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专利名称：应用蛋白质组学技术筛选猪产仔数相关候选基因的方法
技术领域：
本发明涉及基因的筛选方法，尤其涉及猪产仔相关候选基因的筛选方法。
背景技术：
家畜一般都是从野生种经过若干年人工驯化而来，其许多重要的经济性状得到改善，例如生长速度、产仔数、肉质等等。家猪是大约在9000年前从野猪通过人工驯化而来，同样，在过去的几千年里，通过人工选择，许多重要经济性状得到改善，如生长速度、肉质、产仔数和抗病性等。例如，中国梅山猪的窝产仔数在18头以上，而中国野猪的窝产仔数只有大约8头。繁殖性状，尤其是产仔数，是降低猪肉生产成本的重要组成部分，因此有很多研究用来改善这些性状。猪窝产仔数多少直接影响养猪业的生产效益。据Chris (1996)计算， 只要产仔数提高1头/胎，英国养猪业每年就可多获利7亿英镑，而整个欧共体则可多获纯利20亿欧元。在我国，如果母猪产仔数每胎提高1头，每年将增收至少190亿人民币的纯利，并能显著提供我国国民的蛋白食入量，改善人们的膳食结构，提供人民身体素质；同时， 国内市场上猪肉的稳定和提高供应也成为我国粮食安全建设的重要内容；高繁殖力的遗传必将为我国国民经济快速发展起到积极的推动作用。如何提高猪的产仔数？传统上的人工选择是从猪出生后对其表型的观察用来筛选高产仔数的猪，这个表型是由于基因型和环境共同作用的结果。虽然已经取得了一些成果，由于产仔数的遗传力很低，大约为0. 09，此外，这种表型的测定只有在猪很大的时候才能进行并且还有性别限制，因此传统的方法并没有得到充分有效的利用。在过去的几十年中，分子生物学和数量遗传学方法的进步，例如分子标记辅助选择(MAQ技术增加了繁殖性状的遗传改良效率。这种技术能够在猪刚出生的时候并且可以在雌猪和雄猪中进行筛选，此外，其准确度也有很大程度的提高。如果我们要利用这种技术来提高猪的产仔数，首先得找到一个基因或者基因组区域作为与猪产仔数相关联的特定标记。候选基因法已经被证明是一个非常有力的用来鉴定显著影响表型的基因的手段。产仔数候选基因通常是在重要生理过程中起着重要的功能并可以通过关联分析证实。猪繁殖性状是复杂性状，从排卵、 受精、着床、直到仔猪出生，每一个过程都可能会影响猪的产仔数。由于传统的候选基因法严重依赖于这些基因生物学功能和生物学表型，但是到目前为止，大多数生物学表型和基因生物学功能是未知的，因此，候选基因法的利用受到了很大的限制。虽然目前已经报道了很多产仔数相关的候选基因，例如FSHi3、EP0R、FUTl、TGFi3 1、ESR、PRLR和RBP4等，但是真正被验证并真正用于生产的很少。现有方式筛选候选基因效率低下。动物体内真正发挥作用的是蛋白质，蛋白质扮演着构筑生命大厦的“砖块”角色， 随着破译生命密码的人类基因组计划的完成，一个以蛋白质为研究重点的后基因组时代已经拉开序幕，蛋白质将是今后的生命科学重点研究方向之一。蛋白质组学(Proteomics)主要涉及两方面内容一是蛋白质组的组成成分，即蛋白质组表达模式的研究；二是蛋白质组的功能，即蛋白质组功能模式的研究。对蛋白质组成的分析鉴定是蛋白质组学与基因组学相对应的主要部分，它要求对蛋白质进行分离、鉴定的图谱化。蛋白质组学研究的主要技术有(1)分离技术，包括双向电泳和液相色谱(HPLC)，( 鉴定技术，主要是生物质谱技术。分离技术是蛋白质组学研究的核心。目前，研究蛋白质组学的技术路线主要有两条，一条是以双向电泳加生物质谱的方法鉴定生物体系中各种蛋白的表达谱以及各蛋白表达程度的相对变化，另一条路线就是多维色谱与生物质谱相结合的称之为鸟枪法的技术路线。其中国内外大多数研究是以双向电泳为主要手段，其原理是双向电泳(Two Dimensional Electrophoresis, 2DE)的第一向电泳是等点聚焦电泳(Iso—Electric Focusing, IEF)，然后通过十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)对蛋白质进行第二向电泳；在IEF中，蛋白质因等电点不同而被分离，在SDS-PAGE中，不同分子量的蛋白质被分开，再用考马斯亮兰或银染进行检测，经过软件对结果进行比对和解[1 ；2 ；3]。由于蛋白质的等电点和分子量是两个彼此不相关的重要特性，而2DE利用了这两个特性来分离蛋白质，因此2DE的分离特性非常强大，它甚至能将细胞中的5000种蛋白质分离开。2DE 在分离蛋白混合样品，比较差异方面有着不可替代的作用W]。2D-DIGE技术适合用于差异蛋白质表达谱的分析，这种技术只需要一块胶就可以检测两组蛋白样品之间的差异表达蛋白。其原理是分别利用荧光染料Cy3和Cy5标记这两组蛋白样品，同时用另一种荧光标记由这两组蛋白样品等量混合的样品记为内参，然后把这三组样品同时上样进行双向电泳。因此，2D-DIGE技术较普通双向电泳具有更高的灵敏度和重复性[5 ；6]。蛋白质组的鉴定技术是蛋白质组学技术的支柱。质谱是对分离的蛋白质进行鉴定的一种重要方法，也是蛋白质组研究中最关键的一步。质谱技术是目前在鉴定蛋白质的多种方法中发展最快、最具潜力的技术，具有高灵敏度、高准确度、自动化等特点[7]。利用质谱进行蛋白质鉴定主要有2种方法(1)肽质量指纹谱(P印tide mass fingerprint, PMF) 法是在经过蛋白质分离后(如利用2DE技术分离蛋白质)，将蛋白质分离，用特定的酶进行酶切，获得肽段混合物，而后进入质谱进行肽段质量的测定，从而获得该蛋白质各切割肽段的质量，通过这些质量搜索已有的数据库，得以进一步识别出该蛋白质。( 串联质谱 (Tandem mass spectrum)法是在蛋白质酶解后，对酶解肽段进一步裂解，并对其裂解产物进行质谱检测，最后利用这些测定的质量反推肽段的氨基酸序列[8]。

发明内容
本发明的目的在于提供一种筛选与猪产仔数相关候选基因的方法，用以克服现有技术筛选效率不高的问题。为实现上述目的，本发明筛选与猪产仔数相关候选基因的方法是通过差显技术比较梅山猪与野猪(Sus Scrofa)卵巢之间蛋白表达的差异，并由此确定候选基因。由于卵巢是卵泡发生和卵子成熟的场所，卵巢在控制排卵数和卵子质量上具有很重要的作用，因此卵巢的功能也与产仔数存在着密切的联系。利用家畜和野生种在产仔数上的巨大差异，可以通过蛋白质组学手段来确定这两种卵巢中表达的蛋白，从而能够快速而准确地筛选影响产仔数的基因。在本发明实施例中，采用梅山猪和野猪(Sus krofa)，作为研究对象，从中筛选得到多种与产仔相关的候选基因。
上述差显技术可以是双向荧光差异凝胶电泳-质谱联用技术(MALDI-T0F-MS)，也可以是通过mRNA差异显示来考察上述两者的差异，但对蛋白的考察则更加直接有效。具体地，本发明方法包括如下步骤1)利用2D-DIGE寻找差异蛋白a、分别将梅山猪卵巢组织和野猪卵巢组织用PBS清洗后，加入DIGE裂解液并勻浆，超声破碎细胞，离心取上清，得到蛋白样品；b、用不同荧光染料分子分别标记梅山猪卵巢蛋白样品和野猪卵巢蛋白样品，进行双向电泳，用荧光扫描仪获得2D-DIGE图像，并基于此获得差异蛋白质点；2)差异蛋白点的质谱鉴定将步骤l)a得到的蛋白样品分别进行双向电泳，考马斯亮蓝染色，并切下差异蛋白质点，进行质谱分析。更具体地，本发明方法包括如下步骤1)利用2D-DIGE寻找差异蛋白a、分别将梅山猪卵巢组织和野猪卵巢组织300mg在冰上剪切成3mm见方的小块， 用PBS洗3遍，加入Iml含酶抑制剂的DIGE裂解液，勻浆；转入离心管中，超声破碎细胞， 12，OOOg离心45分钟，得上清蛋白样品；b、取各蛋白样品50μ g，分别标记400pmol的不同染料分子，并进行双向电泳，电泳条件为PH值3-10NL，12. 5% SDS-PAGE,用荧光扫描仪获得2D-DIGE图像，并基于此获得差异蛋白质点；2)取步骤l)a得到的蛋白样品Img分别进行双向电泳，电泳条件为pH值 3-10NL,12.5% SDS-PAGE，然后进行考马斯亮蓝染色，并切下差异蛋白质点，胶内酶解， MALDI-TOF-MS 分析结果。在分析时，可以结合梅山猪与野猪的杂交后代进行分析。此外，在荧光双向电泳前，还可以通过预实验(等电聚焦凝胶电泳)来查看双向电泳的可行性。另外，还可以预先测试样品的标记可行性。本发明提供了能够高效筛选与家畜产仔数相关候选基因的方法，本发明实施例利用该方法鉴定了一些猪产仔数相关的候选基因。本发明方法对克隆控制家畜高产仔性状的优质基因提供了一个方法借鉴。在利用转基因技术培育高产仔数家畜上具有很重要的参考价值。本发明与现有技术相比具有以下优点和效果1、能快速和有效地筛选到与产仔数相关联的候选基因；2、本发明很好地利用了我国特有高产猪种梅山猪和低产猪种野猪并且运用 2D-DIGE这一高通量、准确的蛋白质组学研究手段来研究与猪性状相关的候选基因；3、可以广泛应用于经济动物的研究和开发并且结合转基因猪的技术来培育高产仔数的新品种猪。


图1是猪卵巢蛋白的双向电泳银染的结果图，Al C2分别是Al C2六个样本；图2是荧光染料分子标记的猪卵巢蛋白电泳图，图中9个泳道是随机选的3个样品用荧光染料Cy2、Cy5和Cy3进行标记，然后以4 2 1上样进行SDS-PAGE ；图3猪卵巢蛋白的2D-DIGE图像之一；图4是差异蛋白在不同猪种中表达量的总体趋势图；图5是差异表达蛋白的GO分类图；图6显示的是半定量PCR验证差异表达蛋白的结果；图7显示的是Wfestern Blot验证差异表达蛋白的结果。
具体实施例方式以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。实施例1猪产仔数相关候选基因的筛选一、利用2D-DIGE技术分析梅山猪与野猪以及这两种猪的杂交猪的卵巢的差异蛋白取2头梅山猪的卵巢，标记为A1、A2 ；2头野猪(Sus Scrofa)和梅山猪杂交而来的杂种猪的卵巢，标记为B1、B2 ；2头湖北野猪的卵巢，标记为C1、C2。样品采集后马上冻于液氮中，用于后续试验部分。以上卵巢均取自华盖养殖厂。各取300mg的组织在冰上剪切成3mm见方的小块，用PBS洗3遍，加入DIGE裂解液(DIGE裂解液和蛋白酶抑制剂以体积比50 1混合，7M Urea, 2M Thiourea, 4% CHAPS, 罗氏cooktail蛋白酶抑制剂)lml，用Dounce’ s勻浆器勻浆。转入离心管中，超声破碎细胞(80W, 5次，每次10秒，间隔15秒，冰上完成)。离心，12，OOOg, 45分钟，上清用Bradford 法定量，分装成IOOyg—管，置于500 μ 1离心管中，低温保存(-80°C )。预备试验，每个样品上样100 μ g，IEF为pH3_10非线性胶条，Amersham公司产品 (电泳条件30v 12hrs,500v lhr, IOOOv lhr, 8000v8hrs, 500v 4hrs)，SDS-PAGE 为 12. 5% 的胶(15mA/胶30min，30mA/胶至溴酚蓝离胶下沿0.5cm)，然后银染。用于判断样品2D可行性。结果表明这些样品是可以用于双向电泳实验的(图1)。随后，取用每个组的样品50 μ g，标记400pmol的染料分子(cy2、cy3和cy5)，在 12. 5% SDS-PAGE凝胶上进行梯度上样(1 2 4)，测试样品的标记可行性。(标记3个样品，每个组随机选1个样品)，结果表明随机选的这3个样品是可以用染料进行标记的(图 2)。以上的预实验部分说明猪卵巢的蛋白抽提是成功的，能够用于后面的2D-DIGE 分析。然后按照表1标记样品(每50yg样品标记400pmol的染料分子，pH值3-10NL， 12. 5% SDS-PAGE分析，内标为三个组等量混合物，每块凝胶上样也是50 μ g)，随后进行双向电泳(电泳条件30v 12hrs,500v lhr, IOOOv lhr,8000v 8hrs,500v 4hrs), SDS-PAGE 为12. 5%的胶(15mA/胶30min，30mA/胶至溴酚蓝离胶下沿0. 5cm)。注意始终要避光。表1 :DIGE上样表格
最后，使用Typhoon扫描仪，分别用三种不同的波长488nm (Cy2), 532nm (Cy3)， 633nm(Cy5)扫描，获得图谱。图3为扫描得出的一个典型的2D-DIGE图像。最后，利用Decyder 2D软件进行One-way ANOVA分析，进行两两之间的比较，得到符合统计学标准的差异蛋白质点。利用1.5倍作为阀值，得到了 109个差异点。其中60个蛋白点在杂交猪中表达量最高，这其中包括26个蛋白点的表达量在梅山猪中比野猪表达量高；34个蛋白点在家猪中表达量最高；15个蛋白点在野猪中表达量最高。图4显示了差异蛋白在不同猪种中表达量的总体趋势。 二、差异蛋白点的质谱鉴定考虑到梅山猪和野猪的产仔数上的巨大差异，本发明主要选取了在梅山猪和野猪卵巢中的表达上有差异或者在杂交猪中存在非常明显差异的60个蛋白点进行了质谱分析。取各组样品Img左右，随后进行双向电泳(电泳条件pH值3-10NL，30v 12hrs,500v lhr, 1000vlhr,8000v 8hrs,500v 4hrs), SDS-PAGE 为 12. 5% 的胶(15mA/胶 30min，30mA/ 胶至溴酚蓝离胶下沿0. 5cm)，考马斯亮蓝染色法，切下差异点，做胶内酶解，MALDI-T0F-MS 分析结果。通过质谱鉴定，本发明得到了 38个单一的蛋白。其中19个在家猪卵巢中表达量高于野猪。表2列出了这详细的19个蛋白的NCBI数据库的序列号、名称、等电点、以及其
分子量。在本发明鉴定的蛋白中，有许多调节细胞骨架的蛋白在梅山猪和野猪卵巢中差异表达，例如Vimentin和CapZ beta。细胞骨架在调节细胞形态、细胞生长和细胞周期上具有很重要的功能[9]。细胞骨架在卵子发生过程中发挥着极其重要的作用。细胞骨架一系列高度协调的运动对于产生成熟卵泡是必不可少的[10]。此外，在卵子发生的过程中，细胞骨架发生着剧烈的变化[11]。本研究鉴定Vimentin及Vimentin的异构体在梅山猪卵巢中是高表达的。Vimentin是一个很重要的调节卵巢功能的蛋白，在卵子发生过程中，由 Vimentin构成的中间纤维能够重新分布线粒体，线粒体在卵泡的优势化过程中具有非常重要的作用[12]。因此，Vimentin在卵子发生过程中具有非常重要的作用，其表达量也与产仔数相关。表2 :19个在家猪卵巢中表达高于野猪卵巢的蛋白质。
7序列号蛋A名称生物学功能等电点分子量(Da)gi|47523308Heat shock 70 kDa protein IB (HSP70.2)protein refolding5.670098热休克蛋 70蛋0质折Sgi|156120803hypothetical protein T,OC5233229.7872548假设蛋白LOC523322gi|54873401heat shock 60 kDa protein 1'de novo' protein folding8.2160924热休克蛋白60新合成蛋白质折叠gi|149692011protein disulfide isomerase family A, memberprotein disulfide isomerase activity5.97568603, isofoim 2蚩白质二硫键异构酶活性蛋白质二硫键异构酶A3gi|76097691Vnnentinintermediate filament-based process4.7753670波形蛋白中间纤维细胞骨架的功能gl|46I74420prolyl 4-hydroxylase, beta subunit precursorprotein metabolic process4.4957102脑4-羟化酶，β亚基蛋0质的代谢过程gi|73948960similar to Vimcntin isoform 3intermediate filamcnt-bascd proccss4.7753670波形蛋白异构体3中间纤维细胞骨架的功能gi|32967591Phosducin (PHD) (33 kDa phototraiisducingphospholipase inhibitor activity4.7528115protein)瞵脂酶抑制活性光传感因子gi|45269029cytoskeletal beta actinstructural constituent of5.2941736肌动蚩白c ν Io skeleton细胞骨架的结构组成gi|73964667PREDICTED hypothetical protein5.2942053XP533132假设蛋白ΧΡ_533 Π2gi|8097150440S ribosomal protein SA (37 kDa laminintranslational elongation4.832928rcccptor)翻译延伸40S核糖体蛋白SAgi|l 16175259heterogeneous nuclear ribonucleoprotein AlRNA binding9.2734196核不均一性核糖核蛋白AlRNA结合gi|89574151mitochondrial malate dehydrogenase 2, NADoxidoreductase activity8.3833000苹果酸脱氢酶氧化还原酶活性gi|134035396F-aclin-capping protein subunit beta (CapZaclin cytoskeleton organization5.4731315beta)肌动蛋白细胞骨架组织丝状I动蛋白成帽蛋白Pgi|75050405Voltage-dependent anion-selective channelanion transport7.531592protein 2阴离子转运电压依赖性阴离子通道蛋0 2
gi|47116966Translationally-controlled tumor proteinregulation of apoptosis4.8419595(TCTP)受翻译调节的肿瘤蛋白调控细胞凋亡及分化gi| 119888643PREDICTED: hypothetical protein10.0313942假设蛋白伊|_1198路643gi|73954721similar to transgelin isoform 2actin binding8.8722609转凝蛋白异构体2肌动蛋Η细胞骨架调节gi|47716872galectin-1signal transducer activity5.0714932半乳糖凝集素1信号转导
三、差异表达蛋白的GO分类质谱鉴定的差异蛋白相对应于人的基因编号在NCBI中找出用于GO分析。利用 MANGO-GO注释工具进行功能分类。图5显示这些蛋白在细胞内具有许多功能，如蛋白结合， 催化功能以及细胞骨架等。并且有些蛋白可以划分到多个功能域中。四、差异表达蛋白的RT-PCR和Wfestern Blot验证为了初步验证2D-DIGE-MS筛选出的差异蛋白的可靠性，本发明进行了初步的半定量PCR验证，其结果如图6，基本上与质谱的结果相符合。随后本发明选取了几个蛋白进行了 Western Blot验证，其结果如图7，说明2D-DIGE-MS筛选家猪与野猪以及杂交猪卵巢的差异表达蛋白是可行的。其结果是可信的。参考文献[1] R. Aebersold, M. Mann, Mass spectrometry-based proteomics. Nature 422(2003) 198-207.[2]A. Gorg, C. Obermaier, G. Boguth, A. Harder, B. Scheibe, R. Wildgruber, W. Weiss, The current state of two-dimensional electrophoresis with immobilized pH gradients.Electrophoresis 21(2000)1037-1053.[3]A. Gorg, W. Postel, S. Gunther, The current state of two-dimensional electrophoresis with immobilized pH gradients.Electrophoresis 9 (1988)531-546.[4]A. Gorg, W. Weiss, M. J. Dunn, Current two-dimensional electrophoresis technology for proteomics. Proteomics 4(2004)3665-3685.[5] J. S. Minden, S. R. Dowd, H. E. Meyer, K. Stuhler, Difference gel electrophoresis. Electrophoresis 30 Suppl 1 (2009)S156-161.[6]M. Unlu, Μ. E Morgan, J. S. Minden, Difference gel electrophoresis :a single gel method for detecting changes in protein extracts. Electrophoresis 18(1997)2071-2077.[7]T. C. ffalther, M. Mann, Mass spectrome try-based proteomics in cell biology. J Cell Biol 190(2010)491-500.[8]K.Gevaert, J.Vandekerckhove, Protein identification methods in proteomics. Electrophoresis 21 (2000) 1145-1154.[9]W. Zou, J. Ke, A. Zhang, M. Zhou, Y. Liao, J. Zhu, H. Zhou, J. Tu, H. Chen, M. Jin, Proteomics analysis of differential expression of chicken brain tissue proteins in response to the neurovirulent H5Nlavian influenza virus infection. J Proteome Res 9(2010)3789-3798.[ 10] C. C. Wy 1 i e , D. Brown, S. F. Godsave , J. Quarmby, J. Heas man, The cytoskeleton of Xenopus oocytes and its role in development. JEmbryol Exp Morphol 89 Suppl(1985) 1-15.[11]S. M.McPherson, H. E, Dynamics of the oocyte cortical cytoskeleton during oogenesis in Rhodnius prolixus.Tissue Cell 25 (1993)399-421.[12]L. Cooley, W. E. Theurkauf, Cytoskeletal functions during Drosophila oogenesis. Science 266(1994)590-596.
权利要求
1.筛选与猪产仔数相关候选基因的方法，该方法是通过差显技术比较梅山猪与野猪 (.Sus Scrofa)卵巢之间蛋白表达的差异，并由此确定候选基因。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述差显技术为双向荧光差异凝胶电泳-质谱联用技术。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤1)利用2D-DIGE寻找差异蛋白a、分别将梅山猪卵巢组织和野猪卵巢组织用PBS清洗后，加入DIGE裂解液并勻浆，超声破碎细胞，离心取上清，得到蛋白样品；b、用不同荧光染料分子分别标记梅山猪卵巢蛋白样品和野猪卵巢蛋白样品，进行双向电泳，用荧光扫描仪获得2D-DIGE图像，并基于此获得差异蛋白质点；2)差异蛋白点的质谱鉴定将步骤1) a得到的蛋白样品分别进行双向电泳，考马斯亮蓝染色，并切下差异蛋白质点，进行质谱分析。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤1)利用2D-DIGE寻找差异蛋白a、分别将梅山猪卵巢组织和野猪卵巢组织300mg在冰上剪切成3mm见方的小块，用PBS 洗3遍，加入Iml含酶抑制剂的DIGE裂解液，勻浆；转入离心管中，超声破碎细胞，12，OOOg 离心45分钟，得上清蛋白样品；b、取各蛋白样品50μ g，分别标记400pmol的不同染料分子，并进行双向电泳，电泳条件为PH值3-10 NL, 12. 5%SDS_PAGE，用荧光扫描仪获得2D-DIGE图像，并基于此获得差异蛋白质点；2)取步骤1)a得到的蛋白样品Img分别进行双向电泳，电泳条件为pH值3-10 NL, 12. 5%SDS-PAGE，然后进行考马斯亮蓝染色，并切下差异蛋白质点，胶内酶解，MALDI-T0F-MS 分析结果。
5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于，用于分析的样本还包括梅山猪与野猪的杂交后代。
全文摘要
本发明涉及一种应用蛋白质组学技术筛选猪产仔数相关候选基因的方法。本发明公开了一种筛选与猪产仔数相关候选基因的方法，该方法利用中国特有的高产猪种梅山猪以及产仔数低的中国野猪，通过差显技术从它们卵巢中寻找差异蛋白，特别是在梅山猪卵巢中高表达的基因，以期快速而大规模的鉴定与产仔数相关联的基因。这种方法与以往的筛选候选基因具有快速，准确，并且可以与转基因动物技术相结合为我国转基因新品种培育和产业化提供原动力。
文档编号G01N33/68GK102229977SQ20111011897
公开日2011年11月2日 申请日期2011年5月10日 优先权日2011年5月10日
发明者周荣家, 程汉华, 陈科 申请人:武汉大学