述细胞洗涤未结合的化合物的缓冲液，可以是用于流式细胞法和细胞分选的标准缓冲液(例如，磷酸盐缓冲盐水，可选包括胎牛血清)。
在根据本文所述方法可以检测和/或选择的细胞与结合所述分泌性多肽的化合物接触时，以及在相关的温育和细胞洗涤期，所述细胞可保存在大约4℃-10℃的温度范围(例如，约4℃)。在相对低的温度处理所述细胞可便于所述分泌性多肽在所述细胞表面保留，之后通过化合物的特异性结合检测所述细胞。
检测并纯化分泌性多肽除了本文所述的所述细胞-结合的筛选方法，在分泌性多肽从给定细胞分泌之后，可以在组织培养基中检测该多肽。所述方法可以用于定量由给定细胞产生的分泌性多肽的量。例如，包含如本文所述分选的细胞的细胞培养物的一等分量组织培养基可以用于测定其中包含的给定分泌性多肽的量。所述测定可以用于确定根据本文所述的方法选择的细胞正在分泌所述分泌性多肽或正在分泌限定浓度的所述分泌性多肽。检测所述分泌性多肽的方法包括但不限于，酶联免疫吸附测定(ELISA)，免疫沉淀法，免疫荧光，酶免疫测定(EIA)，放射免疫测定(RIA)，和Western印迹分析。也可进行生物测定来确定所述分泌性多肽的生物活性。可根据所述分泌性多肽的生物功能改变生物测定的性质。
所述分泌性多肽可可选从包含产生所述分泌性多肽的细胞的组织培养基纯化。纯化可以通过使所述培养基接触亲合剂，例如特异性结合所述分泌性多肽的抗体。所述分泌性多肽可可选被纯化到均一。
本发明还通过如下实施例来阐述，它不应限定本发明范围。
实施例实施例1用荧光标记的抗体对浆膜上的分泌性量组蛋白质直接、产物-特异性染色用质粒载体pAND162和pAND160转染CHO细胞，所述载体分别编码抗α1β1整联蛋白(AQC2 mAb)的人源化单克隆抗体的轻链和重链。质粒pAND162编码新霉素抗性选择标记物，而质粒pAND160编码野生型DHFR。两种质粒都使用CMV中间-早期(intermediate-early)启动子，它从在TATA盒上游大约500bp的限制性位点延伸到天然CMV中间早期基因起始密码子附近的多接头(polylinker)。所述启动子区域包括在5′未翻译区的剪接(splice)供体和受体位点。所述多腺苷酸化位点源自人生长激素变体序列。
将DHFR缺陷的DG44 CHO宿主细胞保存在包含核苷的无血清培养基中进行旋动培养。用电穿孔进行转染。转染细胞系在补充有10％透析过的胎牛血清(FBS)(Hyclone，Logan，UT)和2mM谷氨酰胺(Life Technologies，GrandIsland，NY)的α-MEM(alpha minus MEM)中生长。电穿孔之后，在6-孔组织培养皿(culture dish)(BectonDicldnson，Franklin Lakes，NJ)培养所述细胞。感染(infection)后三天，将400μg/ml G418(Geneticin，Life Technologies，GrandIsland，NY)加入包含补充有10％透析的FBS和2mM谷氨酰胺的α-MEM的培养基。一旦细胞已经达到约80％的满底(confluence)，将所述孔汇总并分选。
由编码人源化AQC2抗体的pAND162和pAND160质粒转染的CHO细胞，用荧光标记的抗-人抗体标记。然后用激光共聚焦显微镜法(microscopy)观测所述细胞的染色。将所述细胞保留在冰上至共聚焦分析。用配备了红色激光二极管和Leica共聚焦软件V2.00 build 0368(Leicamicrosystems，Heidelberg GmbH，Germany)的Leica TCS SP共聚焦显微镜获得荧光和微分干涉对比显微照片。对通过40X油浸物镜观察的细胞进行显微照相。检测到所转染细胞的浆膜被所述抗-人抗体强烈(intense)染色。检测到未转染的DG44 CHO宿主细胞的浆膜无染色。当流式细胞法所用的检测器(detector)比激光共聚焦显微镜法所用的那些更灵敏时，也用流式细胞法来检测已经用针对分泌性人源化AQC2抗体的荧光试剂标记的转染后CHO细胞群(见实施例3)。
实施例2在无甲氨喋呤存在时产生高产重组CHO细胞系质粒pXLTBR.9包含编码野生型DHFR的核苷酸序列以及编码融合到人IgG的结构域，CH2和CH3(LTβR-Ig)的淋巴毒素-β受体(Brown等(1995)J.Immunol.15433)的核苷酸序列。pXLTBR.9使用CMV中间-早期启动子，如实施例1对pAND162和pAND160的描述。
根据实施例1所述方法通过电穿孔用pXLTBR.9转染DG44 CHO细胞。所述pXLTBR.9转染的细胞系在如下培养基生长HYQPF-CHO(HycloneLaboratories，Logan，UT)，无血清培养基，或无血清α+MEM培养基(α+MEMSF)，无FBS的富集α+MEM。
选择使所述pXLTBR.9转染子生长(outgrowth)超过14天后，汇总所述细胞并在4℃用山羊抗-人IgG分子的RPE标记的F(ab′)2片段标记。这些细胞，以及染色的阴性对照CHO细胞，在预备性分选前用分析流式细胞法处理。图1A显示阴性对照、而未转染CHO细胞的图。所述FL-2图衍生自活细胞门(gate)(基于PI染色排除，左上)，以及双分辨门(脉冲宽对FSC，来排除双联体(doublet)，右上)的组合。R2表示所述分选门。图1B显示用pXLTBR.9转染的CHO细胞的图。所述分选门R2在所有三项反复分选中都被设定为收集最亮的5％的R-PE阳性细胞。所述转染细胞(图1B)包含的细胞群的荧光强度大大超过阴性对照(图1A)的荧光强度。为预备分选所述转染细胞，设定门使包括的细胞在所述细胞群的荧光强度最强的5％。分选所述门(gated)细胞，并通过在选择性条件下培养来扩增它们的细胞数，并重复此过程两次。
对产生LTβR-Ig的细胞系，在分选后进行分析性扫描来评价所述分选的质量。所述分析性扫描以及通过试验确定的池(pool)中LTβR-Ig的比产率(SPR)见图2A-2C显示。未经分选的转染细胞的SPR为大约0.5pg/细胞/天(pcd)。图2A是在第一次分选之后收集的产生LTβR-Ig的细胞样品的分析性扫描，表示所述分选产生出荧光强度均值增加并且比产率(在扩增所述培养细胞之后确定SPR值)相应增加的细胞群。图2B是在第二次分选之后收集的产生LTβR-Ig的细胞样品的分析性扫描，表示在反复分选之后，荧光强度和比产率都有逐渐的增加。图2C是在第三次分选之后收集的产生LTβR-Ig的细胞样品的分析性扫描。所述三轮细胞的分选使所述池的SPR平均值提高了大约10倍达到5.1pcd(表1)。
表1未分选的和连续分选的LTβR-Ig表达细胞的CHO池的比产率证明比产率随反复分选升高
LTβR-Ig池 平均SPR(pg/细胞/天)±S.D.
未分选 0.5±0.0第一次分选 3.1±0.1第二次分选24.5±0.3第三次分选35.1±0.7为获得表1描述的SPR测定结果，在9.6cm组织培养皿、在2ml含血清的培养基中培养2×105细胞。在培养三天之后收获所述细胞及上清。每份样本一式三份进行SPR测定。
在第三次分选时，将克隆从血细胞计数器直接分离到96孔板。数周后，被测定的克隆显示比产率范围维持在4到11.5pcd(表2)。产量最多的克隆显示无需甲氨喋呤扩增比产率即升高(enrichment)23倍。在此升高过程中，通过ELISA测定50个克隆。鉴定最好克隆的时间(timeline)是转染后大约九周。
表2从经过三轮反复FACS分选的池中分离的表达LTβR-Ig的CHO克隆的比产率LTβR-Ig克隆 平均SPR(pg/细胞/天)1 3.6±0.13 5.6±0.65 11.5±0.28 7.5±0.121 9.9±1.422 7.5±0.724 9.3±0.825 10.5±1.1对于表2描述的试验，在包含血清的培养基中对每份样本进行一式三份各三天的SPR测定。
在本文所述试验中，在通过Accutase处理(Innovative Cell Technologies，La Jolla，CA)在分选前收获细胞，然后将其维持在0-4℃用来做所有之后的处理。使所述细胞通过70μm的尼龙筛(mesh)(BectonDickinson Labware，Franklin Lakes，NJ)，用冷的磷酸盐缓冲盐水(PBS)(Life Technologies，GrandIsland，N.Y.)洗涤两次，然后计数并估计生存力。通过在1,000RPM在4℃离心5分钟再次粒状沉淀(pellet)所述细胞，并在含荧光标记抗体的冷DMEM/BSA中重悬。
染色最少1×107个细胞，来用R-藻红蛋白(RPE)偶联的山羊抗-人IgGF(ab′)2(JacksonImmunoresearch，West Grove，PA)检测浆膜表面的LTβR-Ig(或实施例3中的人源化AQC2mAb)，所述抗体浓度为在补充了2％胎牛血清白蛋白(BSA)(Sigma Chemical Co，St.Louis，MO)的Dulbecco氏极限必需培养基(DMEM)(Life Technologies，Grand Island，N.Y.)中的每1×105个细胞0.2-1μg抗体。在15分钟冰上温育后，用冷PBS洗涤所述细胞两次，并在加有2μg/ml二碘化丙啶(PI)(Molecular probes，Eugene，OR)的PBS中重悬。取出大约5×105个细胞来通过FACscan细胞计数器作分选前预分析。用未转染的DG44 CHO细胞作为阴性对照。
在FASCan流式细胞仪(Becton Dickinson，San Jose，CA)上进行分析性流式细胞法扫描，该仪器装备有Cellquest v3.0软件及以488nm发射的空气冷却型氩激光器。用585nm通带滤光器(band pass filter)在F1-2上检测PE发射(emission)并在F1-3上检测PI发射。
在Moflo流式细胞仪(Cytomation，Fort Collins，CO)进行高速细胞分选，该仪器装备了Summit 3.0软件和用于荧光激发的在488nm发射的氩激光器。在F1-2上，用670/40nm通带滤光器检测PE发射，并在F1-4上，用670/40通带滤光器检测PI放射。用Summit中的Cytomation′s DSP(数字信号过程)板(board)完成PE/PI发射光谱重叠的对消(compensation)。在FSC对F1-4点图中排除死细胞，并且在FSC宽度对面积的点图中排除双联体。在活细胞门的F1-2图上进行PE-标记的信号门。所述分选门是活细胞门、所述双分辨门、及在F1-2的分布门的组合。
用ELISA沉淀从组织培养上清的LTβR-Ig滴度。用LTβR-Ig抗体包被分析板，并用抗-人IgG辣根过氧化物酶(HRP)偶联物(Jackson ImmunoresearchLaboratories，Inc.，West Grove，PA)检测结合的LTβR-Ig。通过标准值的线性回归分析来确定LTβR-Ig的浓度。
对于每个群体或克隆，在6-孔组织培养板(CornInc.，Com，NY)的每个孔、在2ml生长培养基中接种1×105个细胞。一式三份进行测定。让所述细胞生长3天，收获调节后的(conditioned)培养基来分析，并通过Accutase转移细胞并进行计数。通过ELISA从培养基样本定量特异性LTβR-Ig(或AQC2抗体，如实施例3)的滴度。SPR特异性蛋白质/细胞/天(pg/细胞/天)以皮克测定，是生长速率和产率的函数，如如下公式所表示 实施例3产生甲氨喋呤扩增的重组CHO细胞系抗α1β1整联蛋白的人源化抗体的轻链和重链(AQC2 mAb)从CHO细胞中分离的质粒pAND162和pAND160表达进入(如实施例1所述)。在DHFR及G418选择下转染并扩增之后，比产率为0.3pcd的全部的转染细胞群，用荧光的山羊抗-人IgG的F(ab′)2片段标记，并且通过细胞分选收集经过荧光强度测定为表达最多的2-5％细胞。在扩增大约一周后，对分选的细胞进行第二次分选。再扩增所述细胞，然后在第三次分选中以每孔一个细胞置于96孔板中。对于所述LTβR-Ig(实施例2)，分选使得所述标记细胞的荧光强度以及对池和克隆测定的比产率稳定增加。
对于通过ELISA定量AQC2 mAb，用AQC2特异性抗原融合蛋白包被测定板。用驴抗-人IgG(H+L)辣根过氧化物酶偶联物(JacksonImmunoResearch，West Grove，PA)检测结合的AQC2 mAb。
大约117个克隆被扩增到24孔板并筛选抗体滴度。表达最高的克隆还在SPR测定中分析。从表达最高的十个克隆中去除G418，然后所述克隆仍在包含100nM或250nM甲氨喋呤的培养基中扩增。筛选扩增的池的抗体滴度。对qP等同或高于13.5pcd的细胞群进行高速细胞分选，并且自动克隆表达较高的2％细胞群到96孔板。产生抗体最多的克隆中的两个，克隆5A和11B未扩增的qP分别为3.3和8.0pcd(表3)。当克隆5A在250nM甲氨喋呤存在时扩增，所产生的池的比产率为16.6pcd。在荧光活化的细胞分选和克隆之后，测定的52个克隆中最好的产生者(producer)显示的qP为41.0和32.3pcd。同样，对于克隆11B，只在100nM甲氨喋呤中扩增的细胞比产率为18pcd，并且在大约126个筛选的克隆中产生出qP达32.5pcd的克隆(表3)。
表3从在甲氨喋呤(MTX)扩增之前和之后进行三轮反复FACS分选的池中分离的、表达AQC2 mAb的CHO细胞的比产率

对于表2描述的试验，在包含血清的培养基中对每份样本进行一式三份三天的SPR测定。
图3描述用编码所述AQC2 mAb的质粒转染的未经分选CHO细胞(左)相对于扩增的克隆11BA-100(右)的分析性扫描，其表示在甲氨喋呤扩增、分选及克隆之后，荧光强度均值和比产率都增加。所述FL-2图源自在活细胞门内的PE信号的分析。图3表示与最初的转染子池相比(其也与高水平产物分泌的相关)，在100nM甲氨喋呤中扩增的克隆11BA-100的峰荧光强度均值增加了32倍。在250nM甲氨喋呤中扩增的池具有13.5pcd的qP并在相同尺寸的筛选(表3)中产生达27pcd的克隆。荧光强度增加与蛋白质分泌的显著增加相关。如所述LTβR-Ig融合蛋白(实施例2)所见，荧光强度是分泌性蛋白比细胞产率的有用替代标记物。
其它实施方案因为本发明已经结合其具体描述来进行描述，前述描述应为说明而不应限制本发明范围，它由权利要求来限定范围。其它方面，优点和修改都应在权利要求的范围内。
权利要求
1.产生分泌性多肽的细胞的选择方法，所述方法包括提供细胞群，其中所述细胞群包含一种细胞，所述细胞包含编码分泌性多肽的异源核酸；使所述细胞群与特异性结合所述分泌性多肽的化合物接触；检测所述化合物与所述细胞表面上的分泌性多肽的结合；并且基于与所述细胞表面上所述分泌性多肽结合的化合物的存在或量来选择细胞。
2.权利要求1所述的方法，其中所述细胞是非转化细胞。
3.权利要求1所述的方法，其中所述细胞是真核细胞。
4.权利要求3所述的方法，其中所述细胞是哺乳动物细胞。
5.权利要求4所述的方法，其中所述细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。
6.权利要求1所述的方法，其中所述细胞不是B细胞或者通过B细胞和另一细胞融合形成的细胞。
7.权利要求1所述的方法，其中所述分泌性多肽是抗体。
8.权利要求7所述的方法，其中所述抗体是人源化抗体。
9.权利要求1所述的方法，其中所述化合物是被标记的。
10.权利要求9所述的方法，其中所述化合物是被荧光标记的。
11.权利要求1所述的方法，其中所述化合物是抗体。
12.权利要求11所述的方法，其中所述抗体与所述细胞表面上的分泌性多肽的结合通过流式细胞法来检测。
13.权利要求12所述的方法，其中所述细胞通过荧光激活的细胞分选法来筛选。
14.权利要求13所述的方法，其中所述细胞与细胞群中的多个细胞一起被选择，该细胞群显示所述化合物在与多个细胞表面的分泌性多肽结合。
15.权利要求14所述的方法，其中所述多个细胞包含所述细胞群的至少1％。
16.权利要求15所述的方法，其中所述多个细胞包含所述细胞群的至少5％。
17.权利要求13所述的方法，其中所述细胞被保存在包含所述细胞但不含其它细胞的容器中。
18.权利要求13所述的方法，还包括培养所选择的细胞来制备产生所述分泌性多肽的第二细胞群；使该第二细胞群与所述抗体接触；检测所述抗体与第二细胞群细胞的表面上的分泌性多肽的结合；并且基于与所述细胞表面的分泌性多肽结合的抗体的存在或量、通过荧光激活的细胞分选法来选择所述第二细胞群的细胞。
19.权利要求13所述的方法，其中使所述细胞群接触所述抗体在4℃到10℃。
20.权利要求19所述的方法，其中使所述细胞群与所述抗体接触在大约4℃。
21.权利要求1所述的方法，还包含在使所述分泌性多肽分泌到培养基中的条件下，在培养基中培养所选择的细胞；并且纯化来自所述培养基的分泌性多肽。
22.制备产生分泌性多肽的细胞的方法，所述方法包含将编码分泌性多肽的异源核酸引入细胞；在使得所述分泌性多肽合成的条件下培养所述细胞；使所述细胞与特异性结合该分泌性多肽的化合物接触；通过所述化合物与所述细胞表面上的分泌性多肽的结合，检测所述分泌性多肽的表达；并且通过荧光激活的细胞分选法筛选所述细胞。
23.确定细胞产生的分泌性多肽的存在或量的方法，所述方法包括使产生分泌性多肽的细胞与特异性结合所述分泌性多肽的化合物接触，其中所述细胞不是B细胞或通过B细胞和另一细胞融合形成的细胞；并且检测所述化合物与所述细胞表面上的分泌性多肽的结合，从而确定所述细胞产生的分泌性多肽的存在或量。
24.权利要求23所述的方法，其中所述细胞包含编码所述分泌性多肽的异源核酸。
25.选择细胞的方法，所述方法包括提供包含经遗传改造而含有编码分泌性多肽的核酸的多个细胞的细胞群；使所述细胞群与特异性结合所述分泌性多肽的化合物接触；并且选择有所述化合物结合于其表面的细胞。
全文摘要
本发明涉及检测由细胞产生的分泌性多肽的方法，以及选择产生高水平的所述分泌性多肽的细胞的方法。所述方法可用来选择产生高水平分泌性多肽的细胞，所述多肽由已导入细胞中的异源核酸编码。
文档编号G01N33/569GK1668634SQ03816511
公开日2005年9月14日 申请日期2003年5月20日 优先权日2002年5月22日
发明者格雷格·蒂尔 申请人:比奥根艾迪克Ma公司