专利名称：一种同时测定生脉注射液中原儿茶酸和5－羟甲基糠醛含量的方法
技术领域：
本发明属药物分析技术领域。具体涉及一种同时测定生脉注射液中原儿茶酸和5-羟甲基糠醛含量的方法。
背景技术：
生脉注射液是红参、麦冬、五味子等三味药材经提取、纯化处理配制成的中药注射液，用于心肌梗塞、心源性休克、感染性休克等症，在临床上应用广泛。生脉注射液中的五味子药材含有原儿茶酸、苹果酸、柠檬酸等成分。其中原儿茶酸具有降低心肌耗氧量，拮抗肾上腺素所致的耗氧量增加，提高心肌耐氧能力，减慢心率，改善缺血中心区的乳酸和K+的产生，缩小心肌梗塞范围的作用，是本品中的有效成分。
关于原儿茶酸对照品的精制方法尚未见文献报道，国家药典委员会目前也无原儿茶酸对照品供应。关于5-羟甲基糠醛的控制，有文献报道，该物质可以引起动物横纹肌及内脏损害，如国家医药管理局中草药情报中心站，植物药有效成分手册，人民卫生出版社，1986，p858，但尚未见到关于5-羟甲基糠醛限度的报道。中国药典(2000年版)葡萄糖注射液中5-羟甲基糠醛的检查方法为取葡萄糖注射液稀释成1％的浓度，在284nm波长处测定吸收度，不得大于0.32。
生脉注射液收载于我国的国家药品质量标准中。目前，本品的质量标准尚不够完善。如在含量测定项下仅有人参中人参皂苷Rg1和人参皂苷Re的含量测定，对其他药味有效成分的含量尚未控制；而在检查项下，仅有中药注射液的一般检查项目。用色谱法，通过与原儿茶酸对照品比较，确定本品中含有原儿茶酸。通过分离本品中一未知成分，并应用核磁共振、质谱等技术对其进行结构鉴定，确定该物质为5-羟甲基糠醛。研究中还发现，5-羟甲基糠醛是五味子中的糖和糖苷类成分在注射剂的制备过程中生成的。5-羟甲基糠醛在含量较低时也具有抗心肌缺血的作用，为有效成分，但在浓度较高时则可引起动物横纹肌及内脏的损害，在注射液中须加以控制，但目前本品的质量标准中尚无以上两种成分的控制方法。因此，如何有效控制中药注射剂的毒副作用，是中药制剂需要解决的重大问题。
发明内容
本发明针对以上生脉注射液质量标准不够完善的地方，建立了高效液相色谱法同时测定生脉注射液中原儿茶酸和5-羟甲基糠醛的含量的一种新方法。
本发明通过以下技术路线予以实施。
1、原儿茶酸对照品的制备和质量控制取原儿茶酸粗品，加五倍量的丙酮溶解后，加入二氯化碳至析出大量结晶，抽滤，同法重结晶2次，沉淀在80℃真空干燥3小时，得类白色结晶性粉末。即原儿茶酸精制品。
原儿茶酸精制品的质量通过以下方法控制熔点按中国药典(2000年版)一部(附录VII C)“熔点测定法”第一法测定，样品先在80℃真空干燥至恒重，使用硅油为传温液，升温速率1.5℃/min，测定结果为201～203℃，与文献基本一致(文献值为200～202℃)。本品的熔点应为200～204℃鉴别称取鉴别用原儿茶酸对照品适量，用流动相溶解并稀释成0.5mg/ml的溶液，作为对照溶液，称取原儿茶酸精制品适量，用流动相溶解并稀释成0.5mg/ml的溶液，作为样品溶液，在有关物质检查的色谱条件下，分别取两种溶液各10μl进样，样品溶液主峰的保留时间应与鉴别用对照品溶液主峰的保留时间一致。
有关物质检查照高效液相色谱法(中国药典2000版一部VID附录)测定。
色谱条件 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；乙腈-4mmol/L醋酸铵溶液-冰醋酸(4∶96∶1)为流动相；流速为1.0ml/min；检测波长为258nm.
供试品溶液的制备 精密称取在80℃减压干燥至恒重的原儿茶酸精制品适量，加流动相配成每1ml含0.5mg的溶液，作为供试品溶液。
对照溶液的制备 量取供试品溶液适量，加流动相配成每1ml含5μg的溶液，作为对照溶液。
测定法 分别准确吸取供试品溶液和对照溶液各10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，供试品溶液中杂质峰面积的总和不得大于对照溶液主峰峰面积的1/2。
含量测定 将本品在80℃减压干燥至恒重，取约0.15g，精密称定，用乙醇5ml溶解后，加入45ml新沸放冷的水，混匀。以玻璃电极为指示电极，甘汞电极为参比电极，用氢氧化钠滴定液(0.1mol/mL)滴定，电位法指示终点。每1ml的氢氧化钠滴定液(0.1mol/L)相当于15.41mg的原儿茶酸(C7H6O4)。
本品含原儿茶酸应不少于99.5％。
2.生脉注射液中原儿茶酸和5-羟甲基糠醛的含量测定方法。
本发明优选的实施方案如下(1)色谱条件和系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相为乙腈-4mmol/L醋酸铵溶液-冰醋酸(4∶96∶1)，检测波长258nm。理论板数按原二茶酸峰计算应不低于2500。
(2)对照品溶液的制备 分别精密称取原儿茶酸对照品和5-羟甲基糠醛对照品各约10mg，分别置10ml量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，分别得原儿茶酸贮备液和5-羟甲基糠醛贮备液。精密量取原儿茶酸贮备液1ml和5-羟甲基糠醛贮备液2ml，置100ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，作为对照品溶液。
(3)供试品溶液的制备 精密量取生脉注射液10m，置25ml量瓶中，加入流动相稀释至刻度，摇匀。
(4)测定方法 分别精密量取对照品溶液和供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，用峰面积按外标法计算结果，即得。
1.混合对照品溶液的色谱图2.生脉注射液阴性对照的色谱图3.生脉注射液的色谱图
具体实施例方式1.仪器与试药日本岛津LC-10AT VP高效液相色谱仪，岛津LC-10AT VP输液泵，SPD-10A VP紫外检测器、Class-VP色谱工作站。
鉴别用原儿茶酸对照品(化学对照品，中国药品生物制品检定所，809-9201)。
原儿茶酸粗品(成都市科龙化学试剂厂)。
5-羟甲基糠醛对照品(Acros Organics，含量98％)。
乙腈、甲醇(色谱纯，Fisher公司)，超纯水(西南物理研究所)，醋酸铵、冰醋酸(分析纯，成都市科龙化学试剂厂)，本实验中用到的其他试剂均为分析纯。
2.测定方法色谱条件使用Luna 5u C18(2)柱(150×4.6mm ID)；乙腈-4mmol/L醋酸铵溶液-冰醋酸(4∶96∶1)，流速，0.7mL/min；检测波长258nm；柱温35℃。
对照品溶液的制备 分别精密称取原儿茶酸对照品和5-羟甲基糠醛对照品各约10mg，分别置10mL容量瓶中，用流动相溶解并稀释至刻度。分别得原儿茶酸贮备液和5-羟甲基糠醛贮备液。精密量取原儿茶酸贮备液1mL和5-羟甲基糠醛贮备液2mL至100mL容量瓶中，加流动相稀释至刻度，作为对照品溶液液。
供试品溶液的制备 精密量取生脉注射液10ml至25ml容量瓶中，加入流动相稀释至刻度，摇匀。
测定法 分别精密量取对照品溶液和供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，用峰面积按外标法计算结果，即得。
在以上条件下，对照品溶液、供试品溶液和阴性对照溶液的色谱图见附图。
色谱系统适用性试验以原儿茶酸计算，测得色谱柱的理论板数8.9×103，5-羟甲基糠醛、原儿茶酸和前后色谱峰达到基线分离，5-羟甲基糠醛峰的拖尾因子为1.2，原儿茶酸峰的拖尾因子为1.1，峰形基本对称。
分析方法验证专属性从附图可以看出，制剂的阴性对照对测定无干扰。
线性与范围经测定，5-羟甲基糠醛进样量在0.05~0.8μg之间，以峰面积对进样量(μg)回归，回归方程为A＝1.612×106X-6.945×103，r＝0.9999，原儿茶酸进样量在0.025~0.4μg之间，以峰面积对进样量(μg)回归，回归方程为A＝2.117×106x-1.027×106，r＝0.9999，峰面积与进样量呈良好的线性关系。
精密度测得供试品溶液中，5-羟甲基糠醛和原儿茶酸日内精密度的RSD分别为0.6％和0.4％，日间精密度的RSD分别为0.2％和1.1％。
准确度测得5-羟甲基糠醛的平均回收率为99.5％，RSD为0.6％，测得原儿茶酸的平均回收率为101.3％，RSD为1.7％，
耐用性本法在Luna C18柱，岛津ODS柱等不同品牌色谱柱上，分离效果基本一致，说明本法的耐用性好。
3.测定结果按以上方法测得几批生脉注射液的含量如下
权利要求
1.一种同时测定生脉注射液中原儿茶酸和5-羟甲基糠醛含量的方法，其特征在于该方法包括以下步骤(1)对原儿茶酸对照品的制备和质量控制方法A、使用丙酮和二氯甲烷对原儿茶酸粗品进行重结晶，并在80℃下进行减压干燥；B、原儿茶酸精制品纯度的控制方法，其特征是使用高效液相色谱法测定，用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，乙腈-醋酸铵溶液-冰醋酸系统为流动相，检测波长为258nm，供试品溶液和对照溶液采用流动相配制；C、原儿茶酸精制品含量的测定方法，其特征是使用容量法测定原儿茶酸精制品含量，样品的取样量为0.15g，样品先用乙醇溶解后，再加入新沸放冷的水稀释，用0.1mol/L的氢氧化钠滴定液滴定，以玻璃电极为指示电极，甘汞电极为参比电极，用电位法指示终点。(2)对生脉注射液中原儿茶酸和5-羟甲基糠醛的含量测定方法A、使用高效液相色谱法同时对生脉注射液中原儿茶酸和5-羟甲基糠醛进行含量测定，用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，乙腈-醋酸铵溶液-冰醋酸系统为流动相，检测波长为258nm；B、供试品溶液和对照品溶液采用流动相配制，供试品溶液用流动相稀释至2.5倍的体积，使用外标法测定、计算，即得。
全文摘要
本发明是一种同时测定生脉注射液中原儿茶酸和5－羟甲基糠醛含量的高效液相色谱法。用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；乙腈－4mmol/L醋酸铵溶液、冰醋酸(6∶94∶1)为流动相；检测波长为258nm。取供试品溶液和原儿茶酸、5－羟甲基糠醛的对照品溶液进样，按外标法测定含量。本方法先进、准确、简便、耐用性强，适用于常规分析，对保证生脉注射液的安全性和有效性具有重要意义。
文档编号G01N27/44GK1790013SQ20041008150
公开日2006年6月21日 申请日期2004年12月16日 优先权日2004年12月16日
发明者曾晓春 申请人:雅安三九药业有限公司
专业数控铣床产品供应商
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