专利名称：一种测定微小生物呼吸作用的装置及其方法
技术领域：
本发明涉及对生物呼吸作用的研究与测定，尤其涉及对生物膜、沉积物或水体中 的微生物以及小型生物等研究的一种测定微小生物呼吸作用的装置及其方法。
背景技术：
地表水体氧气是维持生物，如鱼类，底栖动物等生存的基本条件，且是生物地球化 学循环中一个最重要的反应物。水生生物对水体氧气的利用是水体氧气消耗和有机质降解 的一个重要动力；生物的有氧呼吸作用对是指生物体在有氧的参与下，通过酶的催化作用， 将糖类等有机物彻底氧化分解，产生出二氧化碳和水，同时释放大量能量的过程。准确测定 水体生物对氧气的利用速率对理解地表水体以及沉积物-水界面处氧气动力变化是十分 重要的。生物的有氧呼吸作用，一般以单位时间内生物对氧气的消耗量来表示。测定生物 的呼吸作用，可以采用氧气电极或化学滴定的方法测定实验起始时氧气的含量和实验终止 时氧气的含量来进行；也可以采用氧气电极的方式测定实验过程中氧气的连续变化来进 行。随着氧电极的普及使用，生物的呼吸作用的测定，逐步倾向于使用氧气电极来测定氧气 含量。然而，目前的测定方法均难以胜任小体积生物氧气消耗量的测定。比如，叶生生物膜 或石生生物膜，其本身所含微生物生物量较少，较大体积的测定体系，难以敏感地反映生物 膜的呼吸作用。再如，对水蚯蚓或摇蚊幼体的呼吸作用测定时，大体积的测定体系同样难以 反映微小的氧气变化。因此，目前对微小生物呼吸作用的测定方法上，仍存在较大的空缺， 亟待一简单实用的方法予以弥补。
发明内容
本发明针对现有技术存在的不足，提供一种测定微小生物呼吸作用的微呼吸系 统，测定系统引入不消耗氧气的光学微电极，测定微小生物的呼吸作用以及光合作用，可以 测定微升级小体积样品中氧气的含量，满足测定微小体系样品氧气消耗速率的要求。为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是一种测定微小生物呼吸作用的装 置，其特征是设置一管状反应腔体，管腔内壁上设有一反应筛将管状反应腔体分隔成上下 两部分，管口设有密封塞，密封塞上设有一通孔，电极头部密封穿过该通孔伸入管状反应腔 体之上半部；将管状反应腔体垂直放置于一恒温水浴内，恒温水浴设有进、出水口与恒温水 槽连通循环，管状反应腔体底面与恒温水浴底面接触，恒温水浴顶部设有与管状反应腔体 之管口外径相配的孔，两者之间密封，管状反应腔体的底面上放置磁片，恒温水浴底面置于 磁力搅拌器上，管状反应腔体内注满反应液，生物样品放置在反应筛上，反应筛孔小于生物 样品的体积。所述反应筛的孔径为20-1000 μ m,电极头部距离反应筛小于0. 5cm。所述管状反应腔体、反应筛、恒温水�。芊馊该魈�。应用上述装置测定微小生物呼吸作用的方法，按以下步骤
(1)将恒温水槽的进出水口与恒温腔体的进出水口对应连接，开启恒温水槽，调节 水温至预设恒定温度，恒温水槽水温与生物样品采样地的原位水水温相近，开启水泵使恒 温水槽出水并流经恒温水浴循环；(2)将磁转子放入反应腔体内，将反应筛放置在反应腔体内壁支点上；(3)在反应腔体内注满反应液，该反应液为生物样品采样地的原位水；(4)放置底栖动物或生物膜于反应筛上，轻盖上密封塞；(5)将微电极穿过硅胶密封垫和密封塞通孔，暴露微电极头部敏感部位于反应腔 体内之反应筛之上；(6)启动磁力搅拌器，并调节其调频电机转速，转速大小以达到反应筛上方水体勻 速转动为宜；(7)实验开始，记录时间，开启与电极连接的溶解氧仪，记录初始氧气浓度，观察反 应液中溶解氧浓度的变化，定期检测水体溶解氧浓度；(8)待溶解氧显著降低至一数值后，获得这一时间段内氧气的下降速率；溶解氧 的降低，以不低于初始氧20%为宜，关闭恒温槽和溶解氧仪，取出微电极，打开密封塞，清理 反应腔体中反应液及生物样品，测定结束。本发明的优点及显著效果它具有小容积反应腔体的微呼吸系统装置，该微呼吸 系统装置制作简单，需样量小，测定结果稳定，可适用于大多实验室对呼吸作用的测定要 求。对于非商业用途的实验室，可根据本发明内容，自行加工或改装成类似的微呼吸系统。 微电极的引入，特别是，对于小体积样品中氧气消耗速率的测定而言，是一个利好消息。微 电极敏感头部可小于20微米，因此，利用微电极技术，设计小体积的反应腔体(反应腔体容 积2毫升)，该微小腔体中可放置各类生物样品，如含微生物的生物膜或沉积物，小型生物 (如摇蚊)等。
图1本发明装置的正视图；图2本发明装置的俯视图。
具体实施例方式图中标号说明1，微电极线，连接溶解氧测定仪；2，微电极；3，硅胶垫；4，管状通 孔；5，密封塞；6，恒温水浴；7，反应腔体；8，反应筛筛孔；9，反应筛；10，反应筛支点；11，磁 转子；12，进、出水口 ；13，磁铁；14，磁力搅拌器；15，调频电机；16，微电极头部敏感部位。参看图1、2，设置一管状反应腔体7(管径8毫米，密封塞5以下高度4厘米)，并 配备密封系统，恒温水浴系统，扰动系统及微电极检测系统。反应腔体7内中部具支点10， 支点上方放置反应筛9 ；反应筛的筛孔8，反应腔体7与密封塞5无缝连接，密封塞中心具一 管状小孔4，管状小孔4上方设有硅胶密封垫3。反应腔体内置于恒温水浴6内，恒温水槽 (图中未示出)中的循环水被泵出，经过进出水口 12流经恒温水浴6后返回恒温水槽。反 应腔体7置于磁力搅拌器14上；反应腔体内底部设置一磁转子11。微电极2穿过硅胶垫 3，通过密封塞5中心的管状小孔4后暴露微电极敏感部位于反应腔体7上腔内。其中，反 应腔体7，反应筛9，恒温水浴6，密封塞5均为透明质地。
本装置的测定过程如下(1)将恒温水槽的进出水口与恒温腔体的进出水口对应连接，开启恒温水槽，调节 水温至预设恒定温度，恒温水槽水温与生物样品采样地的原位水水温相近，开启水泵使恒 温水槽出水并流经恒温水浴循环；(2)将磁转子放入反应腔体内，将反应筛放置在反应腔体内壁支点上；(3)在反应腔体内注满反应液，该反应液为生物样品采样地的原位水；(4)放置底栖动物或生物膜于反应筛上，轻盖上密封塞；(5)将微电极穿过硅胶密封垫和密封塞通孔，暴露微电极头部敏感部位于反应腔 体内之反应筛之上；(6)启动磁力搅拌器，并调节其调频电机转速，转速大小以达到反应筛上方水体勻 速转动为宜；(7)实验开始，记录时间，开启与电极连接的溶解氧仪，记录初始氧气浓度，观察反 应液中溶解氧浓度的变化，定期检测水体溶解氧浓度；(8)待溶解氧显著降低至一数值后，获得这一时间段内氧气的下降速率；溶解氧 的降低，以不低于初始氧20%为宜，关闭恒温槽和溶解氧仪，取出微电极，打开密封塞，清理 反应腔体中反应液及生物样品，测定结束。为说明本发明装置的测定方法实施过程，我们选择太湖沉积物，太湖沉积物中的 摇蚊以及云南老君山溪流石生生物膜为研究对象，就测定太湖沉积物中摇蚊的呼吸速率， 不同温度条件下太湖沉积物耗氧速率，以及溪流石生生物膜的净初级生产率/异养呼吸速 率等分别进行介绍。上述摇蚊以及沉积物或者石生生物膜中的微生物，其个体均较�。牖� 得较大量的样品量也比较困难(如石生生物膜)，因此，较大体积的反应装置，很难完成预 设实验目的；选择小体积的装置，保证实验过程中反应体系的温度稳定以及精确确定小体 积反应体系中的氧气含量的变化，显得尤为重要。1，太湖沉积物中摇蚊的呼吸速率于2008年7月采集太湖表层沉积物，并筛取沉积物获得摇蚊；同时采集沉积 物-水界面处的上覆水。采样时，沉积物-水界面的温度为21°C。本案例目的在于理解原 位温度条件下摇蚊的呼吸速率，具体测定方法如下(1)将恒温槽的进出水口与恒温腔体的进出水口连接，开启恒温槽，调节至预设恒 定温度21°C，并让水泵出恒温槽，并流经恒温腔体。气体在水体中的溶解度对温度较为敏 感，且温度与生物的呼吸速率密切相关，因此严格控制实验过程中的温度至关重要。恒温水 体温度可根据采样时的实际温度而确定，也可根据相应实验设计而决定。如本案例中，采样 时的实际水温为21°C，所以为了获得实际条件下摇蚊的呼吸速率，我们选择21°C作为实验 温度。(2)将磁转子放入反应腔体底部，并将反应筛放置在反应腔体中的反应筛支点上。(3)反应筛孔径的选择，与待测生物样品的个体大小有关。反应筛的作用在于提供 一个支撑面，保证待测样品能够在实验过程中位于反应筛上方，避免反应筛下方的磁转子 损坏待测生物样品。如本案例中待测样品为摇蚊，其个体长度可达一厘米，而其个体直径可 仅为1000 μ m,因此选择孔径为500 μ m的反应筛，一般可保证实验过程中摇蚊不掉至反应 筛下方。
(4)在反应腔体内注满反应液(本案例中为0. 2 μ m滤膜过滤的湖水)；0. 2 μ m过 滤可除去水体中大部分微生物和颗粒物，使得反应液中尽量不含有具消耗氧气的生物或颗 粒物质，以减免反应液中氧气消耗对摇蚊氧气消耗速率的影响。( 采用镊子无损伤的夹放或采用牙签轻挑摇蚊四条放于反应筛上。然后，轻盖上 密封塞，让部分不含目标测定物的反应液溢流。(6)将微电极穿过硅胶垫和密封塞的管状小孔，并压紧；硅胶垫紧贴于管状小孔 的上方，这样可达到对反应腔体密封的目的。密封塞的管状小孔与使用的微电级的直径有 关。我们使用的微电极直径为1mm，因此，密封塞管状小孔的直径为1. 1mm。(7)暴露出微电极敏感部位于反应液内，微电极敏感部位距反应筛的距离控制在 0. 5cm范围内，以确保微电极可敏感记录溶解氧的变化。(8)启动磁力搅拌器，调节调频电机使磁转子的转速为30rmp/min ；转速大小以达 到反应筛上方水体单向勻速转动为宜，这样可保证整个反应腔体的水体处于混勻状态。(9)开启溶解氧仪，观察反应液中溶解氧浓度的变化，正常条件下，溶解氧浓度不 会存在剧烈的变化。(10)记录初始氧气浓度7. aiig/Ι，每5秒记录一次水体溶解氧浓度。(ll)30min后，溶解氧显著降低至6. 5mg/l，从而获得15min内氧气的下降速率；溶 解氧的降低，以不低于初始氧20%为宜，在该氧气降低范围内氧气的下降速率接近线性。(12)关闭恒温槽和溶解氧仪，从密封塞的管状小孔和硅胶垫中取出微电极，打开 密封塞，清理出反应腔体中反应液及生物样品摇蚊。(13)实验结束。2，不同温度条件下太湖沉积物耗氧速率
于2009年12月采集太湖表层沉积物，同时采集沉积物_水界面处的上覆水。采 样时，沉积物-水界面的温度为12°C。本案例的目的在于测定温度增加后，沉积物耗氧速率 的变化。具体测定方案如下(1)将恒温槽的进出水口与恒温腔体的进出水口连接，开启恒温槽，调节至预设恒 定温度12°C，并让水泵出恒温槽，并流经恒温腔体。气体在水体中的溶解度与温度较为敏 感，且温度与生物的呼吸速率密切相关，因此严格控制实验过程中的温度至关重要。恒温水 体温度可根据采样时的实际温度而确定，也可根据相应实验设计而决定。(2)将磁转子放入反应腔体底部，并将反应筛放置在反应腔体中的反应筛支点上。(3)反应筛孔径的选择，与待测生物样品的大小有关。反应筛的作用在于提供一个 支撑面，保证待测样品能够在实验过程中位于反应筛上方，避免反应筛下方的磁转子伤害 待测生物体。如本案例中待测样品为沉积物，因此选择孔径最小的20 μ m的反应筛，这样可 保证大部分含微小生物体的颗粒物能够悬浮于反应筛上方。(4)在反应腔体内注满0. 2 μ m滤膜过滤的湖水；0. 2 μ m过滤可除去水体中大部分 微生物和颗粒物，反应液中尽量不含有具消耗氧气的生物或物质，以减免反应液中氧气消 耗对沉积物氧气消耗速率的影响。(5)采用2ml反应液稀释0. Ig沉积物，获得均勻混合液，然后使用移液器或微量注 射器吸取0. 2ml的混合液轻放于反应筛上方。然后，轻盖上密封塞，让部分不含沉积物的反 应液溢流。
(6)密封塞的管状小孔与使用的微电级的直径有关。我们使用的微电极直径为 1mm，因此，管状小孔的直径为确定为1. 1mm。(7)将微电极穿过硅胶垫和密封塞的管状小孔，并压紧；硅胶垫紧贴于管状小孔 的上方，这样可达到对反应腔体密封的目的。(8)暴露出微电极敏感部位于反应腔体内，微电极敏感部位距反应筛的距离控制 在0. 5cm范围内，以确保微电极可敏感记录溶解氧的变化。(9)启动磁力搅拌器，调节调频电机使磁转子的转速为30rmp/min ；转速大小以达 到反应筛上方水体单向勻速转动为宜，这样可保证整个反应腔体的水体处于混勻状态。(10)开启溶解氧仪，观察反应液中溶解氧浓度的变化，正常条件下，溶解氧浓度不 会存在剧烈的变化。(11)记录初始氧气浓度为9. 8mg/l，每5秒记录一次水体溶解氧浓度。(12)20min后，溶解氧显著降低至9.0mg/l，从而获得一定时间段内氧气的下降速 率；溶解氧的降低，以不低于初始氧20%为宜，在该氧气降低范围内氧气的下降速率接近 线性。(13)关闭溶解氧仪。(14)调节恒温槽至恒定温度15°C，保持恒温水被泵出恒温槽，并流经恒温腔体。 静待20min，确保反应腔内温度达到预设温度15°C。(15)重复第10-12步，记录反应腔内的溶解氧浓度随时间的变化，获得在15°C条 件下氧气随时间下降的速率。(16)关闭恒温槽和溶解氧仪，从密封塞的管状小孔和硅胶垫中取出微电极，打开 密封塞，清理出反应腔体中反应液及沉积物。(17)实验结束。3，溪流石生生物膜的净初级生产率/异养呼吸速率的测定于2009年11月采集云南老君山溪流的石生生物膜样品，同时采集溪水，一并低温 冷藏条件下带回实验室。采样时，沉积物-水界面的温度为9°C。本案例目的在于获得溪流 石生生物膜样品的呼吸速率及光合速率，具体测定方案如下(1)将恒温槽的进出水口与恒温腔体的进出水口连接，开启恒温槽，调节至预设恒 定温度10°c，并让水泵出恒温槽，并流经恒温腔体。气体在水体中的溶解度与温度较为敏 感，且温度与生物的呼吸速率密切相关，因此严格控制实验过程中的温度至关重要。(2)将磁转子放入反应腔体底部，并将反应筛放置在反应腔体中的反应筛支点上。(3)反应筛孔径的选择，与待测样品有关。反应筛的作用在于提供一个支撑面， 保证待测样品能够在实验过程中位于反应筛上方，避免反应筛下方的磁转子伤害待测生物 体。如本案例中待测样品为石生生物膜，因此选择孔径为20 μ m的反应筛，这样可保证大部 分含微小生物体的颗粒物能够悬浮于反应筛的上方。(4)在反应腔体内注满反应液，如0. 2 μ m滤膜过滤的溪水；0. 2 μ m过滤可除去溪 水中大部分微生物和颗粒物，反应液中尽量不含有具消耗氧气的生物或物质，以减免反应 液中氧气消耗对生物膜氧气消耗或生成速率的影响。(5)采用2ml反应液稀0. Ig生物膜，获得均勻混合液，然后使用移液器或微量注射 器吸取0. 2ml的混合液轻放于反应筛上方。然后，轻盖上密封塞，让部分不含生物膜的反应液溢流。(6)密封塞的管状小孔与使用的微电级的直径有关。我们使用的微电极直径为 1mm，因此，管状小孔的直径为确定为1. 1mm。(7)将微电极穿过硅胶垫和密封塞的管状小孔，并压紧；硅胶垫紧贴于管状小孔 的上方，这样可达到对反应腔体密封的目的。(8)暴露出微电极敏感部位于反应腔体内，微电极敏感部位距反应筛的距离控制 在0. 5cm范围内，以确保微电极可敏感记录溶解氧的变化。(9)启动磁力搅拌器，调节调频电机使磁转子的转速为30rmp/min ；转速大小以达 到反应筛上方水体单向勻速转动为宜，这样可保证整个反应腔体的水体处于混勻状态。(10)用遮光罩罩住反应腔体，避免生物膜的光合作用。(11)开启溶解氧仪，观察反应液中溶解氧浓度的变化，正常条件下，溶解氧浓度不 会存在剧烈的变化。(12)记录初始氧气浓度9. Omg/1，每5秒记录一次水体溶解氧浓度。(13)15min后，溶解氧显著降低至8.;3mg/l，从而获得一定时间段内氧气的下降速 率，计算得到单位质量生物膜的异氧呼吸速率；溶解氧的降低，以不低于初始氧20%为宜， 在该氧气降低范围内氧气的下降速率接近线性。(14)关闭溶解氧仪。(15去除遮光罩，为反应腔体提供光源(60mOl/m2/S，金卤灯)。(16)重复第11-13步，记录反应腔内的溶解氧浓度随时间的变化，获得氧气随时 间变化的速率，计算得到单位质量生物膜的毛初级生产力。结合第13步获得的黑暗条件下 生物膜的异氧呼吸速率，根据公式“净初级生产率=毛初级生产率-异养呼吸速率”，计算 得到生物膜的净初级生产率。(17)关闭恒温槽和溶解氧仪，从密封塞的管状小孔和硅胶垫中取出微电极，打开 密封塞，清理出反应腔体中反应液及生物膜。实验结束。
权利要求
1.一种测定微小生物呼吸作用的装置，其特征是设置一管状反应腔体，管腔内壁上 设有一反应筛将管状反应腔体分隔成上下两部分，管口设有密封塞，密封塞上设有一通孔， 电极头部密封穿过该通孔伸入管状反应腔体之上半部；将管状反应腔体垂直放置于一恒温 水浴内，恒温水浴设有进、出水口与恒温水槽连通循环，管状反应腔体底面与恒温水浴底面 接触，恒温水浴顶部设有与管状反应腔体之管口外径相配的孔，两者之间密封，管状反应腔 体的底面上放置磁片，恒温水浴底面置于磁力搅拌器上，管状反应腔体内注满反应液，生物 样品放置在反应筛上，反应筛孔小于生物样品的体积。
2.根据权利要求1所述的测定微小生物呼吸作用的装置，其特征是所述反应筛的孔 径为20-1000 μ m,电极头部距离反应筛小于0. 5cm。
3.根据权利要求1或2所述的测定微小生物呼吸作用的装置，其特征是所述管状反 应腔体、反应筛、恒温水�。芊馊该魈�。
4.应用权利要求1所述装置测定微小生物呼吸作用的方法，按以下步骤(1)将恒温水槽的进出水口与恒温腔体的进出水口对应连接，开启恒温水槽，调节水温 至预设恒定温度，恒温水槽水温与生物样品采样地的原位水水温相近，开启水泵使恒温水 槽出水并流经恒温水浴循环；(2)将磁转子放入反应腔体内，将反应筛放置在反应腔体内壁支点上；(3)在反应腔体内注满反应液，该反应液为生物样品采样地的原位水；(4)放置底栖动物或生物膜于反应筛上，轻盖上密封塞；(5)将微电极穿过硅胶密封垫和密封塞通孔，暴露微电极头部敏感部位于反应腔体内 之反应筛之上；(6)启动磁力搅拌器，并调节其调频电机转速，转速大小以达到反应筛上方水体勻速转 动为宜；(7)实验开始，记录时间，开启与电极连接的溶解氧仪，记录初始氧气浓度，观察反应液 中溶解氧浓度的变化，定期检测水体溶解氧浓度；(8)待溶解氧显著降低至一数值后，获得这一时间段内氧气的下降速率；溶解氧的降 低，以不低于初始氧20%为宜，关闭恒温槽和溶解氧仪，取出微电极，打开密封塞，清理反应 腔体中反应液及生物样品，测定结束。
全文摘要
一种测定微小生物呼吸作用的装置，设置一管状反应腔体，管腔内壁上设有一反应筛将反应腔体分隔成上下两部分，管口设有密封塞，密封塞上设有一通孔，电极头部密封穿过该通孔伸入管状反应腔体之上半部；将管状反应腔体垂直放置于一恒温水浴内，恒温水浴设有进、出水口与恒温水槽连通循环，管状反应腔体底面与恒温水浴底面接触，恒温水浴顶部设有与管状反应腔体之管口外径相配的孔，两者之间密封，管状反应腔体的底面上放置磁片，恒温水浴底面置于磁力搅拌器上，管状反应腔体内注满反应液，生物样品放置在反应筛上，反应筛孔小于生物样品的体积。
文档编号G01N27/409GK102121917SQ20111004883
公开日2011年7月13日 申请日期2011年3月1日 优先权日2011年3月1日
发明者张路, 沈吉, 王建军 申请人:中国科学院南京地理与湖泊研究所
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