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专利名称：一种梅花茎尖染色体制片方法
技术领域：
本发明涉及植物染色体制片方法，具体涉及梅花茎尖染色体制片方法。
背景技术：
梅花(Primus mume Sieb. et Zucc.)是重要的观赏花木，其遗传育种方面的研究发展迅速。然而由于梅花染色体小，其染色体层面的研究极其局限。经过现有文献记载，梅的染色体数目据国外Okabe (1927，1929)报道是2n = 16， Μ。Oginuma等(1987,1989)发表是2n = 16。在国内，主要是黄哲(1989)首次对梅花的染色体进行了研究；黄燕文，包满珠等(19%)对野梅、果梅和花梅染色体的数目及形态进行了研究；林盛华、褚孟嫄(1999)对梅花染色体进行了研究，鉴定梅品种资源的倍数性，为梅分类起源和遗传育种提供细胞学依据。他们所采用的主要是涂片法和压片法，其技术体系中存在一些问题各个处理时间不确定，制片技术耗时等；同时，取材受限于早春梅花发叶之前，取材时间短，时间受限。另外，染色压片技术所制的的染色体标本，尤其是卡宝染色，一方面由于染色，破坏了染色体结构，无法进行更高层次的荧光原位杂交实验，另一方面，在实验初期的低温掀片过程中，会损失大量分裂相，不利于实验的进行。因此，只能用于常规观察及初步核型分析，无法通过荧光原位杂交进行精确核型分析。

发明内容
本发明提供一种梅花茎尖染色体制片方法。本发明提供的梅花生长点染色体制片方法，其为选取梅花一年生枝条顶端生长点或经修剪后新发出的顶端生长点最内侧的长度为0. 5 1. Ocm的部分，依次进行卡诺固定液固定、前低渗处理、纤维素酶和果胶酶的酶解、后低渗处理，将处理后的顶端生长点进行火焰干燥法制片。其中，所述的所述的火焰干燥法制片包括如下步骤切取茎尖基部，解剖针捣碎， 平摊于载玻片上，用镊子剔除杂质，滴卡诺固定液，载玻片置于酒精灯火焰上方，待载玻片上卡诺固定液燃烧，移开载玻片，直至载玻片干燥。其中，取材时间优选为上午9:00 11:00。其中，前低渗处理溶液优选为0. 075mol/L的KCl，处理时间优选为30min。其中，用纤维素酶和果胶酶的酶溶液常温酶解Ih 池，其中，所述酶溶液中，纤维素酶的浓度为2. 0 2. 5 %，果胶酶的浓度为2. 0 2. 5%。其中，用ddH20进行后低渗处理，处理时间30min。本发明采用火焰法制片，省去预处理过程，直接固定，提高制片效率，拉长了染色体长度。此外，更重要的是解决了取材受限于早春的问题。本发明通过早春修剪梅花枝条， 获得生长旺盛的生长点，用于制片。本发明还明确了各个处理环节的时间控制，找到了最佳的梅花染色体制片技术。克服了以往的梅花染色体制片技术在处理时间过于笼统，操作性不强的问题。同时，火焰干燥法没有染色和压片过程，这样在荧光原位杂交过程中避免了染色体结构遭到破坏，并免去了低温掀盖玻片过程，能够完好保存所有分裂相，保证良好的分裂相用于后期杂交实验。


图 1图 2图 3图 4
‘黄绿萼’ 一年生枝条生长点40倍镜检(火焰干燥法)。 ‘扣子玉蝶’ 一年生枝条生长点40倍镜检(火焰干燥法)。 ‘扣子玉蝶’ 一年生枝条生长点，100倍油镜镜检(压片法)。 ‘黄绿萼’ 一年生枝条生长点100倍油镜镜检(压片法)。
具体实施例方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例1梅花品种(‘黄绿萼’)，于早上9:00，取一年生植株顶端生长点。直接使用卡诺固定液，低温4°C固定20h ；固定后，用蒸馏水润洗，吸水纸吸干，转移至0. O75mol/LKC1溶液中，进行前低渗30min;将前低渗处理后的顶端生长点用蒸馏水润洗，吸水纸吸干，再用纤维素酶和果胶酶的酶溶液(纤维素酶0. 25g，果胶酶0. 25g，蒸馏水IOg)进行酶解lh50min ； 酶解后，用蒸馏水润洗，吸水纸吸干，使用ddH20进行后低渗，低渗时间为30min ；切取茎尖基部，解剖针捣碎，平摊于载玻片上，将杂质用镊子剔除，滴固定液，于酒精灯上烤片。后在光学显微镜下观察。镜检效果在40倍显微镜的情况下，有20%的细胞分裂相，染色体清晰可见，可以计数，长度适宜，这些细胞位置分布较为均勻。经计数，梅花染色体2n = 16(图1)。实施例2梅花品种(‘扣子玉蝶’)，于早上11:00，取修剪后发出的新梢的顶端生长点。直接使用卡诺固定液，低温4°C固定20h ；固定后，用蒸馏水润洗，吸水纸吸干，转移至0. 075mol/ LKCl溶液中，进行前低渗30min ；将前低渗处理后的顶端生长点用蒸馏水润洗，吸水纸吸干，再用纤维素酶和果胶酶的酶溶液(纤维素酶0. 25g，果胶酶0. 25g，蒸馏水IOg)进行酶解lh50min;酶解后，用蒸馏水润洗，吸水纸吸干，使用ddH20进行后低渗，低渗时间为 30min ；切取茎尖基部，解剖针捣碎，平摊于载玻片上，将杂质用镊子剔除，滴固定液，于酒精灯上烤片。后在光学显微镜下观察。镜检效果在40倍显微镜的情况下，有20%的细胞分裂相，染色体清晰可见，可以计数，长度适宜，这些细胞位置分布较为均勻。经计数，梅花染色体2n = 16(图2)。比较例1梅花品种(‘黄绿萼’)，一年生植株顶端生长点，于早上9:00取材。使用饱和对二氯苯暗处理池；用蒸馏水润洗，吸水纸吸干，转移至卡诺固定液，低温4°C固定20h;固定后，用蒸馏水润洗，吸水纸吸干，转移至0. O75mol/LKC1溶液中，进行前低渗30min ；将前低渗处理后的顶端生长点用蒸馏水润洗，吸水纸吸干，再用纤维素酶和果胶酶的酶溶液(纤维素酶0. 25g，果胶酶0. 25g，蒸馏水IOg)进行酶解lh50min ；酶解后，用蒸馏水润洗，吸水纸吸干，使用lmol/L盐酸，于60°C恒温水浴lOmin，进行解离；解离后，用蒸馏水润洗，吸水纸吸干，使用ddH20进行后低渗，低渗时间为30min ；卡宝品红溶液染色IOmin ；切取茎尖基部，解剖针捣碎，平摊于载玻片上，平摊面积尽量大，降低细胞重叠性，压片后在光学显微镜下观察。镜检效果在100倍显微镜的情况下，有50%的细胞分裂相，染色体分散良好，便于计数，长度适宜，这些细胞位置分布较为均勻。经计数，梅花染色体2η = 16 (图3)。比较例2梅花品种(‘扣子玉蝶’)，一年生植株顶端生长点，于早上9:00取材。使用饱和对二氯苯暗处理池；用蒸馏水润洗，吸水纸吸干，转移至卡诺固定液，低温4°c固定20h ；固定后，用蒸馏水润洗，吸水纸吸干，转移至0. O75mol/LKC1溶液中，进行前低渗30min ；将前低渗处理后的顶端生长点用蒸馏水润洗，吸水纸吸干，再用纤维素酶和果胶酶的酶溶液(纤维素酶0. 25g，果胶酶0. 25g，蒸馏水IOg)进行酶解lh50min ；酶解后，用蒸馏水润洗，吸水纸吸干，使用lmol/L盐酸，于60°C恒温水浴lOmin，进行解离；解离后，用蒸馏水润洗，吸水纸吸干，使用ddH20进行后低渗，低渗时间为30min ；卡宝品红溶液染色IOmin ；切取茎尖基部，解剖针捣碎，平摊于载玻片上，平摊面积尽量大，降低细胞重叠性，压片后在光学显微镜下观察。镜检效果在100倍显微镜的情况下，有40%的细胞分裂相，染色体分散好，便于计数，长度适宜，这些细胞位置分布较为均勻。经计数，梅花染色体2n = 16(图4)。使用染色压片法进行染色体制片，所得分裂相清晰，能够满足传统核型分析软件的要求。但对于精确核型分析，无法使用染色压片标本进行荧光原位杂交实验。而火焰法无染色及压片过程，能够较好的满足荧光原位杂交实验要求，不破坏染色体结构，不损失良好分裂相。同时，省去预处理、解离过程，使实验效率大大提高，并能得出与染色压片法相同效果的细胞分裂相。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
权利要求
1.一种梅花生长点染色体制片方法，其为选取梅花一年生枝条顶端生长点或经修剪后新发出的顶端生长点最内侧的长度为0. 5 1. Ocm的部分，依次进行卡诺固定液固定、前低渗处理、纤维素酶和果胶酶的酶解、后低渗处理，将处理后的顶端生长点进行火焰干燥法制片。
2.根据权利要求1所述的制片方法，其特征在于，所述的火焰干燥法制片包括如下步骤切取顶端生长点基部，解剖针捣碎，平摊于载玻片上，用镊子剔除杂质，滴卡诺固定液， 将载玻片置于酒精灯火焰上方，待载玻片上卡诺固定液燃烧，移开载玻片，直至载玻片干O
3.根据权利要求1所述的制片方法，其特征在于，其中取材时间为上午9:00 11:00。
4.根据权利要求1所述的制片方法，其特征在于，前低渗处理溶液为0.075mol/L的 KCl，处理时间为30min。
5.根据权利要求1所述的制片方法，其特征在于，其中用纤维素酶和果胶酶的酶溶液常温酶解Ih 2h，其中，所述酶溶液中，纤维素酶的浓度为2. 0 2. 5%，果胶酶的浓度为 2. 0 2. 5%。
6.根据权利要求1所述的制片方法，其特征在于，用ddH20进行后低渗处理，处理时间 30mino
全文摘要
本发明公开了一种梅花生长点染色体制片方法，其为选取梅花一年生枝条顶端生长点或经修剪后新发出的顶端生长点最内侧的长度为0.5～1.0cm的部分，依次进行卡诺固定液固定、前低渗处理、纤维素酶和果胶酶的酶解、后低渗处理，将处理后的顶端生长点进行火焰干燥法制片。本发明采用火焰法制片，省去预处理、解离、染色压片过程，直接固定，提高制片效率，拉长了染色体长度。此外，更重要的是，所得制片能够用于荧光原位杂交实验，同时解决了取材受限于早春的问题。
文档编号G01N1/28GK102564821SQ20111040692
公开日2012年7月11日 申请日期2011年12月8日 优先权日2011年12月8日
发明者张启翔, 杨冰洁, 罗乐, 陈晶鑫 申请人:北京林业大学