检测结核分支杆菌抗体的胶体金试剂及其制备方法-山东亚星游戏官网机床有限公司

专利名称：：检测结核分支杆菌抗体的胶体金试剂及其制备方法
技术领域：
：本发明属临床医学免疫诊断胶体金试剂及其制备方法，具体涉及一种检测结核分支杆菌抗体的胶体金试剂及其制备方法。技术背景结核病是全球感染性疾病中的第一杀手，近年来结核病的发病率有上升的趋势，及时发现、准确诊断、切断传染源是最有效的防治手段，所以结核病的实验室诊断成为临床医生诊断结核病，判断疗效和评估愈后不可缺少的依据和手段。1971年，Faulk和Taylor(Immunochem，8:1081，1971)首先使用免疫胶体金作为标记物用于免疫电镜技术，此后免疫胶体金技术作为一种新的免疫学方法得到了广泛的应用。用还原法可方便地从氯金酸制备各种不同粒径的胶体金颗粒，Frens介绍的方法最为常用Nature(Phys.Sci.)241:20，1973，以柠檬酸三钠为还原剂得到的10~70nm胶体金颗粒是临床诊断试剂中最常用的大小范围，粒径大小受柠檬酸三钠的加入量决定。胶体金颗粒对蛋白质有很强的吸附能力，可以与葡萄球菌A蛋白、免疫球蛋白、毒素、糖蛋白、酶、激素、病毒或细菌抗原等非共价结合，形成免疫胶体金缀合物，用于免疫检测。免疫胶体金技术在中国卫生部高等医药院校规划教材"免疫学和免疫学检验"(陶义训主编，第二版，北京，人民卫生出版社，1997)中已列为一个章节，该章节具体介绍了免疫胶体金在医学检验中最常使用的二个方法(1)免疫胶体金斑点渗滤试验(2)免疫胶体金层析试验。该章节强调了稳定剂对免疫胶体金的重要性，介绍了国内外常应用的各种稳定剂牛血清白蛋白(BSA)、葡聚糖(Dextran)、聚乙二醇20000(PEG)、明胶(gelatin)。目前普遍使用聚乙二醇20000(PEG)作为稳定剂。目前，美国Sigama公司供应2,2'-[(l-甲基亚乙基)双(4，l一亚苯基甲醛)]双环氧乙烷聚乙二醇衍生化合物PoIy(ethyleneglycol),compoundwith2，2'-[(l-methylethylidene)bis(4,l-phenyleneoxumethylene)]bisoxirane产品编号P2263，mp59。C，白色片状结晶，溶于水，分子量1500020000。近10年来免疫胶体金法定性检测体液中的抗原和抗体己在国外广泛应用，因其方法快速、操作简便而广受欢迎。国内外质量较好的胶体金法结核抗体(TB-Ab)定性检测可在痰涂片阳性结核患者中有90%以上的阳性率，在痰涂片阴性的结核病人中有60%左右的阳性率，正常人群中假阳性在5%左右，目前美国用PCR方法(聚合酶链分子扩增技术)在结核感染病人的样品直接检测中也只不过达到类似的准确率。上述公认的结果表明，快速简便的金标法定性检测结核抗体是结核分枝杆菌感染的重要辅助诊断或筛查指标，而且提示结核病人结核抗体的水平与排菌量有关。日本科学家最近的研究结果也证实了结核抗体水平与排菌量有关。结核抗体的测定在临床治疗的动态观察上也能提供一项有意义的指标。胶体金试剂的稳定性是关键，标记物的稳定性是测定中的最重要保障。稳定剂的筛选、免疫胶体金的缀合工艺及冻干形式可以延长其有效期。但免疫胶体金的胶体性能使它在冻干中会发生破乳现象，严重的破乳会造成肉眼可见的颗粒凝聚。轻度的破乳引起的微量颗粒凝聚，在检测过程中因直径增大而通不过微孔纤维膜，滞留在膜上的红色凝聚颗粒就误报为假阳性的结果。
发明内容本发明要解决的技术问题是在抗原包被胶体金时具有特色的缀合技术及冻干技术来克服液相免疫胶体金稳定性差以及胶体金试剂制备中的破乳现象，提供一种具有良好稳定性，能检测结核分支杆菌抗体的胶体金试剂。本发明的一种检测结核分支杆菌(TB)抗体的胶体金试剂，包括(1)TB抗原包被胶体金，抗原包被浓度为0.03~0.07mg/ml;(2)质量百分数为57%的蔗糖；(3)2mg/ml2,2，-[(l-甲基亚乙基)双(4,1-亚苯基甲醛)]双环氧烷聚乙二醇衍生化合物(Poly(ethyleneglycol),compoundwith2,2，-[(l-methylethylldene)bis(4,1-phenyleneoxumethylene)]bisoxirane)。所述TB抗原是结核分枝杆菌标准株(H37Rv)膜蛋白抗原，经SDS—PAGE分析分子量应在38Kda左右，纯度大于85%以上，用ELISA法测定其抗原效价〉1:10，000以上。本发明的检测结核分支杆菌抗体的胶体金试剂的制备方法，包括如下歩骤(1)制备TB抗原结合杆菌H37Rv3637匸培养后，经体积百分数为5%的甲醛灭活，超声裂解，经表面活性剂抽提后，经SephadexG—200分子筛纯化得膜蛋白抗原；(2)制备TB抗原包被胶体金按常规制备空白的胶体金，以TB抗原包被胶体金，抗原包被浓度为0.03~0.07mg/ml，离心作结合/游离分离，得TB抗原包被胶体金(即胶体金抗原缀合物)；(3)制备胶体金溶液离心作结合/游离分离后的TB抗原包被胶体金沉淀，用原体积1/5的10~20mM磷酸盐缓冲液pH7.4悬�。渲校没撼逡褐泻柿堪俜质�57%的蔗糖和2mg/ml2，2'-[(1-甲基亚乙基)双(4，1-亚苯基甲醛)]双环氧垸聚乙二醇衍生化合物；(4)制备胶体金试剂将胶体金溶液在-4(TC预冻，即可。所述步骤(1)中的表面活性剂是SDS或TritonX—100。所述步骤(2)中的空白胶体金，在pH6.46.7时，粒径是1825nm，A52()nm=0.85~1.30之间。使用胶体金试剂的结核分支杆菌抗体金标快速试剂盒(TB-DOT)的临床测试结果如下分别从北蔡卫生院，徐汇区中心医院收集正常人体检血清标本共120例，从上海市第一肺科医院收集痰涂片阳性病人血清标本共24例，按TB抗体测定歩骤操作，在TB—DOT曲线下测得结果见表l;以正常人体检血清标本测试结果平均值+2SD作为TB抗体阴性的上限，则痰涂阳性结核病人阳性率91.7%(22/24)，如表2。表l正常人体检血清标本测试结果(n=120)<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>表2痰涂阳性结核病人血清标本测试结果(n=24)<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>Tn值89891.7%(22/24)Unit5991.7%(22/24)有益效果利用斑点免疫金渗滤试验(DIGFA)原理，用于人血清中结核分枝杆菌抗体的检测，适合于结核病的辅助诊断。具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。实施例lTB抗原的制备菌株来源于美国疾病控制中心(CDC)，经中国药品生物制品检定所检定，菌株为结核分枝杆菌标准株H37Rv，标准号为ATCC27294。建库以购自美国的菌株为原代，冻干保存。传种次培养10株，冻干后为祖代。再由祖代传种30支，作为生产库工作批号株，冻干保存。每个工作批号株允许连续次培养传代3次。生产取工作批号株一支，复活，接种于结核培养基斜面，收集一定量后，再大量传种到自制的琼脂平板培养基中，37'C培养4周。收集菌落后，用5%甲醛灭活，离心，取沉淀物，超声波粉碎，用SDS、TritonX—100等表面活性剂抽提。上清液经SephadexG—200分子筛纯化后，测定效价，要求ELISA〉1:10,000以上；取上清液，测定蛋白浓度，分装45mg/ml，-20°。低温保存。抗原检定试验-1)HPLC检测分子筛出峰图，小样分析；2)SephadexG—200纯化结核杆菌膜蛋白，取第I峰，上样液C=1215mg/ml，上样量1520ml;3)ELISA检测第I峰效价ELISA效价应在1:10,000以上。4)取上述纯化第I峰，经SDS—PAGE电泳分析，分子量MW应在38kDa左右，且电泳区带主要为一条区带。5)纯度检测纯度应大于85%以上。实施例2胶体金试剂制备用经典的氯化金——柠檬酸三钠方法制备胶体金，粒径为20.5nm，所测pH6.6，520nm测得吸光度值八52()=1.06。以TB抗原包被胶体金，抗原包被浓度0.03mg/ml，离心作结合/游离分离。离心分离后的TB抗原包被胶体金沉淀，以原体积1/5的含2mg/ml2，2，-[(l-甲基亚乙基)双(4,1-亚苯基甲醛)]双环氧烷聚乙二醇衍生化合物、质量百分数为5%的蔗糖的10mMpH7.4磷酸盐缓冲液悬浮后，在-4(TC预冻，即可。实施例3胶体金试剂制备用经典的氯化金——柠檬酸三钠方法制备胶体金，粒径为22nm，所测pH6.5，520nm测得吸光度值A52o二1.25。以TB抗原包被胶体金，抗原包被浓度0.06mg/ml，离心作结合/游离分离。离心分离后的TB抗原包被胶体金沉淀，以原体积1/5的含2mg/ml2,2'-[(l-甲基亚乙基)双(4，1-亚苯基甲醛)]双环氧烷聚乙二醇衍生化合物、质量百分数为7。/。的蔗糖的20mMpH7.4磷酸盐缓冲液悬浮后，在-4(TC预冻，即可。权利要求1.一种检测结核分支杆菌抗体的胶体金试剂，包括(1)TB抗原包被胶体金，抗原包被浓度为0.03～0.07mg/ml；(2)质量百分数为5～7％的蔗糖；(3)2mg/ml2，2’-[(1-甲基亚乙基)双(4，1-亚苯基甲醛)]双环氧烷聚乙二醇衍生化合物。2.根据权利要求1所述的检测结核分支杆菌抗体的胶体金试剂，其特征在于所述TB抗原是结核分枝杆菌标准株H37Rv膜蛋白抗原，分子量为38Kda。3.检测结核分支杆菌抗体的胶体金试剂的制备方法，包括如下步骤(1)制备TB抗原结合杆菌H37Rv3637'C培养后，经体积百分数为5%的甲醛灭活，超声裂解，经表面活性剂抽提后，经SephadexG—200分子筛纯化得膜蛋白抗原；(2)制备TB抗原包被胶体金按常规制备空白的胶体金，以TB抗原包被胶体金，抗原包被浓度为0.03~0.07mg/ml，离心作结合/游离分离；(3)制备胶体金溶液离心作结合/游离分离后的TB抗原包被胶体金沉淀，用原体积1/5的10~20mM磷酸盐缓冲液pH7.4悬�。渲校没撼逡褐泻柿堪俜质�57%的蔗糖和2mg/ml2,2'-[(1-甲基亚乙基)双(4,1-亚苯基甲酸)]双环氧烷聚乙二醇衍生化合物；(4)制备胶体金试剂将胶体金溶液在-4(TC预冻，即可。4.根据权利要求3所述的检测结核分支杆菌抗体的胶体金试剂的制备方法，其特征在于所述歩骤(1)中的表面活性剂是SDS或TritonX—lOO。5.根据权利要求3所述的检测结核分支杆菌抗体的胶体金试剂的制备方法，其特征在于所述步骤(2)中的空白胶体金，在pH6.46.7时，粒径是1825nm，A52Qnm=0.851.30之间。全文摘要本发明涉及一种检测结核分支杆菌(TB)抗体的胶体金试剂及其制备方法，该试剂包括TB抗原包被胶体金；蔗糖和2，2′-[(1-甲基亚乙基)双(4，1-亚苯基甲醛)]双环氧烷聚乙二醇衍生化合物；制备离心作结合/游离分离后的TB抗原包被胶体金沉淀，用原体积1/5的10～20mM磷酸盐缓冲液pH7.4悬�。渲校没撼逡褐泻柿堪俜质�5～7％的蔗糖和2mg/ml2，2′-[(1-甲基亚乙基)双(4，1-亚苯基甲醛)]双环氧烷聚乙二醇衍生化合物，在-40℃预冻，即可。本发明是一种具有良好稳定性，能检测结核分支杆菌抗体的胶体金试剂。文档编号G01N33/532GK101329340SQ200810041040公开日2008年12月24日申请日期2008年7月25日优先权日2008年7月25日发明者徐建新申请人:上海奥普生物医药有限公司

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