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专利名称：抗孕酮的单克隆抗体与产生该单克隆抗体的杂交瘤细胞及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种抗孕酮的单克隆抗体、产生该单克隆抗体的杂交瘤细胞及其应用，特别是在检测人体孕激素水平中的应用。
背景技术：
孕酮(Progesterone)是由卵巢黄体分泌的一种天然孕激素,在体内对雌激素激发过的子宫内膜有显著的形态学影响，为维持妊娠所必需，临床用于先兆性流产、习惯性流产等闭经或闭经原因的反应性诊断等。孕酮是女性分泌的一种重要的天然激素，这种激素对于女性来说的作用非常大，它能够维持黄体激素分泌，帮助女性生育能够顺利进行，还可以配合雌激素，对于孕期的其它方面发挥作用。
血清/血浆孕酮检测的临床应用主要包括以下几个方面1、血中孕酮升高可见于以下情况(a)观察妇女排卵的时间及黄体酮的生成情况，在排卵的_1，0，+1天，孕酮含量成倍增加，提示为有排卵；(b)正常妊娠、双胎和多胎妊娠时孕酮合成量明显增加，血液中孕酮水平相对升高；(C)妊娠毒血症、先兆子痫、葡萄胎及原性高血压时,孕酮含量也会升高。2、血中孕酮含量降低见于以下情况(a)先兆流产、宫外孕、早产、闭经、不孕症；(b)黄体功能不全，卵巢黄体发育不全时，孕酮含量相应降低；(c)肾上腺、甲状腺功能严重失调也可影响卵巢功能，使排卵发生障碍，孕酮含量也会相应降低。目前，检测孕酮的方法包括胶体金试纸条检测法、化学发光法、放射性免疫法(RIA)和酶联免疫吸附试验(Elisa)，这些方法都涉及到孕酮抗原和孕酮抗体两大核心免疫试剂。由于孕酮属于小分子物质(分子量为314. 5Da)，只具有抗原性，而无免疫原性。因此，必需将孕酮与载体蛋白偶联后制成完全抗原再通过免疫动物来制备抗体，这就增加了检测的步骤和复杂程度，造成检测灵敏度的下降。如中国专利CN101066998公开了制备甲羟孕酮醋酸酯特异性抗体的制备方法，该方法即是通过先制备半抗原，然后将得到的半抗原与蛋白质偶联制备完全抗原，然后再免疫动物从而得到特异性抗体，但该方法存在着步骤较为繁琐的缺陷。

发明内容
本发明即是针对目前孕酮检测方法中存在的上述不足之处，提供一种特异性和亲和力高的单克隆抗体与产生该单克隆抗体的杂交瘤细胞及其应用。本发明的思路在于采用孕酮完全抗原免疫动物，达到理想效价后进行细胞融合，从而筛选异性较高的细胞单株，该细胞单株能够持续分泌单克隆抗体，便于进行孕酮的检测，从而为检测孕酮的试剂盒研发奠定了基础。本发明的目的之一是提供一种特异性分泌抗孕酮单克隆抗体的杂交瘤细胞株，该杂交瘤细胞株于2012年11月9日保藏于中国北京的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)(地址北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCC NO. 6803，分类命名为孕酮单克隆抗体杂交瘤细胞株。本发明的另一个目的是提供该杂交瘤细胞株的制备方法，该方法包括如下的步骤1、动物免疫采用孕酮衍生物P4-11 a -半琥珀酸酯-BSA作为免疫抗原免疫BALB/c小鼠，检测免疫鼠血清效价，效价达到1:1OW即可做细胞融合；2、细胞融合取免疫小鼠脾脏细胞与骨髓瘤细胞株Sp2/0，在50%PEG1450下进行融合；
3、阳性检测用检测抗原P-3-CM0-BSA包被酶标板，检测到阳性细胞后进行亚克�。�3飞次亚克隆达到100%的阳性率；4、抗体纯化在预先注射石蜡油致敏的BALB/c小鼠腹腔接种已建株的杂交瘤细胞，采集腹水并离心得上清后用SDS-PAGE电泳鉴定纯度；5、抗体的鉴定与杂交瘤细胞株的筛选和保藏将稳定分泌抗孕酮单克隆抗体的杂交瘤细胞株制备腹水，纯化抗体，得到纯化抗体后检测抗体效价，筛选出表达高亲和性抗体的杂交瘤细胞株，并对该细胞株进行保藏。进一步的，本发明所述的杂交瘤细胞株的制备方法，包括如下的步骤1、动物免疫P4-11 a -半琥珀酸酯-BSA作为免疫抗原免疫BALB/c小鼠，首次免疫，50 U g/只的抗原加等体积完全福氏佐剂，采用皮下注射；4周后，第二次免疫，用25 y g/只的抗原加等体积不完全福氏佐剂，皮下注射；2周后，第三次免疫，用25 y g/只的抗原加等体积不完全福氏佐剂，皮下注射，7-10天后，ELISA法检测免疫鼠血清效价，效价达到1:1Off即可准备做细胞融合；2、细胞融合取免疫小鼠脾脏细胞(I X IO8个细胞)与骨髓瘤细胞株Sp2/0 (1父107个细胞％)，在50%PEG1450作用下进行常规融合，融合细胞用HAT培养基作选择性培养，7d后改用HT培养基，14d后改用DMEM培养基培养(20%小牛血清)；3、阳性检测用包被浓度为200ng/ml的检测抗原P-3_CM0_BSA包被酶标板，96孔细胞培养板的每个待检孔取IOOul加入包被好的酶标板，检测到阳性细胞再进行亚克�。�3飞次亚克隆直到达到100%的阳性率；4、抗体纯化在预先I周注射0. 5ml/只石蜡油的致敏BALB/c小鼠腹腔接种已建株的杂交瘤细胞数为106，7 IOd后采集腹水并离心得上清，腹水上清按1:10稀释于PBS中，并以0. 5ml/min上样于经PBS平衡的HiTrap Protein G亲和层析柱中，用PBS洗杂，再用pH2. 9甘氨酸缓冲液洗脱后用SDS-PAGE电泳鉴定纯度；5、抗体的鉴定与杂交瘤细胞株的筛选和保藏
得到纯化抗体后，将稳定分泌抗孕酮单克隆抗体的杂交瘤细胞株制备腹水，纯化抗体，得到纯化抗体后，用ELISA法检测抗体效价，然后再用竞争ELISA法检测各抗体的效价，从中筛选出表达高亲和性抗体的杂交瘤细胞株，并对该细胞株进行保藏。更进一步的，在上述方法步骤5中，竞争ELISA法包括下述的步骤I)用浓度为0. 01mol/L、pH9. 6的碳酸盐缓冲液将抗原稀释至200ng/ml后包被酶标板，4 °C过夜； 2)用 PBS/T20 洗板 3 次，每次 3min ；3)用含5%小牛血清的PBS/T20封闭，37°C孵育lh，洗板；4)每孔加入0、1、4、10、20和40ng/ml孕酮的人血清50ul后，再加入浓度为50ii g/ml的纯化抗体50ul，37°C孵育45min，洗板3次；5)加入稀释比例为1:2000的HRP-羊抗鼠100ul，37°C孵育30min，洗板3次；6)加入TMB显色液，37°C避光反应15min后，加人终止液，读取波长为450nm时的OD值。本发明的再一个目的是提供由上述保藏号为CGMCC NO. 6803的杂交瘤细胞株所分泌的单克隆抗体，该抗体具有高度的特异性和亲和性，能够与孕酮结合，从而进行检测。本发明的再一个目的是提供由上述杂交瘤细胞所分泌的单克隆抗体在检测人体孕酮水平中的应用，包括但不限于将该单克隆抗体用于制备检测人体孕酮水平的试剂盒。本发明得到的抗体能够特异性且高亲合性地与孕酮结合，因此可以用在检测孕酮水平的试剂盒中。本发明所述的抗孕酮的单克隆抗体具有特异性和亲合力高的优点，经保藏后的杂交瘤细胞能够稳定地分泌此种单抗，便于进行检测试剂盒的制备，为临床大规模试剂盒的生产奠定了基础。


图1是保藏号为CGMCC NO. 6803的杂交瘤细胞株所分泌的抗体的竞争性ELISA法检测的抗体浓度和OD值的关系曲线。
具体实施例方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不违反本发明精神实质的范围内，本领域的一般技术人员无需创造性的劳动，对本发明所述的技术方案进行适当的改进，包括对反应试剂、反应条件的改动和改进都在本发明所要求保护的技术方案之内。实施例1抗原免疫及细胞融合筛选1.1 材料1.1.1 试剂 P4-11 a -半琥珀酸酯-BSA、P-3-CM0_BSA 购自 Fitzgerald 公司；动物6周龄，雌性，BALB/c小鼠，购自协和医科大学实验动物中心。SP2/0骨髓瘤细胞购自中国医学科学院基础医学研究所。1.1. 2HisTrap HP、HiTrap Protein G 柱购自 GE ;弗氏佐剂、50% 聚乙二醇(PEG)1450溶液、HAT、HT以及辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗小鼠IgG、四甲基联苯胺(TMB)、孕酮(Progesterone)纯度>90%均为Sigma产品；DMEM培养基为Gibco产品；新生牛血清购于杭州四季清生物工程有限公司。1. 2 方法1. 2.1动物免疫P4-11 a -半琥珀酸酯-BSA作为免疫抗原，选用6周龄、雌性BALB/c小鼠。首次免疫，50 ii g/只的抗原加等体积完全福氏佐剂，采用皮下注射；4周后，第二次免疫，用25ii g/只的抗原加等体积不完全福氏佐剂，皮下注射；2周后，第三次免疫，用25iig/只的抗原加等体积不完全福氏佐剂，皮下注射，7- 10天后，ELISA法检测免疫鼠血清效价，效价达到1:1OW即可准备做细胞融合。如果效价比较低，则2周后继续进行第四次免疫，免疫剂量及方式同第三次免疫一致，直至尾血效价检测达到1:1OW左右。细胞融合前3天，再用25iig抗原腹腔注射以加强免疫。1. 2. 2细胞融合取免疫小鼠脾脏细胞(I X IO8个细胞)与骨髓瘤细胞株Sp2/0 (1父107个细胞％)，在50%PEG1450作用下进行常规融合。融合细胞用HAT培养基作选择性培养，7d后改用HT培养基，14d后改用DMEM培养基培养(20%小牛血清)。1. 2. 3阳性检测用检测抗原P-3-CM0-BSA (包被浓度为200ng/ml)包被酶标板，96孔细胞培养板的每个待检孔取IOOul加入包被好的酶标板，检测到阳性细胞再进行亚克�。�3-5次亚克隆直到达到100%的阳性率。1. 3 结果小鼠二免后效价为1:30000，三免后效价为1:100000，四免后效价为1:120000。四免后进行细胞融合，融合板铺板10板，融合率为90%。经过对阳性杂交瘤细胞株进行4-5次有限稀释克�。诤仙秆〉窖粜缘ブ�23株，这23株抗体可以与包被抗原酶联反应呈阳性。实施例2抗体的纯化和鉴定2.1抗体的纯化在预先I周注射石蜡油(0. 5ml/只)致敏的BALB/c小鼠腹腔接种已建株的杂交瘤细胞数为106，7-10d后采集腹水并离心得上清。腹水上清按1:10稀释于PBS中，并以0. 5ml/min上样于经PBS平衡的HiTrap Protein G亲和层析柱中。用PBS洗杂,再用甘氨酸缓冲液(pH2. 9)洗脱，用SDS-PAGE电泳鉴定纯度。2. 2抗体的鉴定竞争法ELISA检测方案用浓度为0. Olmol/L、pH9. 6的碳酸盐缓冲液将抗原稀释至200ng/ml后包被酶标板，4°C过夜；用PBS/T20洗板3次，每次3min ;用含5%小牛血清的PBS/T20封闭，37°C孵育lh，洗板；每孔加入0、1、4、10、20和40ng/ml孕酮的人血清50ul后，再加入纯化抗体50ul (浓度为50ii g/ml)，37°C孵育45min，洗板3次；加入HRP-羊抗鼠IOOul(稀释比例为1:2000)，37°C孵育30min，洗板3次；加入TMB显色液，37°C避光反应15min后，加人终止液；读取波长为450nm时的OD值。实施例3
杂交瘤细胞株的筛选3.1抗体的筛选获得单抗后是否能应用于试剂盒研发生产的要求，需要将23株稳定分泌抗孕酮单克隆抗体的杂交瘤细胞株制备腹水，纯化抗体。得到纯化抗体后，ELISA检测抗体效价，23株抗体的效价在1: 6W-1:20W之间；3. 2杂交瘤细胞株的筛选通过竞争ELISA法检测23株抗体，其中有5株有反应梯度，但是只有一株(PDl)得以达到最低检测限不大于0. 5ng/ml (结果见表1)，PD1株所分泌的抗体浓度和OD值的关系见附图1 (其中，纵坐标为抗体浓度ng/ml，横坐标为OD值)，由表I和附图1可见，该株系分泌的抗孕酮的单克隆抗体完全可以超越国内试剂盒的标准。这可以大量制备抗体，从而进行试剂盒研发及生产。 表I不同细胞株所分泌抗体的浓度和OD值的关系
权利要求
1.一种分泌抗孕酮的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，该杂交瘤细胞的保藏号为CGMCCNO. 6803。
2.权利要求1所述的杂交瘤细胞株的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下的步骤 1)动物免疫 采用孕酮衍生物P4-11 α -半琥珀酸酯-BSA作为免疫抗原免疫BALB/c小鼠，检测免疫鼠血清效价，效价达到1:1Off即可做细胞融合； 2)细胞融合 取免疫小鼠脾脏细胞与骨髓瘤细胞株Sp2/0，在50%PEG1450下进行融合； 3)阳性检测 用检测抗原P-3-CMO-BSA包被酶标板，检测到阳性细胞后进行亚克�。�3飞次亚克隆达到100%的阳性率； 4)抗体纯化 在预先注射石蜡油致敏的BALB/c小鼠腹腔接种已建株的杂交瘤细胞，采集腹水并离心得上清后用SDS-PAGE电泳鉴定纯度； 5)抗体的鉴定与杂交瘤细胞株的筛选和保藏 将稳定分泌抗孕酮单克隆抗体的杂交瘤细胞株制备腹水，纯化抗体，得到纯化抗体后检测抗体效价，筛选出表达高亲和性抗体的杂交瘤细胞株，并对该细胞株进行保藏。
3.根据权利要求2所述的杂交瘤细胞株的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下的步骤 1)动物免疫 P4-11 α -半琥珀酸酯-BSA作为免疫抗原免疫BALB/c小鼠，首次免疫，50 μ g/只的抗原加等体积完全福氏佐剂，采用皮下注射；4周后，第二次免疫，用25 μ g/只的抗原加等体积不完全福氏佐剂，皮下注射；2周后，第三次免疫，用25μ g/只的抗原加等体积不完全福氏佐剂，皮下注射，7-10天后，ELISA法检测免疫鼠血清效价，效价达到1:1Off即可准备做细胞融合； 2)细胞融合 取免疫小鼠脾脏细胞与骨髓瘤细胞株Sp2/0，在50%PEG1450作用下进行常规融合，融合细胞用HAT培养基作选择性培养，7d后改用HT培养基，14d后改用DMEM培养基培养； 3)阳性检测 用包被浓度为200ng/ml的检测抗原P-3-CMO-BSA包被酶标板，96孔细胞培养板的每个待检孔取IOOul加入包被好的酶标板，检测到阳性细胞再进行亚克�。�3飞次亚克隆直到达到100%的阳性率； 4)抗体纯化 在预先1周注射O. 5ml/只石蜡油的致敏BALB/c小鼠腹腔接种已建株的杂交瘤细胞数为106，7 IOd后采集腹水并离心得上清，腹水上清按1:10稀释于PBS中，并以O. 5ml/min上样于经PBS平衡的HiTrap Protein G亲和层析柱中，用PBS洗杂，再用pH2. 9甘氨酸缓冲液洗脱后用SDS-PAGE电泳鉴定纯度； 5)抗体的鉴定与杂交瘤细胞株的筛选和保藏得到纯化抗体后，将稳定分泌抗孕酮单克隆抗体的杂交瘤细胞株制备腹水，纯化抗体，得到纯化抗体后，用ELISA法检测抗体效价，然后再用竞争ELISA法检测各抗体的效价，从中筛选出表达高亲和性抗体的杂交瘤细胞株,并对该细胞株进行保藏。
4.根据权利要求3所述的杂交瘤细胞株的制备方法，其特征在于，步骤5)中，所述竞争ELISA法包括下述的步骤 1)用浓度为O.01mol/L、pH9. 6的碳酸盐缓冲液将抗原稀释至200ng/ml后包被酶标板，4°C过夜； 2)用PBS/T20洗板3次，每次3min； 3)用含5%小牛血清的PBS/T20封闭，37°C孵育lh，洗板； 4)每孔加入0、1、4、10、20和40ng/ml孕酮的人血清50ul后，再加入浓度为50μ g/ml的纯化抗体50ul，37°C孵育45min，洗板3次； 5)加入稀释比例为1:2000的HRP-羊抗鼠100ul，37°C孵育30min，洗板3次； 6)加入TMB显色液，37°C避光反应15min后，加人终止液，读取波长为450nm时的OD值。
5.权利要求1所述的杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体。
6.权利要求5所述的单克隆抗体在检测人体孕酮水平中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于所述的单克隆抗体在制备检测人体孕酮水平的试剂盒中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种高特异性和亲合力的抗孕酮的单克隆抗体、产生该单克隆抗体的杂交瘤细胞以及其应用，特别是在检测人体孕激素水平中的应用。本发明采用孕酮完全抗原免疫动物，达到理想效价后进行细胞融合，然后筛选异性较高的细胞单株并进行保藏，该细胞单株能够持续分泌单克隆抗体，便于进行孕酮的检测，从而为检测孕酮的试剂盒研发奠定了基础。
文档编号G01N33/74GK102994453SQ20121052409
公开日2013年3月27日 申请日期2012年12月7日 优先权日2012年12月7日
发明者不公告发明人 申请人:北京利德曼生化股份有限公司