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专利名称：一种电化学生物传感器敏感膜及其制备方法
技术领域：
本发明属于电化学生物传感器及其制备技术领域，特别设计一种共价键合生物活性物质并掺杂电子传递体和电子媒介体的壳聚糖-二氧化硅溶胶-凝胶电化学生物传感器敏感膜及其制备方法。
背景技术：
电化学生物传感器以其高灵敏性、高选择性、低费用和操作简单等优点被广泛应用于临床诊断、食品和药物分析以及环境控制等领域。电化学生物传感器应用于实际分析和检测的同时还带来了可观的经济效益。电化学生物传感器敏感膜的制备是构建电化学生物传感器的关键步骤。壳聚糖-二氧化硅溶胶-凝胶以其优良的生物相容性、温度稳定性、化学惰性和成膜性等诸多优势被广泛用作电化学生物传感器敏感膜。生物活性物质可被固定在溶胶-凝胶膜的三维网孔中并保持其原有的生物构象和生物活性。但由于这种固定方法属于物理包埋法，长期使用会导致生物活性物质的流失，从而影响传感器的稳定性。另一方面，二氧化硅溶胶-凝胶膜的电子传导性相对较差，而且其所制备的电化学生物传感器尤其是基于检测H2A的传感器通常需要高于+0. 6V的工作电位，实际样品中共存的一些电活性物质如尿酸和抗坏血酸等会产生干扰，这些问题会影响传感器的灵敏度和选择性。硅烷偶联剂如3-异氰酸酯基丙基三乙氧基硅烷和2-(3，4-环氧环己烷)乙基三甲氧基硅烷已被广泛应用于复合有机-无机材料的制备。如在文献(I)Journal of Materials Chemistry，2005，15 :3952-3961 中，Simone S. Silva 等人将 3-异氰酸酯基丙基三乙氧基硅烷同时作为壳聚糖的偶联剂和溶胶-凝胶前驱体，通过其异氰酸酯基和壳聚糖的氨基间的共价偶联及其同步溶胶-凝胶过程合成了具有良好生物活性的壳聚糖-二氧化硅复合物。同时异氰酸酯基和环氧基也是常见的生物活性物质的偶联基团。可见将这些硅烷偶联剂同时作为生物活性物质和壳聚糖的共价偶联剂以及溶胶-凝胶前驱体，通过共价偶联反应和同步溶胶-凝胶过程，可将生物活性物质牢固地共价键合在所形成的壳聚糖-二氧化硅溶胶-凝胶三维网孔结构中，进而可提高传感器的稳定性，但通过这种方法制备电化学生物传感器敏感膜还未见报道。电子传递体如碳纳米管和电子媒介体如普鲁士蓝等其优越的电化学性能引起了广泛的关注。如在文献O)ElectrOanalySiS，2009，21 2207-2212中，Junfeng ^iai等人将多壁碳纳米管于铁氰化钾、氯化铁和氯化钾的酸性溶液中搅拌12小时后制备了普鲁士蓝修饰的多壁碳纳米管复合物，多壁碳纳米管可显著提高普鲁士蓝的电化学行为，同时该复合物可有效地催化H2A的还原，在低达-0. IV下可对H2A 产生明显的计时电流响应，响应的灵敏度为153. 7 μ Amr1CnT2,检测限为5. 67Χ10_ΤΜ。但将这些电子传递体和电子媒介体掺杂到二氧化硅溶胶-凝胶中以提高电化学生物传感器的灵敏度和选择性还未见报道
发明内容
本发明的目的在于提供一种电化学生物传感器敏感膜及其制备方法，采用硅烷偶联剂将生物活性物质牢固地共价键合于其同步形成的壳聚糖-二氧化硅溶胶-凝胶生物相容的三维网孔结构中，同时将电子传递体和电子媒介体掺杂到其中。将硅烷偶联剂如3-异氰酸酯基丙基三乙氧基硅烷和2-(3，4-环氧环己烷)乙基三甲氧基硅烷同时作为生物活性物质和壳聚糖的共价偶联剂以及溶胶-凝胶前驱体，通过功能基团和氨基的共价偶联及同步溶胶-凝胶过程，可将生物活性物质牢固地共价键合在同步形成的壳聚糖-二氧化硅溶胶-凝胶生物相容的三维网孔结构中，从而有效地防止生物活性物质的流失，进而提高电化学生物传感器的稳定性。电子传递体和电子媒介体具有优良的电化学性能，同时将其掺杂到二氧化硅溶胶-凝胶中，可提高溶胶-凝胶膜的电子传导性，同时还可赋予其在低电位进行检测的性能，进而提高电化学生物传感器的灵敏度和选择性。因此本发明提供的共价键合生物活性物质并掺杂电子传递体和电子媒介体的壳聚糖-二氧化硅溶胶-凝胶电化学生物传感器敏感膜可显著提高电化学生物传感器的稳定性、灵敏度和选择性。本发明提供的共价键合生物活性物质并掺杂电子传递体和电子媒介体的壳聚糖-二氧化硅溶胶-凝胶电化学生物传感器敏感膜是由电子传递体、电子媒介体和共价键合生物活性物质的壳聚糖-二氧化硅溶胶-凝胶组成，其中电子传递体的含量为0. 05 2. Omg/cm2,电子媒介体的含量为0. Ol 2. Omg/cm2,生物活性物质的含量为0. Ol 2. Omg/ cm2，壳聚糖的含量为0. 02 5. Omg/cm2，其余为二氧化硅溶胶-凝胶。所述的电子传递体为单壁碳纳米管、多壁碳纳米管、富勒烯、金纳米粒子、银纳米粒子、钼纳米粒子、四氧化三铁纳米粒子中的一种；所述的电子媒介体为普鲁士蓝、铁氰化钾、二茂铁、乙酰基二茂铁、丙酰基二茂铁、丁酰基二茂铁、戊酰基二茂铁、己酰基二茂铁、辛酰基二茂铁、1，1'-双乙酰基二茂铁、1，1'-双己酰基二茂铁、乙基二茂铁、丙基二茂铁、丁基二茂铁、戊基二茂铁、己基二茂铁、1，1'-双丁基二茂铁、1，1'-双己基二茂铁、环戊烯基二茂铁、环己烯基二茂铁、 3- 二茂铁酰基丙酸、4- 二茂铁酰基丁酸、4- 二茂铁基丁酸、5- 二茂铁基戊酸、二茂铁基甲醇、二茂铁基乙醇、二甲氨基甲基二茂铁、二茂铁甲酸、二茂铁乙酸、二茂铁丙酸、二茂铁酰胺、二茂铁酰氯、二茂铁硫代甲酰胺、氨基二茂铁、萘酚绿B、天青、四氰基对苯二醌二甲烷、 四硫富瓦烯、四硫富瓦烯-四氰基二亚甲基苯醌、亚甲基蓝、新亚甲基蓝中的一种；所述的电子传递体和电子媒介体可被二者相互结合后的复合体所替代；所述的生物活性物质为葡糖糖氧化酶、胆固醇氧化酶、乙醇氧化酶、尿酸氧化酶、黄嘌呤氧化酶、辣根过氧化物酶、酪氨酸酶、肌红蛋白、细胞色素氧化酶、乙酰胆碱酯酶、乳酸脱氢酶、琥珀酸脱氢酶中的一种。本发明提供的共价键合生物活性物质并掺杂电子传递体和电子媒介体的壳聚糖-二氧化硅溶胶-凝胶电化学生物传感器敏感膜的制备方法是A.掺杂电子传递体和电子媒介体的壳聚糖-二氧化硅溶胶的制备按电子传递体和电子媒介体的终浓度分别为为0. 5 10mg/mL和0. 1 10mg/mL 将其超声5 60min分散于0.1 1.0%的壳聚糖溶液中，然后按体积比为10 1 2 1 的比例将电子传递体和电子媒介体的壳聚糖溶液与硅烷偶联剂混合，并在室温条件下剧烈搅拌丨 得到掺杂电子传递体和电子媒介体的壳聚糖-二氧化硅溶胶；B.生物活性物质的共价键合按生物活性物质的终浓度为0. 1 lOmg/mL将其加入到A得到的溶胶中，并于O 10°C条件下缓慢搅拌1 4h，得到共价键合生物活性物质并掺杂电子传递体和电子媒介体的壳聚糖-二氧化硅溶胶；C.敏感膜在电极表面的制备按8 400 μ L/cm2将步骤B得到的溶胶滴到电极表面，并将电极于2 10°C条件下干燥5 Mh，即可在电极表面形成一层共价键合生物活性物质并掺杂电子传递体和电子媒介体的壳聚糖-二氧化硅溶胶-凝胶电化学生物传感器敏感膜。所述的电子传递体为单壁碳纳米管、多壁碳纳米管、富勒烯、金纳米粒子、银纳米粒子、钼纳米粒子、四氧化三铁纳米粒子中的一种；所述的电子媒介体为普鲁士蓝、铁氰化钾、二茂铁、乙酰基二茂铁、丙酰基二茂铁、丁酰基二茂铁、戊酰基二茂铁、己酰基二茂铁、辛酰基二茂铁、1，1'-双乙酰基二茂铁、1，1'-双己酰基二茂铁、乙基二茂铁、丙基二茂铁、 丁基二茂铁、戊基二茂铁、己基二茂铁、1，1'-双丁基二茂铁、1，1'-双己基二茂铁、环戊烯基二茂铁、环己烯基二茂铁、3- 二茂铁酰基丙酸、4- 二茂铁酰基丁酸、4- 二茂铁基丁酸、 5-二茂铁基戊酸、二茂铁基甲醇、二茂铁基乙醇、二甲氨基甲基二茂铁、二茂铁甲酸、二茂铁乙酸、二茂铁丙酸、二茂铁酰胺、二茂铁酰氯、二茂铁硫代甲酰胺、氨基二茂铁、萘酚绿B、天青、四氰基对苯二醌二甲烷、四硫富瓦烯、四硫富瓦烯-四氰基二亚甲基苯醌、亚甲基蓝、新亚甲基蓝中的一种。所述的电子传递体和电子媒介体可被二者相互结合后的复合体所替代。所述的壳聚糖溶液为壳聚糖通过超声或搅拌溶解于0. 5 2. 0%的醋酸中的溶液。所述的硅烷偶联剂为3-异氰酸酯基丙基三乙氧基硅烷、3-异氰酸酯基丙基三甲氧基硅烷、3-(2，3-环氧丙氧)丙基三甲氧基硅烷、3-(2，3-环氧丙氧)丙基三乙氧基硅烷、 2-(3，4-环氧环己烷)乙基三甲氧基硅烷、3-(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷中的一种。所述的生物活性物质为葡糖糖氧化酶、胆固醇氧化酶、乙醇氧化酶、尿酸氧化酶、 黄嘌呤氧化酶、辣根过氧化物酶、酪氨酸酶、肌红蛋白、细胞色素氧化酶、乙酰胆碱酯酶、乳酸脱氢酶、琥珀酸脱氢酶中的一种。所述的电极为玻碳电极、金电极、钼电极、热解石墨电极、石墨碳糊电极中的一种。本发明的效果可以从本发明提供的敏感膜修饰的电极性能看出。采用上述方法在玻碳电极上采用3-异氰酸酯基丙基三乙氧基硅烷制备共价键合葡萄糖氧化酶并掺杂普鲁士蓝修饰的多壁碳纳米管的壳聚糖-二氧化硅溶胶-凝胶敏感膜并以其作为工作电极，以饱和甘汞电极(SCE)作为参比电极，Pt电极作为对电极组成葡萄糖电化学生物传感器。将该传感器的三电极体系置于PH值为5. 0 9. 0的磷酸盐缓冲溶液中，采用美国 PARSTAT 2273电化学工作站进行电化学测试。采用计时电流法(i_t)在-0. IV(vs. SCE)测试电极对葡萄糖的响应电流，结果如图3所示，修饰电极对葡萄糖具有良好的响应，响应时间小于10s，葡萄糖的线性响应浓度范围为2. 5X10—5 1. 3X10_3M，检测限为7. 5 X 10 灵敏度为 15. ZyAmT1CnT2,该灵敏度明显高于文献(3)Analytical and Bioanalytical Chemistry, 2005，381 =500-507中所报道的电沉积普鲁士蓝层和物理包埋葡萄糖氧化酶的壳聚糖-二氧化硅溶胶-凝胶膜修饰电极的数值。采用i_t法测试修饰电极于-0. IV下的抗干扰能力，结果如图4所示，浓度均为0. ImM的尿酸和抗坏血酸均未对电极产生干扰。采用i_t法测试电极在储存于剧烈搅拌的磷酸盐缓冲液中对葡萄糖的响应稳定性，结果如图 5所示，以四乙氧基硅烷(TE0Q作为溶胶-凝胶前驱体所形成的掺杂普鲁士蓝修饰的多壁碳纳米管和葡萄糖氧化酶的壳聚糖-二氧化硅溶胶-凝胶膜修饰的对照电极在储存24h前响应不断增大，24h后又开始下降，而本发明提供的敏感膜修饰的电极在整个储存过程中响
应非常稳定。同现有技术相比较，本发明提供的共价键合生物活性物质并掺杂电子传递体和电子媒介体的壳聚糖-二氧化硅溶胶-凝胶电化学生物传感器敏感膜应用于电化学生物传感器的突出优点是(1)通过共价键将生物活性物质牢固地键合于同步形成的壳聚糖-二氧化硅溶胶-凝胶生物相容的三维网孔结构中，在保证生物活性物质生物活性的前提下有效地防止其流失，显著提高传感器的稳定性。(2)在敏感膜中掺杂电子传递体可显著提高其电子传导性，从而提高传感器的响应灵敏度。(3)在敏感膜中掺杂电子媒介体还可同时赋予其在低电位下进行高效检测的性能，进而降低实际样品中共存的电活性物质所产生的干扰，提高传感器的选择性。(4)基于该敏感膜的电化学生物传感器的制备工艺简单，且不涉及到有机溶剂，从而在保证传感器性能的前提下降低其制备成本并提高其制备的安全性，适合商用型电化学生物传感器的大规模生产。


图1.基于本发明制备的共价键合葡萄糖氧化酶并掺杂普鲁士蓝修饰的多壁碳纳米管的壳聚糖-二氧化硅溶胶-凝胶敏感膜的葡萄糖电化学生物传感器的EIS图谱横坐标-阻抗实部Z'(单位欧姆，0)纵坐标-阻抗虚部Z “(单位欧姆，0)a.玻碳电极 b.壳聚糖-二氧化硅溶胶-凝胶膜修饰玻碳电极c.共价键合葡萄糖氧化酶的壳聚糖-二氧化硅溶胶-凝胶膜修饰玻碳电极d.共价键合葡萄糖氧化酶并掺杂普鲁士蓝修饰的多壁碳纳米管的壳聚糖-二氧化硅溶胶-凝胶膜修饰玻碳电极图2.基于本发明制备的共价键合葡萄糖氧化酶并掺杂普鲁士蓝修饰的多壁碳纳米管的壳聚糖-二氧化硅溶胶-凝胶敏感膜的葡萄糖电化学生物传感器对H2A响应的i-t 曲线横坐标-时间t (单位秒，S)纵坐标-电流i (单位微安，μ A)内插图传感器响应电流与H2A浓度的关系曲线横坐标- 浓度C (单位毫摩尔，mM)纵坐标-电流i (单位微安，μ A)图3.基于本发明制备的共价键合葡萄糖氧化酶并掺杂普鲁士蓝修饰的多壁碳纳米管的壳聚糖-二氧化硅溶胶-凝胶敏感膜的葡萄糖电化学生物传感器对葡萄糖响应的i"t曲线 横坐标-时间t (单位秒，S)纵坐标-电流i (单位微安，μ A)内插图传感器响应电流与葡萄糖浓度的关系曲线横坐标-葡萄糖浓度C (单位毫摩尔，mM)纵坐标-电流i (单位微安，μ A)图4.基于本发明制备的共价键合葡萄糖氧化酶并掺杂普鲁士蓝修饰的多壁碳纳米管的壳聚糖-二氧化硅溶胶-凝胶敏感膜的葡萄糖电化学生物传感器的抗干扰i_t曲线a.加入0. ImM葡萄糖b.加入 0. ImM 尿酸c.加入0. ImM抗坏血酸d.加入0. ImM葡萄糖 横坐标-时间t (单位秒，s)纵坐标-电流i (单位微安，μ A)图5.基于本发明制备的共价键合葡萄糖氧化酶并掺杂普鲁士蓝修饰的多壁碳纳米管的壳聚糖-二氧化硅溶胶-凝胶敏感膜的葡萄糖电化学生物传感器在储存于剧烈搅拌的磷酸盐缓冲液中对0. ImM葡萄糖的响应稳定性曲线a.基于本发明制备的敏感膜的葡萄糖电化学生物传感器b.基于以TEOS作为溶胶-凝胶前驱体所制备的敏感膜的对照电化学生物传感器横坐标-储存时间t (单位小时，h)纵坐标-电流i (单位微安，μ A)
具体实施例方式实施例1A.掺杂普鲁士蓝修饰的多壁碳纳米管的壳聚糖-二氧化硅溶胶的制备A-1.按多壁碳纳米管的终浓度为0.5mg/mL将其加入到积比为3 1的浓硫酸和浓硝酸混酸中于室温条件下超声6h，14000转离心收集碳纳米管并用去离子水将其洗涤至中性，然后置真空干燥箱中于50°C条件下干燥12h ；A-2.将酸处理后的多壁碳纳米管超声0. 分散于pH为1.5的去离子水中，使碳纳米管的终浓度为0. 5mg/mL，然后加入氯化铁、铁氰化钾和氯化钾，使其终浓度分别为 1. 2,2. 6、11. Omg/mL，然后于室温条件下搅拌Mh，收集多壁纳米管复合物并充分洗涤至中性，置真空干燥箱中于50°C条件下干燥1 后即可得到普鲁士蓝修饰的多壁碳纳米管；A-3.称取2. 3mg普鲁士蓝修饰的多壁碳纳米管、80 μ L 3_异氰酸酯基丙基三乙氧基硅烷加入到500 μ L 0. 25%的壳聚糖溶液中，在室温条件下剧烈搅拌4h得到掺杂普鲁士蓝修饰的多壁碳纳米管的壳聚糖-二氧化硅溶胶。B.葡萄糖氧化酶的共价键合将2. 9mg葡萄糖氧化酶加入到A得到的溶胶中，并于4°C条件下缓慢搅拌1. 5h,得到共价键合葡萄糖氧化酶并掺杂普鲁士蓝修饰的多壁碳纳米管的壳聚糖-二氧化硅溶胶。C.敏感膜在玻碳电极表面的制备
取6 μ L步骤B得到的溶胶滴到电极表面，并将电极于4°C条件下干燥12h，即可在电极表面形成一层共价键合葡萄糖氧化酶并掺杂普鲁士蓝修饰的多壁碳纳米管的壳聚糖-二氧化硅溶胶-凝胶敏感膜。以修饰玻碳电极为工作电极，钼丝为对电极，SCE电极作为参比电极，实验温度为室温，测试体系为0. 05M, pH 6. 9的磷酸缓冲溶液，用i_t法在-0. IV (vs. SCE)检测电极对葡萄糖的响应。该传感器的响应时间小于10秒；线性范围为2. 5X 10_5 1.3X IO-3M;线性相关系数为0. 9998 ；根据信噪比大于3的原则，测得电极的最低检测限为7. 5X IO-6M ； 灵敏度为 15. ZyAmT1CnT2,该灵敏度明显高于文献(3)Analytical and Bioanalytical Chemistry, 2005，381 =500-507中所报道的电沉积普鲁士蓝层和物理包埋葡萄糖氧化酶的壳聚糖-二氧化硅溶胶-凝胶膜修饰电极的数值；浓度均为0. ImM的尿酸和抗坏血酸均未对电极产生干扰；和基于TEOS为溶胶-凝胶前驱体所制备的敏感膜的对照传感器相比较， 该传感器在储存于剧烈搅拌的磷酸盐缓冲液中的响应非常稳定。实施例2A.掺杂普鲁士蓝修饰的多壁碳纳米管的壳聚糖-二氧化硅溶胶的制备A-1.按多壁碳纳米管的终浓度为0.5mg/mL将其加入到积比为3 1的浓硫酸和浓硝酸混酸中于室温条件下超声6h，14000转离心收集碳纳米管并用去离子水将其洗涤至中性，然后置真空干燥箱中于50°C条件下干燥12h ；A-2.将酸处理后的多壁碳纳米管超声0. 分散于pH为1.5的去离子水中，使碳纳米管的终浓度为0. 5mg/mL，然后加入氯化铁、铁氰化钾和氯化钾，使其终浓度分别为 1. 2,2. 6、11. Omg/mL，然后于室温条件下搅拌Mh，收集多壁纳米管复合物并充分洗涤至中性，置真空干燥箱中于50°C条件下干燥1 后即可得到普鲁士蓝修饰的多壁碳纳米管；A-3.称取2. 3mg普鲁士蓝修饰的多壁碳纳米管、80 μ L 3_异氰酸酯基丙基三乙氧基硅烷加入到500 μ LO. 25%的壳聚糖溶液中，在室温条件下剧烈搅拌4h得到掺杂普鲁士蓝修饰的多壁碳纳米管的壳聚糖-二氧化硅溶胶。B.胆碱氧化酶的共价键合将2. 2mg胆碱氧化酶加入到A得到的溶胶中，并于4°C条件下缓慢搅拌1.证，得到共价键合胆碱氧化酶并掺杂普鲁士蓝修饰的多壁碳纳米管的壳聚糖-二氧化硅溶胶。C.敏感膜在玻碳电极表面的制备取6 μ L步骤B得到的溶胶滴到电极表面，并将电极于4°C条件下干燥12h，即可在电极表面形成一层共价键合胆碱氧化酶并掺杂普鲁士蓝修饰的多壁碳纳米管的壳聚糖-二氧化硅溶胶-凝胶敏感膜。以修饰玻碳电极为工作电极，钼丝为对电极，SCE电极作为参比电极，实验温度为室温，测试体系为0. 05M, pH 6. 9的磷酸缓冲溶液，用i_t法在-0. IV (vs. SCE)检测电极对硫代胆碱的响应。该传感器对硫代胆碱具有良好的电化学响应，且灵敏度较高；浓度均为 0. ImM的尿酸和抗坏血酸均未对电极产生干扰；电极的稳定性较高，可保持在一个半月以上。实施例3A.掺杂普鲁士蓝修饰的多壁碳纳米管的壳聚糖-二氧化硅溶胶的制备A-1.按多壁碳纳米管的终浓度为0.5mg/mL将其加入到积比为3 1的浓硫酸和浓硝酸混酸中于室温条件下超声6h，14000转离心收集碳纳米管并用去离子水将其洗涤至中性，然后置真空干燥箱中于50°C条件下干燥12h ；A-2.将酸处理后的多壁碳纳米管超声0. 分散于pH为1.5的去离子水中，使碳纳米管的终浓度为0. 5mg/mL，然后加入氯化铁、铁氰化钾和氯化钾，使其终浓度分别为 1. 2,2. 6、11. Omg/mL，然后于室温条件下搅拌Mh，收集多壁纳米管复合物并充分洗涤至中性，置真空干燥箱中于50°C条件下干燥1 后即可得到普鲁士蓝修饰的多壁碳纳米管；A-3.称取2. 3mg普鲁士蓝修饰的多壁碳纳米管、80 μ L 3_异氰酸酯基丙基三乙氧基硅烷加入到500 μ L 0. 25%的壳聚糖溶液中，在室温条件下剧烈搅拌4h得到掺杂普鲁士蓝修饰的多壁碳纳米管的壳聚糖-二氧化硅溶胶。B.胆固醇氧化酶的共价键合将5. 6mg胆固醇氧化酶加入到A得到的溶胶中，并于4°C条件下缓慢搅拌1. 5h,得到共价键合胆固醇氧化酶并掺杂普鲁士蓝修饰的多壁碳纳米管的壳聚糖-二氧化硅溶胶。C.取6 μ L步骤B得到的溶胶滴到电极表面，并将电极于4°C条件下干燥12h，即可在电极表面形成一层共价键合胆固醇氧化酶并掺杂普鲁士蓝修饰的多壁碳纳米管的壳聚糖-二氧化硅溶胶-凝胶敏感膜。以修饰玻碳电极为工作电极，钼丝为对电极，SCE电极作为参比电极，实验温度为室温，测试体系为0. 05M, pH 6. 9的磷酸缓冲溶液，用i_t法在-0. IV (vs. SCE)检测电极对胆固醇的响应。该传感器对胆固醇具有良好的电化学响应，且灵敏度较高；浓度均为0. ImM 的尿酸和抗坏血酸均未对电极产生干扰；电极的稳定性较高，可保持在一个半月以上。实施例4A.掺杂普鲁士蓝修饰的多壁碳纳米管的壳聚糖-二氧化硅溶胶的制备A-1.按多壁碳纳米管的终浓度为0.5mg/mL将其加入到积比为3 1的浓硫酸和浓硝酸混酸中于室温条件下超声6h，14000转离心收集碳纳米管并用去离子水将其洗涤至中性，然后置真空干燥箱中于50°C条件下干燥12h ；A-2.将酸处理后的多壁碳纳米管超声0. 分散于pH为1.5的去离子水中，使碳纳米管的终浓度为0. 5mg/mL，然后加入氯化铁、铁氰化钾和氯化钾，使其终浓度分别为 1. 2,2. 6、11. Omg/mL，然后于室温条件下搅拌Mh，收集多壁纳米管复合物并充分洗涤至中性，置真空干燥箱中于50°C条件下干燥1 后即可得到普鲁士蓝修饰的多壁碳纳米管；A-3.称取2. 3mg普鲁士蓝修饰的多壁碳纳米管、80 μ L 3_异氰酸酯基丙基三乙氧基硅烷加入到500 μ LO. 25%的壳聚糖溶液中，在室温条件下剧烈搅拌4h得到掺杂普鲁士蓝修饰的多壁碳纳米管的壳聚糖-二氧化硅溶胶。B.乙醇氧化酶的共价键合将5. 6mg乙醇氧化酶加入到A得到的溶胶中，并于4°C条件下缓慢搅拌1. 5h，得到共价键合乙醇氧化酶并掺杂普鲁士蓝修饰的多壁碳纳米管的壳聚糖-二氧化硅溶胶。C.取6 μ L步骤B得到的溶胶滴到电极表面，并将电极于4°C条件下干燥12h，即可在电极表面形成一层共价键合乙醇氧化酶并掺杂普鲁士蓝修饰的多壁碳纳米管的壳聚糖-二氧化硅溶胶-凝胶敏感膜。以修饰玻碳电极为工作电极，钼丝为对电极，SCE电极作为参比电极，实验温度为室温，测试体系为0. 05M, pH 6. 9的磷酸缓冲溶液，用i_t法在-0. IV (vs. SCE)检测电极对乙醇的响应。该传感器对乙醇具有良好的电化学响应，且灵敏度较高；浓度均为0. ImM的尿酸和抗坏血酸均未对电极产生干扰；电极的稳定性较高，可保持在一个半月以上。
权利要求
1.一种电化学生物传感器敏感膜，其特征在于敏感膜是由电子传递体、电子媒介体和共价键合生物活性物质的壳聚糖-二氧化硅溶胶-凝胶组成，其中电子传递体的含量为 0. 05 2. Omg/cm2,电子媒介体的含量为0. Ol 2. Omg/cm2,生物活性物质的含量为0. Ol 2. Omg/cm2，壳聚糖的含量为0. 02 5. Omg/cm2，其余为二氧化硅溶胶-凝胶。
2.根据权利要求1所述的一种电化学生物传感器敏感膜，其特征在于所述的电子传递体为单壁碳纳米管、多壁碳纳米管、富勒烯、金纳米粒子、银纳米粒子、钼纳米粒子、四氧化三铁纳米粒子中的一种；所述的电子媒介体为普鲁士蓝、铁氰化钾、二茂铁、乙酰基二茂铁、丙酰基二茂铁、丁酰基二茂铁、戊酰基二茂铁、己酰基二茂铁、辛酰基二茂铁、1，1'-双乙酰基二茂铁、1，1'-双己酰基二茂铁、乙基二茂铁、丙基二茂铁、丁基二茂铁、戊基二茂铁、己基二茂铁、1，1'-双丁基二茂铁、1，1'-双己基二茂铁、环戊烯基二茂铁、环己烯基二茂铁、3- 二茂铁酰基丙酸、4- 二茂铁酰基丁酸、4- 二茂铁基丁酸、5- 二茂铁基戊酸、二茂铁基甲醇、二茂铁基乙醇、二甲氨基甲基二茂铁、二茂铁甲酸、二茂铁乙酸、二茂铁丙酸、二茂铁酰胺、二茂铁酰氯、二茂铁硫代甲酰胺、氨基二茂铁、萘酚绿B、天青、四氰基对苯二醌二甲烷、四硫富瓦烯、四硫富瓦烯-四氰基二亚甲基苯醌、亚甲基蓝、新亚甲基蓝中的一种；所述的生物活性物质为葡糖糖氧化酶、胆固醇氧化酶、乙醇氧化酶、尿酸氧化酶、黄嘌呤氧化酶、辣根过氧化物酶、酪氨酸酶、肌红蛋白、细胞色素氧化酶、乙酰胆碱酯酶、乳酸脱氢酶、琥珀酸脱氢酶中的一种。
3.根据权利要求1所述的一种电化学生物传感器敏感膜，其特征在于所述的电子传递体和电子媒介体可被二者相互结合后的复合体所替代。
4.一种如权利要求1所述的电化学生物传感器敏感膜的制备方法，具体制备步骤如下A.掺杂电子传递体和电子媒介体的壳聚糖-二氧化硅溶胶的制备按电子传递体和电子媒介体的终浓度分别为为0. 5 lOmg/mL和0. 1 10mg/mL将其超声5 60min分散于0. 1 1.0%的壳聚糖溶液中，然后按体积比为10 1 2 1的比例将电子传递体和电子媒介体的壳聚糖溶液与硅烷偶联剂混合，并在室温条件下剧烈搅拌i ^！得到掺杂电子传递体和电子媒介体的壳聚糖-二氧化硅溶胶；B.生物活性物质的共价键合按生物活性物质的终浓度为0. 1 lOmg/mL将其加入到A得到的溶胶中，并于O 10°C 条件下缓慢搅拌1 4h，得到共价键合生物活性物质并掺杂电子传递体和电子媒介体的壳聚糖-二氧化硅溶胶；C.敏感膜在电极表面的制备按8 400 μ L/cm2将步骤B得到的溶胶滴到电极表面，并将电极于2 10°C条件下干燥5 Mh，即可在电极表面形成一层共价键合生物活性物质并掺杂电子传递体和电子媒介体的壳聚糖-二氧化硅溶胶-凝胶电化学生物传感器敏感膜。
5.根据权利要求1所述的电化学生物传感器敏感膜的制备方法，其特征是步骤A中所述的电子传递体为单壁碳纳米管、多壁碳纳米管、富勒烯、金纳米粒子、银纳米粒子、钼纳米粒子、四氧化三铁纳米粒子中的一种；所述的电子传递体为普鲁士蓝、铁氰化钾、二茂铁、 乙酰基二茂铁、丙酰基二茂铁、丁酰基二茂铁、戊酰基二茂铁、己酰基二茂铁、辛酰基二茂铁、1，1'-双乙酰基二茂铁、1，Γ -双己酰基二茂铁、乙基二茂铁、丙基二茂铁、丁基二茂铁、戊基二茂铁、己基二茂铁、1，1'-双丁基二茂铁、1，1'-双己基二茂铁、环戊烯基二茂铁、环己烯基二茂铁、3- 二茂铁酰基闪酸、4- 二茂铁酰基丁酸、4- 二茂铁基丁酸、5- 二茂铁基戊酸、二茂铁基甲醇、二茂铁基乙醇、二甲氨基甲基二茂铁、二茂铁甲酸、二茂铁乙酸、二茂铁丙酸、二茂铁酰胺、二茂铁酰氯、二茂铁硫代甲酰胺、氨基二茂铁、萘酚绿B、天青、四氰基对苯二醌二甲烷、四硫富瓦烯、四硫富瓦烯-四氰基二亚甲基苯醌、亚甲基蓝、新亚甲基蓝中的一种。
6.根据权利要求1所述的电化学生物传感器敏感膜的制备方法，其特征是步骤A中所述的电子传递体和电子媒介体可被二者相互结合后的复合体所替代。
7.根据权利要求1所述的电化学生物传感器敏感膜的制备方法，其特征是步骤A中所述的壳聚糖溶液为壳聚糖通过超声或搅拌溶解于0. 5 2. 0%的醋酸中的溶液；所述的硅烷偶联剂为3-异氰酸酯基丙基三乙氧基硅烷、3-异氰酸酯基丙基三甲氧基硅烷、3-(2， 3-环氧丙氧)丙基三甲氧基硅烷、3-(2，3-环氧丙氧)丙基三乙氧基硅烷、2-(3，4-环氧环己烷)乙基三甲氧基硅烷、3-(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷中的一种。
8.根据权利要求1所述的电化学生物传感器敏感膜的制备方法，其特征是步骤B中所述的生物活性物质为葡糖糖氧化酶、胆固醇氧化酶、乙醇氧化酶、尿酸氧化酶、黄嘌呤氧化酶、辣根过氧化物酶、酪氨酸酶、肌红蛋白、细胞色素氧化酶、乙酰胆碱酯酶、乳酸脱氢酶、 琥珀酸脱氢酶中的一种。
9.根据权利要求1所述的电化学生物传感器敏感膜的制备方法，其特征是步骤C中所述的电极为玻碳电极、金电极、钼电极、热解石墨电极、石墨碳糊电极中的一种。
全文摘要
本发明涉及一种共价键合生物活性物质并掺杂电子传递体和电子媒介体的壳聚糖-二氧化硅溶胶-凝胶电化学生物传感器敏感膜及其制备方法。通过硅烷偶联剂的溶胶-凝胶过程及其与生物活性物质以及壳聚糖的共价偶联，将生物活性物质共价键合于同步形成的壳聚糖-二氧化硅溶胶-凝胶三维网孔结构中。同时将电子传递体和电子媒介体掺杂到其中。同现有技术相比，本发明提供的电化学生物传感器敏感膜对传感器的稳定性、选择性和灵敏度都有显著提高。
文档编号G01N27/327GK102590305SQ20111000493
公开日2012年7月18日 申请日期2011年1月12日 优先权日2011年1月12日
发明者付光磊, 岳秀丽, 戴志飞 申请人:哈尔滨工业大学