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专利名称：基于核酸适配体探针的一步法非标记型双酚a的快速比色检测法的制作方法
技术领域：
本发明属于食品安全、检验检疫、环境检测技术领域，具体涉及非标记型双酚A的非标记型、一歩比色检测法。
背景技术：
随着社会的发展和经济全球化的进ー步深入，不断增长的新兴产品对检验检疫提出新的挑战。依靠传统仪器检测虽然具有检测灵敏度高，检测结果稳定性好等优点，但是大型仪器通常价格较为昂贵，并且需要具备相关知识的专业操作人员，同时存在检测成本高昂等缺点，限制了大型仪器的大規模检测和现场快速检测。基于免疫分析的酶联免疫吸附法可以解决大型仪器的检测成本高和不能够用于现场检测的缺点，但由于酶联免疫吸附法在检测过程中需要多步的反复洗涤和分离的过程，以及需要具有一定专业知识的人进行操作，一定程度上也限制了该方法的广泛推广使用。基于金纳米粒子核酸适配体探针的检测方法的推广和使用，将是应对大規模样品高通量、快速检测的有效方法，且基于金納米粒子探针的相关检测方法的使用不需要操作人员具有较深的专业知识背景即可使用，如用于早期怀孕诊断的早孕试纸条。金納米粒子探针已经广泛应用于各种有害物质的检测并取得了丰硕的成果。如正在飞速发展的金标试纸条检测技术就具有检测灵敏度高，检测时间短，不需要大型仪器，使用肉眼即可判别等特点。本发明针对传统大型仪器检测方法不能够实现现场、高通量、快速检测的缺点，利用金納米粒子和核酸适配体制备金纳米粒子核酸适配体复合物探针，用于食品包装材料以及水资源污染中双酚A的快速、现场、超灵敏检測。

发明内容
本发明描述了使用一段可特异性识别双酚A的单链核酸适配体探针与金納米粒子结合形成金納米粒子-核酸适配体复合探针，在有双酚A存在的情况下，核酸适配体探针与双酚A特异性结合，从而引起核酸适配体脱离金纳米粒子表面，使得金納米粒子对盐的耐受能力降低从而出现金纳米粒子聚沉出现蓝色的现象，实现对双酚A的超灵敏快速检測。本发明具体的技术方案如下
基于核酸适配体探针的一歩法非标记型双酚A (bisphenol A, BPA)的快速比色检测法，以单链核酸适配体为双酚A的识别探针，使用金納米粒子，在没有单链核酸适配体探针保护的条件下会由于高盐浓度引起金納米粒子的聚沉；当所述金纳米粒子上有可以特异性识别双酚A的核酸适配体探针保护的条件下，不会被相同浓度的盐溶液引起金納米粒子的聚沉；在有双酚A核酸适配体探针保护的金纳米粒子溶液中，加入不同浓度的双酚A溶液后，双酚A与能识别双酚A的核酸适配体探针特异性结合，引起金納米粒子表面核酸适配体探针的脱落，从而重新引起金納米粒子的聚沉淀现象；不同浓度的双酚A溶液引起金納米粒子聚沉的程度不同，根据金纳米粒子聚沉引起其溶液变色程度的不同，实现双酚A的快速、现场、ー步法检测。基于核酸适配体探针的一歩法非标记型双酚A的快速比色检测法的具体检测操作步骤如下
(1)金納米粒子核酸适配体探针复合物的制备
将浓度为O. lg/L、粒径为25 nm的金纳米粒子溶液,在转速10000 rpm/条件下,离心10分钟，浓缩至原体积的1/4 ;分装到6 10只离心管中，每管装25μ ;在每管中分别加入ΙΟμ 浓度为O. 25Mfliol/L的特异性识别双酚A的单链核酸适配体探针得到金納米粒子核酸适配体探针复合物溶液，室温下孵育Ih ；
所述特异性识别双酚A的单链核酸适配体探针的碱基序列为5’-CCG GTG GGT GGTCAG GTG GGA TAG CGT TCC GCG TAT GGC CCA GCG CAT CAC GGG TTC GCA CCA-3’ ；
(2)双酚A的检测
在装有金纳米粒子核酸适配体探针复合物溶液的7只离心管中分别加入浓度为20、30、40、50、60、70、80mmol/L的双酚A溶液，另ー只装有金纳米粒子核酸适配体探针复合物溶液的离心管中不加入双酚A溶液作为空白对照管，孵育IOmin ;在上述8只离心管中再分别加入适量浓度的氯化钠溶液，一方面通过肉眼观察8只离心管中溶液的聚沉情况和颜色变化，通过与空白对照管的比较，如颜色发生明显的区别于空白对照管的蓝色，说明含有双酚A，从而实现双酚A (BPA)的快速、定性检测；
另ー方面用紫外-可见风光光度计测定上述8只离心管中溶液在190 SOOnm处的紫外-可见吸收光谱，建立紫外吸收峰强度与目标双酚A浓度之间的线性关系，确定双酚A快速检测的标准曲线，实现双酹A的超灵敏定量检测。本发明的有益技术效果体现在以下方面
1、本发明利用可特异性识别双酚A的核酸适配体探针与金納米粒子非特异性结合，得到核酸适配体-金納米粒子复合物探针，保护金纳米粒子溶液耐受一定浓度的盐溶液而不发生聚沉现象。而在双酚A存在的条件下，核酸适配体探针与双酚A特异性结合，引起双酚A核酸适配体从金纳米粒子表面脱落，使得金納米粒子失去耐盐能力而聚集，从而建立了双酚A的一歩法、非标记型快速、超灵敏、现场比色检测法，通过肉眼观察金納米粒子溶液的颜色变化，定性分析检测体系中是否存在目标检测物双酚A ;通过建立反应后金納米粒子溶液的紫外-可见吸光光度值，建立吸光光度值与双酚A浓度之间的线性关系，实现定量检测目标物双酚A的浓度，整个检测工作可在10分钟内完成并得到检测结果；
2、本发明为通用型检测方法，只需要将与金納米粒子非特异性结合的核酸适配体探针的序列进行相应的改变和替换，即可实现其他目标物的快速、现场检测；
3、本发明还具有特异性高，稳定性好，应用范围广，成本低廉，操作使用方法简单易于推广应用。可应用于医院、家庭、以及食品安全与检验检疫的海关、机场、ロ岸等需要现场快速检测机构。


图1为ー步法非标记型双酚A检测結果。图2为ー步法非标记型双酚A检测标准曲线。
具体实施例方式下面结合实施例，对本发明作进ー步地描述。所用原料核酸适配体探针为上海生物工程有限公司合成，BPA标准品为美国Sigma公司订购,金纳米粒子溶液为实验室合成。实施例I
基于核酸适配体探针的一歩法非标记型双酚A (bisphenol A, BPA)的快速比色检测法的具体操作步骤如下
(I)检测体系最佳盐浓度的选择
取浓度为O. lg/L、粒径为25 nm的金纳米粒子溶液,转速10000 rpm/条件下,离心10 分钟，浓缩至原体积的1/4，分装至A、B两组离心管中，每组8只管，每管装25μ ，得到A组浓缩的金纳米粒子溶液和B组浓缩的金纳米粒子溶液；
将IOPL浓度为O. 25Mfliol/L的特异性识别双酚A的单链核酸适配体探针分别加入上述B组浓缩的金纳米粒子溶液中，孵育lh，得到加入核酸适配体探针的B组浓缩的金纳米粒子溶液；
所述特异性识别双酚A的单链核酸适配体探针的氨基酸序列为5’-CCG GTG GGT GGTCAG GTG GGA TAG CGT TCC GCG TAT GGC CCA GCG CAT CAC GGG TTC GCA CCA-3’ ；
在A组浓缩的金纳米粒子溶液和加入核酸适配体探针的B组浓缩的金纳米粒子溶液中分别加入25PL不同浓度的氯化钠溶液，得到A组胶体金溶液和B组胶体金溶液，并使得A组胶体金溶液的最終的盐浓度和B组胶体金溶液的最終的氯化钠浓度分别为10、20、30、40、50、60、70、80mmol/L。根据A组胶体金溶液和B组胶体金溶液的聚沉情況，选择能引起A组胶体金溶液中金納米粒子聚集而不能引起B组胶体金溶液中金納米粒子聚集的盐浓度为最佳盐浓度，经目测比对颜色变化，选择30mmol/L为最佳盐浓度。在30mmol/L时B组胶体金不聚集而A组胶体金聚集说明特异性识别双酚A的单链核酸适配体结合在了 B组胶体金的表面。(2)金納米粒子核酸适配体探针复合物的制备
取浓度为O. lg/L、粒径为25 nm的金纳米粒子溶液,转速10000 rpm/条件下,离心10分钟，浓缩至原体积的1/4，分装8只离心管中，每管装25μ ;在每管中分别加入ΙΟμ 浓度为O. 25Mfliol/L的特异性识别双酚A的单链核酸适配体探针得到金納米粒子核酸适配体探针复合物溶液，孵育Ih ；
所述特异性识别双酚A的单链核酸适配体的碱基序列为5’ -CCG GTG GGT GGT CAGGTG GGA TAG CGT TCC GCG TAT GGC CCA GCG CAT CAC GGG TTC GCA CCA-3’ ；
(3)双酚A的检测
在装有金纳米粒子核酸适配体探针复合物溶液的7只离心管中分别加入浓度为20、30、40、50、60、70、80mmol/L的双酚A溶液，另ー只装有金纳米粒子核酸适配体探针复合物溶液的离心管中不加入双酚A溶液作为空白对照管，孵育IOmin ;在8只离心管中再分别加入最佳盐浓度30mmol/L的氯化钠溶液，一方面通过肉眼观察7只离心管中溶液的聚沉情况和颜色变化，通过与空白对照管的比较，如颜色发生明显的区别于空白对照管的蓝色，说明含有双酚A，从而实现双酚A (BPA)的快速、定性检测，见图1 ;
另ー方面用紫外可见风光光度计测定上述8只离心管中溶液在190 SOOnm处的紫外-可见吸收光谱，建立紫外吸收峰强度与目标双酚A浓度之间的线性关系，确定双酚A快速检测的标准曲线，见图2，实现双酚A的超灵敏定量检测。
权利要求
1.基于核酸适配体探针的一步法非标记型双酚A(bisphenol A, BPA)的快速比色检测法，其特征在于以单链核酸适配体为双酚A的识别探针，使用金纳米粒子，在没有单链核酸适配体探针保护的条件下会由于高盐浓度引起金纳米粒子的聚沉；当所述金纳米粒子上有可以特异性识别双酚A的核酸适配体探针保护的条件下，不会被相同浓度的盐溶液引起金纳米粒子的聚沉；在有双酚A核酸适配体探针保护的金纳米粒子溶液中，加入不同浓度的双酚A溶液后，双酚A与能识别双酚A的核酸适配体探针特异性结合，引起金纳米粒子表面核酸适配体探针的脱落，从而重新引起金纳米粒子的聚沉淀现象；不同浓度的双酚A溶液引起金纳米粒子聚沉的程度不同，根据金纳米粒子聚沉引起其溶液变色程度的不同，实现双酚A的快速、现场、一步法检测。
2.根据权利要求I所述的基于核酸适配体探针的一步法非标记型双酚A的快速比色检测法，其特征在于具体检测操作步骤如下 (1)金纳米粒子核酸适配体探针复合物的制备 将浓度为0. lg/L、粒径为25 nm的金纳米粒子溶液,在转速10000 rpm/条件下,离心10分钟，浓缩至原体积的1/4 ;分装到6 10只离心管中，每管装25ML ;在每管中分别加入IOML浓度为0. 25Mfliol/L的特异性识别双酚A的单链核酸适配体探针得到金纳米粒子核酸适配体探针复合物溶液，室温下孵育Ih ； 所述特异性识别双酚A的单链核酸适配体探针的碱基序列为5’ -CCG GTG GGT GGTCAG GTG GGA TAG CGT TCC GCG TAT GGC CCA GCG CAT CAC GGG TTC GCA CCA-3’ ； (2)双酚A的检测 在装有金纳米粒子核酸适配体探针复合物溶液的7只离心管中分别加入浓度为20、30、40、50、60、70、80mmol/L的双酚A溶液，另一只装有金纳米粒子核酸适配体探针复合物溶液的离心管中不加入双酚A溶液作为空白对照管，孵育IOmin ;在上述8只离心管中再分别加入适量浓度的氯化钠溶液，一方面通过肉眼观察8只离心管中溶液的聚沉情况和颜色变化，通过与空白对照管的比较，如颜色发生明显的区别于空白对照管的蓝色，说明含有双酚A，从而实现双酚A (BPA)的快速、定性检测； 另一方面用紫外-可见风光光度计测定上述8只离心管中溶液在190 SOOnm处的紫外_可见吸收光谱，建立紫外吸收峰强度与目标双酚A浓度之间的线性关系，确定双酚A快速检测的标准曲线，实现双酹A的超灵敏定量检测。
全文摘要
本发明公开了一种基于核酸适配体探针的一步法、非标记型双酚A快速、超灵敏、现场比色检测方法。所述的检测方法的步骤如下(1)检测体系最佳盐浓度的确定；(2)金纳米粒子与核酸适配体探针的结合，制备核酸适配体-金纳米粒子复合物探针；(3)双酚A的检测。本发明可用于现场、快速、超灵敏检测，无需其他辅助仪器设备。检测工作可在10-15分钟内完成并得到定性和定量检测结果；本发明只需将保护金纳米粒子的核酸适配体探针的序列进行改变和替换，即可实现其他目标物的相应检测；本发明还具有特异性高，稳定性好，应用范围广，成本低廉等优点，易于推广常规应用。
文档编号G01N21/33GK102980888SQ201210549690
公开日2013年3月20日 申请日期2012年12月18日 优先权日2012年12月18日
发明者陈伟, 梅占龙, 薛峰, 吴晶晶, 蒋原, 郑磊 申请人:合肥工业大学