专利名称：一种a、c型脑膜炎奈瑟菌酶联诊断试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种酶联诊断试剂盒及其用途，具体说，是涉及一种A、C型脑膜炎奈瑟菌酶联诊断试剂盒，属于医学、生物技术领域。
背景技术：
脑膜炎奈瑟菌是一种革兰氏阴性双球菌，通过呼吸道传染引起的流行性脑脊髓膜炎(简称流脑)是一种对人类�：ρ现氐拇拘约膊。送饣箍梢鹁�、肺炎、关节炎、结膜炎、心肌炎、泌尿系统等多种炎症，是一种常见和多发疾病。脑膜炎奈瑟球菌可分为A、B、C、D、H、I、K、L、X、Y、Z、29E和W135共13个血清群，对人类致病的多属A、B、C群，其他类群在带菌者中经常发现，但很少致病。我国的流脑流行菌群仍以A群为主，但近年来也发人·群中的绝大多数人对脑膜炎奈瑟球菌易感，该菌可寄生于正常人的鼻咽腔内，处于这种寄生状态的细菌并不导致任何病理变化，亦不引起任何疾病症状；但这种带菌状态可以持续I周到数月之久，这种处于潜伏感染状态的带菌者在人群中的比例可高达50% 85%。人群中的带菌者是造成流行性脑脊髓膜炎流行的最重要的传染源，由于脑膜炎奈瑟菌的惟一自然宿主是人，因此，在人群较为密集的场所，容易造成细菌的高效率的传播，特别是在儿童、中小学生为最易感人群，极易在短时间内造成儿童发病流行，所以，控制人群中的带菌者传染源成为控制流脑流行的重要环节之一。目前国内市场上脑膜炎奈瑟菌的各种免疫诊断试剂盒质量参差不齐，既无统一的质量标准，又在无序生产与应用，给脑膜炎奈瑟菌的预防和诊治造成严重障碍。目前虽有国外试剂商提供同类商品化诊断试剂盒用于检测，但是此种试剂盒价格十分昂贵，限制了临床的广泛使用。
发明内容
针对现有技术存在的上述问题，本发明的目的是提供一种A、C型脑膜炎奈瑟菌酶联诊断试剂盒。为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下
一种A、C型脑膜炎奈瑟菌酶联诊断试剂盒，包括盒体，盒体内置有5个下凹瓶位，5瓶设有密封盖的试剂瓶、一酶标反应板和封板膜构成，所述试剂瓶内的试剂分别为标本稀释液、酶标二抗、洗涤液、底物液和终止液，其中
所述酶标反应板由A、C型脑膜炎奈瑟菌包被；
所述标本稀释液为含10%小牛血清和2%抗人IgG的O. 01M、pH7. 4的磷酸盐缓冲液； 所述洗涤液为含有O. 05%Tween20的磷酸盐缓冲液；
所述酶标二抗为辣根过氧化物酶标记的鼠抗人IgM单抗；
所述底物液为ΤΜΒ-Η000尿素溶液；
所述终止液为2mol/LH2S04溶液；作为进一步优选方案，所述下凹瓶位可由塑料或纸板制成。作为进一步优选方案，所述酶标反应板位于所述试剂瓶之上或之下，所述封板膜与所述酶标反应板相邻；且所述封板膜与所述酶标反应板的大小一致。作为进一步优选方案，所述酶标反应板包括支撑架，及放置在支撑架之上的数条可拆卸的微孔反应板条，每条微孔反应条上设有数个可拆卸的微反应孔。作为进一步优选方案，所述酶标反应板上共设有96个微反应孔，且所述酶标反应板外设有封套。本发明提供的A、C型脑膜炎奈瑟菌酶联诊断试剂盒具有较好的特异性，检测结果与美国R&D试剂盒脑膜炎奈瑟菌A+C型IgMELISA检测试剂盒的一致性高，灵敏度为98%，特异度为99. 7%，因此具有十分广阔的应用前景。
图I为本发明提供的A、C型脑膜炎奈瑟菌酶联诊断试剂盒的结构示意 图2为本发明提供的A、C型脑膜炎奈瑟菌酶联诊断试剂盒中的96孔酶标版的结构示意图。
具体实施例方式以下结合具体实施例，进一步阐明本发明。应理解，下述实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。比例和百分比基于重量，除非特别说明。下面结合附图及其实施例对本发明进一步详细说明。
实施例如图I和图2所示，本发明提供的一种A、C型脑膜炎奈瑟菌酶联诊断试剂盒，包括盒体(I )，盒体内置有5个下凹瓶位(2)，5瓶设有密封盖的试剂瓶组(3)、一块酶标反应板
(4)及一张封板膜(5)，其中所述的5个下凹瓶位内分别相应放置装有样品稀释液(31)、酶标二抗(32)、浓缩洗液(33)、显色液(34)和终止液(35)各一瓶，所述的酶标反应板包括数个底面封闭且顶面敞口的微反应孔的内壁包被有A、C型脑膜炎奈瑟菌；所述酶标反应板位于所述试剂瓶之上或之下，所述封板膜与所述酶标反应板相邻；且所述封板膜与所述酶标反应板的大小一致；所述酶标反应板包括支撑架(41)，及放置在支撑架之上的数条可拆卸的微孔反应板条(42)，每条微孔反应条上设有数个可拆卸的微反应孔(43);所述酶标反应板上共设有96个微反应孔，且所述酶标反应板外设有封套(6)。试剂盒的制备
(I)、试剂
包被液(O. 05mol/L, ρΗ9· 6的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液)=Na2CO3 I. 5g、NaHCO3 2. 9g、Na2N3 O. 2g,加双蒸水至 1000ml,调至 pH9. 6 ；
标本稀释液(含10%小牛血清和2%抗人IgG的O. Olmol/L磷酸盐缓冲液(PBS) pH7. 4)，PBS :由 NaCl 8. 0g、KH2PO4 O. 2g、Na2HPO4. Iffi2O 2. 9g、KCl O. 2g、硫柳汞 0. lg，加双蒸水至IOOOmL,调至 pH7. 4，即得；
封闭液(10%小牛血清IPRS溶液)小牛血清100ml XPBS (pH7. 4) 900ml ；
洗涤液(PBST, ρΗ7· 4):由 NaCl 8. 0g、KH2PO4 O. 2g、Na2HPO4. 12H20 2. 9g、KCl 0. 2g、Tween200. 5ml、硫柳萊 0. lg、加双蒸水至 1000ml,调至 pH7. 4 ；
酶标ニ抗(HRP*鼠抗人IGM单抗):辣根过氧化物酶标记的鼠抗人IgM单抗；
底物液(TMB-H202尿素溶液):
①底物液A(3、3’、5、5’-四甲基联苯胺，TMB) :TMB200mg，无水こ醇100ml，加双蒸水至IOOOml
②底物液B缓冲液(O.Imol/L柠檬酸-0. 2mol/L磷酸氢ニ钠缓冲液，pH5. O 5. 4):Na2HPO4 14. 60g,朽1檬酸9. 33g, 0. 75%过氧化氢尿素6. 4ml,加双蒸水至1000ml,调至·pH5. 0-5. 5 ；
⑧将底物液A和B按I :1或I :1. 5混合，即成ΤΜΒ-Η000尿素溶液。终止液(2mol/LH2S04溶液)双蒸水600ml，浓硫酸IOOml (缓慢滴加并不断搅拌)，加双蒸水至900ml。(2)、主要仪器
酶标仪BI0_RADModel550 ；ELISA 反应板Comning Incorporated costar 96 WellEIA/RIA plate。(3)、方法
酶标ニ抗最适滴度的选择
取96孔酶标板ー块，用100ng/ml人IgMlOOull孔4°C包被过夜，洗涤液洗板3次，350ul/孔，甩干；将酶标抗人IgM单抗用稀释液作一系列稀释后分别加入己包被的孔中，IOOull孔，37°C孵育40min，后用洗板3次，350ul/孔，甩干；加底物显色，每孔加入底物液100ul，37°C或室温避光显色15分钟；后加入终止液50U1终止反应、，在酶标仪上读取450nm波长处吸光度，即A值，取A值在I. O时的酶标抗体稀释度，作为酶标ニ抗的最适滴度为 I :1000 1100。棋盘滴定法选择包被抗原最适滴度
取96孔酶标板ー块；每孔加入0. lmol/L的NaHCO3稀释的5%戊ニ醛200uL，37°C温箱放置I小时；去离子水洗涤96孔酶标板4次，甩干；将脑膜炎奈瑟菌A与C型(2 X IO9Cfu/mL)等体积混合后，用包被液将抗原作一系列稀释后进行包被，每孔IOOuL ;37°C温箱过夜烘干；取过夜烘干的抗原包被板加200uLPBS稀释的10%小牛血清37°C封闭I. 5小时，得到梯度稀释抗原包被酶标反应板；
将强阳性參考血清、弱阳性參考血清和阴性參考血清用标本稀释液按I :100倍稀释，加样，保温，洗涤。加按最适滴度稀释的酶标抗人IgM单抗，保温，洗涤。加底物显色，加酸终止反应后在酶标仪上读取450nm波长处吸光度，即A值；
选择强阳性參考血清的A值为0. 8 I. O间、阴性參考血清的A值小于0. 2的包被抗原的稀释度作为最适滴度，本试剂盒最适包被A、C型脑膜炎奈瑟菌的稀释度为2X105cfu/ml, IOOul/ 孔。A、C型脑膜炎奈瑟菌包被反应板的制备方法取96孔酶标板ー块；每孔加入O. Imol/L的NaHCO3稀释的5%戊ニ醛200ul，37°C温箱放置I小时；去离子水洗涤96孔酶标板4次，甩干；将脑膜炎奈瑟球菌A与C型(3 X IO9Cfu/ml)等体积混合后，用包被液I :1000 1100稀释包板，每孔IOOuL ;37°C温箱过夜烘干；取过夜烘干的抗原包被板加200ulPBS稀释的10%小牛血清37°C封闭I. 5小时，得到抗原包被酶标反应板；
脑膜炎奈瑟菌IgMELISA检测试剂盒，由上述脑膜炎奈瑟球菌全菌包被酶标反应板、标本稀释液、洗涤液、酶标ニ抗、底物液、终止液及參考血清构成。具体分为
标本稀释液含10%小牛血清和2%抗人IgG的O. 0IMpH7. 4的磷酸盐缓冲液(PBS)； 洗涤液含有O. 05%Tween20的O. 01mol/LpH7. 4的磷酸盐缓冲液(PBST)； 酶标ニ抗辣根过氧化物酶标记的鼠抗人IgM单抗；
底物液ΤΜΒ-Η000尿素溶液；
终止液2mol/LH2S04溶液。利用上述试剂盒采用ELISA法检测血清中脑膜炎奈瑟菌IgM抗体
(1)待检血清，加入用标本稀释液1:100稀释的待检血清到包被好的酶标反虚板，IOOuL/孔，同时另设两孔分别加入强阳性參考血清和阴性參考血清IOOuL/孔，37°C孵育I小时，洗涤液洗板3次，350ul/孔，甩干；
(2)加酶标物，加入HRP(辣根过氧化酶)标记的鼠抗人IGM单抗，IOOuL/孔，37°C孵育40min,洗漆液洗板3次,350ul/孔,甩干；
(3)显色，用洗涤液洗板后每孔加入底物液100uL，37°C或室温避光显色15分钟；
(4)每孔加入终止液50UL，终止反应；
(5)结果判断，空白孔调零，读取450nm波长处吸光度，即0D450值，强阳性參考血清的A值需> O. 9、阴性參考血清的A值需〈O. 2则证明试剂盒结果正确。(6)计算结果，将待检标本血清平均OD值(P)除以阴性血清平均OD值(N)，求得P/N值，P/N彡2. I为阳性，Ρ/Ν〈2· I为阴性。特异性实验
以脑膜炎奈瑟菌A+C型标准IGM阳性血清、こ型脑炎病毒阳性血清、麻疹病毒IgM阳性血清、风疹病毒IGM阳性血清、人巨细胞病毒阳性血清和脑膜炎奈瑟菌A+C型标准IgM ；阴性血清采用A、C型脑膜炎奈瑟菌抗原包被酶标反应板ELISA诫剂盒检测，Ρ/Ν值分别为6. 17、I. 13、I. 17、I. 16和I. 08，说明该试剂盒特异性良好。重复性实验
随机抽取20份脑膜炎奈瑟菌A+C型标准IgM阳性、阴性血清分别于不同的时间进行ELISA重复检測，同一份血清检测结果的Ρ/Ν值上下浮动均不超过O. 05，变异系数均〈5%，证明该试剂盒具有良好的稳定性和重复性。临床标本检测
采用美国R&D公司流脑A+C型IgM ELISA检测试剂盒检测576例正常人血清血清，其中IgM抗体阳性40例，阴性434例，采用A、C型脑膜炎奈瑟菌包被酶标反应板法检测结果与R&D公司流脑A+C型IGMELISA检测试剂盒相比灵敏度为95%，特异度为99. 5%，具体结果如表I所示。
表I两种试剂盒IgM检测结果比较
权利要求
1.ー种A、C型脑膜炎奈瑟菌酶联诊断试剂盒，其特征在于，包括盒体，盒体内置有5个下凹瓶位，5瓶设有密封盖的试剂瓶、一酶标反应板和封板膜构成,所述试剂瓶内的试剂分别为标本稀释液、酶标ニ抗、洗涤液、底物液和终止液，其中 所述酶标反应板由A、C型脑膜炎奈瑟菌包被； 所述标本稀释液为含10%小牛血清和2%抗人IgG的O. 01M、pH7. 4的磷酸盐缓冲液； 所述洗涤液为含有O. 05%Tween20的磷酸盐缓冲液； 所述酶标ニ抗为辣根过氧化物酶标记的鼠抗人IgM单抗； 所述底物液为ΤΜΒ-Η000尿素溶液； 所述终止液为2mol/LH2S04溶液。
2.根据权利要求I所述的A、C型脑膜炎奈瑟菌酶联诊断试剂盒，其特征在于所述下凹瓶位可由塑料或纸板制成。
3.根据权利要求I所述的A、C型脑膜炎奈瑟菌酶联诊断试剂盒，其特征在于所述酶标反应板位于所述试剂瓶之上或之下，所述封板膜与所述酶标反应板相邻；且所述封板膜与所述酶标反应板的大小一致。
4.根据权利要求I所述的A、C型脑膜炎奈瑟菌酶联诊断试剂盒，其特征在于所述酶标反应板包括支撑架，及放置在支撑架之上的数条可拆卸的微孔反应板条，每条微孔反应条上设有数个可拆卸的微反应孔。
5.根据权利要求I所述的A、C型脑膜炎奈瑟菌酶联诊断试剂盒，其特征在于所述酶标反应板上共设有96个微反应孔，且所述酶标反应板外设有封套。
全文摘要
本发明公开了一种A、C型脑膜炎奈瑟菌酶联诊断试剂盒，包括盒体，盒体内置有5个下凹瓶位，5瓶设有密封盖的试剂瓶、一块A、C型脑膜炎奈瑟菌包被酶标反应板及一张封板膜，其中所述的5个下凹瓶位内分别相应放置装有样品稀释液、酶标二抗、浓缩洗液、显色液和终止液各一瓶。本发明提供的A、C型脑膜炎奈瑟菌酶联诊断试剂盒的检测结果与美国R&D试剂盒脑膜炎奈瑟菌A+C型IgMELISA检测试剂盒的一致性高，灵敏度为98%，特异度为99.7%，因此具有十分广阔的应用前景。
文档编号G01N33/569GK102854311SQ20121027007
公开日2013年1月2日 申请日期2012年7月31日 优先权日2012年7月31日
发明者刘昊智, 吴克, 史晋, 鲍路伟, 王文灏, 程超, 张爱晖 申请人:上海博沃生物科技有限公司
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