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专利名称：多个传染病项目联合检测的化学发光免疫分析试剂盒的制作方法
技术领域：
本实用新型提供了 一种多个传染病项目联合检测的化学发光免疫分析试剂
盒o
背景技术：
艾滋病，即获得性免疫缺P各综合症(Acquired I聽re Deficiency Syndrome, AIDS)，是由人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus, HIV)引起的 严重疾病。AIDS可通过性传播、血液传播和母婴传播三种途径感染人类。HIV(l+2) 抗体的检出是艾滋病诊断的必要条件，目前的艾滋病病原学诊断技术主要包括 HIV病毒分离、HIV病毒载量测定、HIV核酸测定，以及病毒抗原检测和病毒特异性 抗体检测等。其中抗体检测是常^见检测方法，包括ELISA、 CLIA、 PA、 IFA和斑点 印迹在内的检测技术用于筛选实验，免疫印迹试验(WB)用于确认实验，抗体检 测以外的方法用于特殊情况的检测。
梅毒(Syphilis)是由梅毒螺旋体(又称苍白螺旋体，TP)引起的常见性传 播疾病之一。其临床病程漫长，临床表现极为复杂，几乎可侵犯全身各种组织和 器官，并产生多种多样复杂的临床症状和体症，可反复发作。梅毒是一种全身性 的疾病，早期主要侵犯皮肤粘膜，晚期侵犯内脏器官，严重者可引起严重的心血 管系统和神经系统损害。
乙型肝炎是一种严重的常见的肝脏疾病，目前全球人口中，超过20亿人已经 在其生命中的某个时期感染过乙型肝炎病毒(HBV),其中，大约3.5亿仍然为慢性 感染者，成为病毒的携带者。全世界四分之三的人口生活在感染的高发区。每年 HBV急性临床病例超过4百万，携带者中大约25%，也就是每年100万人死于慢性活动性肝炎、肝硬化或原发性肝癌。我国是世界上乙肝病毒感染最严重的国家， 约有1.2亿人为乙肝病毒携带者，占世界的三分之一。其中3000万为慢性肝炎、肝 硬化、原发性肝癌，每年有30万人死于慢性肝病，其中约13万人为原发性肝癌患 者。
丙型肝炎是一种主要经血液传播、由丙型肝炎病毒引起的严重肝脏疾病。全 世界目前有l亿丙型肝炎病毒携带者，中国约占四千万人。80%的丙型肝炎病毒携
带者会患上慢性肝炎，其中约10-30%的病人将发展为肝硬化，5-10%的肝硬化患者
可发展成肝癌。
这些传染性疾病已严重威胁人类的健康，对付传染病最有效的方法就是切断 其传播途径，传染病标志物的检测对疾病的早发现，早治疗、早预防尤显重要， 传统的检测方法主要是单个项目进行检测，操作繁瑣，检测时间长，成本高，而 且容易出现操作错误。
临床上对上述血清标志物的检测常常都一份样本需同时检测几个项目，最常 见的检测项目组合有血源筛查四项(HIV抗体、TP抗体、HCV抗体和HBsAg),肝 五项(HBsAg、 HBsAb、 HBeAg、 HBeAb和HBcAb )和传染病八项(HIV抗体、TP抗 体、HCV抗体、HBsAg、 HBsAb、 HBeAg、 HBeAb和HBcAb)。血源筛查四项常用于供 血者和患者手术前的常规检测，乙肝五项是国内一个最常见的检测组合，目前广 泛用于临床检测，传染病八项也常常患者手术前的检测项目，在很多医疗机构已 经成为 一项入院常^L检测。
与传统检测方法相比，本实用新型采用先进的微孔板化学发光免疫分析法， 在一次试验中可以同时对一份样本进行多个传染病项目的^r测，同时得到检测结 果；具有与传统试剂盒一样的灵敏度和特异性，但操作易用性大大提高，缩短了 操作时间、操作程序，可灵活地组合几种不同的检测项目。有利于大规模推 广应用。本实用新型的反应与传统化学发光法几乎一样，应用表面特殊处理的标 准不透明96孔微孔板作为载体，保证了反应的方便性与快捷性，兼容市场上通用
4的所有型号洗板机或全/半自动板式化学发光免疫分析系统；解决了其它基于玻片 或膜等的生物芯片反应步骤的手工操作过多且操作复杂、可重复性差、均一性差 等问题。
发明内容
本实用新型的目的是提供了简便、快捷、准确的联合检测多个传染病项目的 化学发光免疫分析试剂盒。
本实用新型是由96孔位的支撑架及放置其上的可拆卸的不透明微孔板条组 成，其中，每12孔为一个反应条，每个反应条负栽相同的抗原或抗体，检测同一 个传染病项目，可以联合;f企测4-8种传染病项目。
本实用新型精心设计的96孔板化学发光免疫分析试剂盒，高度灵敏和特异， 操作简便快速，可在一次试验中同时检测4-8种传染病项目是否含有待测物，费用 低廉。它简便快速，多个检测项目同时加样，同时洗板，减少加样时间，避免反 复使用样本造成样本的污染和顺序颠倒等操作失误，根据多项检测结果对受检者 进行综合判断，便于样本结果的处理等优点。本实用新型特别适合体检中心，临 床医院推广使用，为临床诊断和科研工作提供一种非常有实用价值的检测手段。

图1、 2本实用新型实施例1的结构示意图。 图3本实用新型实施例2的结构示意图。 图4本实用新型实施例3的结构示意图。
具体实施方式

实施例1制备血源篩查4项联合检测化学发光免疫分析试剂盒 一、酶标记物的制备
用改良的过碘酸钠氧化法标记人类免疫缺陷病毒1 + 2型抗原、梅毒螺旋体抗 原、抗人IgG、乙型肝炎表面抗体。
酶标记物稀释液配制称量12.12g的Tris , 5g BSA和lmL Proclin 300 ,将上述试剂称量好放入洁净容器中，调pH值7. 0 ~ 7. 5加双蒸水至1L，溶解混匀。 分别采用棋盘实验选择四种酶标记物的工作浓度。每个产品分装一瓶，共分 装四瓶或四种酶标记物混合在一瓶中。
二、 传染病项目复合对照品的制备
用人类免疫缺陷病毒抗体(Anti-HIV)、梅毒螺旋体抗体(Anti-TP)、丙型 肝炎病毒抗体(Anti-HCV )、乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)阳性血清经灭活后， 配制成血源筛查4项复合阳性对照，用正常人血清或新生牛血清配制成复合阴性 对照，2mL/瓶分装。
三、 固相微孔板条的制备
如图1所示，在反应条A、 B板条上的微孔中包被上HIV 1 + 2型抗原，C和D 板条上的微孔中包被上梅毒抗原(TP15, TP17, TP47蛋白)，在E和F板条上的微 孔中包被上丙型肝炎病毒抗原，在G和H板条上的微孔中包被上乙型肝炎病毒表 面抗体。如检测样本量较少，可在A-D排依次按上HIV、 TP、 HCV和HBsAg的固 相微孔板条，如图2所示。四种检测项目包被板条尾翼上分别贴上标有"HIV、 TP、 HCV、 sAg"的小标签。
四、化学发光底物液
A液是在双蒸水中加入Tris和浓HC1配成0.1M pH为8.5的Tris-HCl 緩冲液，包含4.0mg/mL的Luminol和0.3mg/mL的对缺苯酚。或购买其它 商用的化学发光底物A液。
B液是在双蒸水中加入柠檬酸三钠和柠檬酸，配制成0.1M pH值为4.6 的柠檬酸緩冲液，包含200mg/mL的过氧化氢溶液。或购买其它商用的化学 发光底物B液。
五、2G倍洗涤液
称量9. 9g NaH2P04 . 2H20, 56. 0g的NaH2P04 12H20 , 116g NaCl于洁净容器 中，加双蒸水至1L,溶解混匀，调整PH至7. 4 。六、半成品及成品组成
上述步骤所得产品分装即为半成品。抽出三份经过特异性、精密性、灵敏度 及稳定性检定合格才能组装成血源筛查四项联合检测化学发光免疫分析试剂盒。 组装成试剂盒后需抽检合格后才能出厂。
实施例2制备乙肝五项联合检测化学发光免疫分析试剂盒
一、 酶标记物的制备
用改良的过硤酸钠氧化法标记乙型肝炎病毒表面抗体、乙型肝炎病毒表面抗 原、乙型肝炎病毒e抗体、乙型肝炎病毒核心抗体。
酶标记物稀释液配制称量12.12g的Tris ， 5g BSA和lmL Proclin 300 , 将上述试剂称量好^t入洁净容器中，加双蒸水至1L，溶解混匀。
分别采用棋盘实验选择四种酶标记物的工作浓度。每个产品分装一瓶，共分 装四瓶，其中酶标乙型肝炎病毒e抗体可同时用于乙型肝炎病毒e抗原和e抗体 的检测。
二、 传染病项目复合校准品的制备
采用基因工程HBsAg、基因工程HBeAg用新生牛血清稀释至一定浓度，配 制成乙肝抗原复合阳性对照，用多克隆HBsAb、多克隆HBeAb和多克隆HBcAb 用新生牛血清稀释至一定浓度，配制成乙肝抗体复合标准品，用乙肝五项全阴性 正常人血清或新生牛血清配制成乙肝复合阴性对照，分别分装阴阳性对照品，2mL/ 瓶。
三、 固相微孔板条的制备
如图3所示，在板条A的微孔中包被乙型肝炎病毒表面抗体，在板条B中包 被乙型肝炎病毒表面抗原，在板条C微孔中包被乙型肝炎病毒e抗体，在板条D 微孔中先包被乙型肝炎病毒e抗体，再包被适量的乙型肝炎病毒e抗原，在板条E 的微孔中包被乙型肝炎病毒核心抗原，板条A-E分别用于检测HBsAg、 HBsAb、HBeAg、 HBeAb、 HBcAb，并在板条尾翼上分别打上标签"sAg, sAb, eAg, eAb, cAb"。
四、 化学发光底物液
A液是在双蒸水中加入Tris和浓HC1配成0.1M pH为8.5的Tris-HCl 緩冲液，包含4.0mg/mL的Luminol和0.3mg/mL的对橫苯酚。
B液是在双蒸水中加入拧檬酸三钠和柠檬酸，配制成0.1M pH值为4.6 的柠檬酸緩冲液，包含200mg/mL的过氧化氢溶液。
五、 20倍洗涤液
称量9. 9g NaH2P04 2H20， 56. Og的NaH2P04 . 12H20 , 116g NaCl于洁净容器 中，加双蒸水至1L，溶解混匀，调整PH至7.4 。
六、 半成品及成品组成
上述步骤所得产品分装即为半成品。抽出三份经过特异性、精密性、灵敏度 及稳定性检定合格才能组装成联合检测乙肝五项化学发光免疫分析试剂盒。组装 成试剂盒后需抽检合格后才能出厂。
实施例3制备传染病八项联合检测化学发光免疫分析试剂盒
配制HIV抗体、TP抗体、HCV、 HBsAg、 HBeAg混合阳性对照，用于HIV、 TP、 HCV、 HBsAg和HBeAg，配制HBsAb、 HBeAb、 HBcAb为乙肝抗体混合阳性对照，用 新生牛血清配制阴性对照。分别分装阴阳性对照品，2mL/瓶。
酶标记物和固相微孔板条的制备方法同实施例1和2，将包被好的微孔板条按 HIV、 TP、 HCV、 HBsAg、 HBsAb、 HBeAg、 HBeAb、 HBcAb顺序依次安插于96孔支撑 架A — H朝卜上，如图4。
试剂盒中其余成分的制备方法同实施例1和2
实施例4联合检测试剂盒的使用方法
8当样本需要同时检测HIV抗体、TP抗体、HCV抗体和HBsAg时，使用实施例1 试剂盒。
当样本需要同时检测HBsAg、 HBsAb、 HBeAg、 HBeAb和HBcAb时，使用实施例 2试剂盒。
当样本需要同时检测HIV抗体、TP抗体、HCV抗体、HBsAg、 HBsAg、 HBsAb、
HBeAg、 HBeAb和.HBcAb时，使用实施例3试剂盒。
实施例1 ~ 3联合检测化学发光免疫分析试剂盒的使用方法如下 取出试剂盒室温平衡20 30分钟，拆开包装，取出所用板条，剩余板条用自
封袋密封，4'C保存。
1、 每个检测项目设阴性对照1孔，阳性对照1孔，取每份样本分别加入板条 相应孔内，每孔50ul，同一份血可以不换加样枪头连续加样，不同样本间需更换 枪头，再往阴性对照孔内加入复合阴性对照50(jl，阳性对照孔内加入相应的复合 阳性对照50yl，振荡混匀后，置入37'C温育30分钟。
2、 用稀释后的洗涤液进行洗板，可手工洗板，也可用全自动洗板机进行洗板， 每孔加入洗涤液50ul，浸泡至少10秒，后弃液或吸干，如此反复3~5次。
3、 每孔加入相应的酶工作液50yl，置37。C温育30分钟。
4、 如步骤3洗板5次
5、 每孔加入已1:1混合的化学发光底物液50 ~ lOOul,置室温反应5分钟。
6、 用微孔板化学发光分析仪进行读数，根据Cutoff值判断样本中是否还有 待测物。
权利要求1、一种多个传染病项目联合检测的化学发光免疫分析试剂盒，它是由96孔位的支撑架及放置其上的可拆卸的不透明微孔板条组成，在每个可拆卸的不透明反应条上设置反应孔，在每个反应孔上包被有相应的抗原或抗体，其特征在于每12孔为一个反应条，每个反应条负载相同的抗原或抗体。
专利摘要本实用新型提供了一种多个传染病项目联合检测的化学发光免疫分析试剂盒。本实用新型是由可拆卸的不透明微孔板条组成，在每个可拆卸的不透明微孔板条上设置反应孔。在每个反应孔上包被相应的抗原或抗体。其特征在于每12孔为一个反应板条，每个反应板条负载相同的抗原或抗体，检测同一个传染病项目，不同的反应条组合，可以联合检测4-8种传染病项目。本实用新型能方便、快捷联合检测多种传染病项目。
文档编号G01N21/76GK201237594SQ200820079990
公开日2009年5月13日 申请日期2008年4月16日 优先权日2008年4月16日
发明者于尚永, 唐宝军, 应希堂, 胡国茂, 詹先发, 郑金来 申请人:北京科美东雅生物技术有限公司