专利名称：一种实时荧光定量rt-pcr检测csfv的方法
技术领域：
本发明涉及检测技术领域，特别涉及一种可以精确、特异、快速检测CSFV的方法。
背景技术：
猪瘟(swine fever，SF)，又称猪霍乱(hog cholera, HC)、烂肠瘟，在欧洲则被称为古典猪瘟(classical swine fever，CSF)，是世界上养猪业的一种重要的传染�。欢雀硪荡戳搜现氐木盟鹗А６杂贑SF的传统诊断方式主要有动物试验、免疫荧光试验、血清中和试验、ELISA、 单克隆抗体试验。动物试验是检测猪瘟病毒的敏感方法，但是检测时间较长且目前存在流行的猪瘟病毒大多为低毒力病毒株即使接种也不呈现出典型猪瘟症状；免疫荧光试验方法较为特异，但是在实际检测应用过程中此项技术要求具有荧光抗体、荧光显微镜以及检验者较高的检测技术；血清中和试验和ELISA试验除检测时间较长外，均难以鉴别疫苗抗体和感染后产生的抗体，很容易出现假阳性；单克隆抗体技术特异性较强，但是操作起来过程复杂，成本较高，不适应于大批量样品诊断的要求。因此，现有技术还有待于改进和发展。
发明内容
鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种实时荧光定量RT-PCR检测CSFV的方法，旨在解决现有技术中所存在的问题。本发明的技术方案如下
一种用于实时荧光定量RT-PCR检测CSFV的特异性引物，其中，CSFV特异性引物序列如 SEQ NO. 1-2 所示。一种用于实时荧光定量RT-PCR检测CSFV的特异性探针，其中，CSFV特异性探针序列如SEQ NO. 3所示。根据权利要求2所述的用于实时荧光定量RT-PCR检测CSFV的特异性探针，其中， 所述CSFV特异性探针的5'端标记发光基团FAM，3'端标记泯灭基团BHQl。一种使用上述的特异性引物和特异性探针的实时荧光定量RT-PCR检测CSFV的方法，其中，包括以下步骤
S100、样品的预处理对采集的样品分别进行编号，在样品中加适量青、链霉素双抗溶液，勻浆，取上清，4°c过夜；
S200、RNA提取对采集的样品提取RNA ；
S300、CSFV的实时荧光定量RT-PCR反应以上述步骤所提取的RNA为模板，加入CSFV 的特异性引物和特异性探针，使用TAKARA公司的一步法RT-PCR试剂盒进行PCR扩增； S400、根据CSFV实时荧光定量RT-PCR反应结果，鉴定样品中是否含有CSFV。5、根据权利要求4所述的实时荧光定量RT-PCR检测CSFV的方法，其特征在于， 所述步骤S300中的实时荧光定量RT-PCR反应体系为25 μ L，每条特异性引物终浓度为0. 2 μ mol/L,特异性探针浓度为0. 1 μ mol/L ；
反应条件为 42°C 30min，92°C 2min，92°C 10s，55°C 30s,40 个循环。有益效果本发明在ABI 7500 fast real-time PCR仪的基础上建立了快速、灵敏、特异检测CSFV的荧光RT-PCR方法。经过对本发明所建立的方法进行了特异性、灵敏度的验证，结果显示本方法可以较好的将CSFV同口蹄疫病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪呼吸与繁殖障碍综合征病毒和2型猪圆环病毒区分开，且灵敏度可以达到10拷贝数的数量级。 另外，本发明所建立的方法整个反应过程是闭管操作，在最大程度上减少了体系的污染。本发明在诊断时间上同传统方法相比自获得待检样品到提取核酸，配制荧光定量RT-PCR反应体系，直到出现反应结果，整个过程可以在2. 5h内完成，在保证检验结果的基础上大大缩短了检验所需时间。
图1是实时荧光定量RT-PCR检测CSFV的灵敏度试验结果曲线图，从左到右的曲线的稀释倍数依次是106、105、104、103、102、10。图2是实时荧光定量RT-PCR检测CSFV的特异性扩增荧光曲线。图3是本发明实施例1中实时荧光定量RT-PCR检测CSFV的结果图。
具体实施例方式本发明提供一种实时荧光定量定量RT-PCR检测CSFV的方法，为使本发明的目的、 技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。本发明的目的是提供一种实时荧光定量RT-PCR检测猪瘟病毒的方法。本发明方法的灵敏度经验证后可达到10个拷贝数的数量级。同时可以很好的将猪瘟病毒与口蹄疫病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪呼吸与繁殖障碍综合征和2型猪圆环病毒区分开，证明特异性良好。在ABI 7500 fast real-time PCR仪上实施本发明方法操作简单，污染性�。槊艨焖伲踊袢〈煅分良觳獬鼋峁稍�2. 5h内完成，在保证对猪瘟病毒检测准确性的前提下大大缩短了检测时间。本发明的用于实时荧光定量RT-PCR检测CSFV的方法的确立过程如下
1、特异性引物、探针设计在GenBank中下载多个CSFV基因序列，用CLUSTAL X进行序列分析，找到保守片段用Primer Express 2. 0进行特异性引物、特异性探针设计。2、特异性探针合成由上海英骏生物技术有限公司合成。3、特异性探针处理在特异性探针的5'端标记发光基团FAM，3'端标记泯灭基团 BHQl。4、CSFV及对照病毒核酸的提取取150μ L疫苗，使用OMEGA公司生产的Mag-Bind viral DNA/RNA Kit进行病毒DNA/RNA提�。椒ò凑帐约梁兴得魇榻�。用20 μ L无RNA 酶水溶解提取的DNA/RNA。5、RT_PCR扩增以步骤4中提取CSFV及对照病毒的核酸为模板，使用TaKaRa公司的一步法RT-PCR试剂盒进行扩增，每条特异性引物的终浓度为0. 2 μ mol/L,反应条件为 500C 30min，94°C 2min，94°C 10s，58°C 30s, 72°C 30s, 72°C 7min，设定为 35 个循环。电泳结束后取5μ L在1. 5%琼脂糖凝胶电泳中检测扩增结果。
6、目的基因的克隆、构建重组质粒将步骤5中经RT-PCR扩增后检测到的目的条带胶回收，采用T-A克隆方案克隆至pMDIS-T载体。使用QIAGEN公司的质粒DNA抽提纯化试剂盒抽提重组质粒，操作步骤按照说明书进行，重组质粒送广州英骏公司测序，测序鉴定后作为标准阳性品。7、实时荧光定量RT-PCR方法的建立
(1)实时荧光定量RT-PCR检测CSFV的灵敏度试验在紫外分光光度计上测定重组T载体的0D260值，根据分子量大小和阿佛加德罗常数换算成拷贝数，然后10倍比稀释重组载体，在荧光PCR仪上检测到的重组载体的最少拷贝数即是实时荧光RT-PCR的灵敏度。实时荧光定量RT-PCR检测CSFV的灵敏度试验结果见图1，从左到右的曲线的稀释倍数依次是 106、105、104、103、102、10。(2)实时荧光定量RT-PCR检测CSFV的特异性试验分别以CSFV、口蹄疫病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪呼吸与繁殖障碍综合征和2型猪圆环病毒的核酸为模板做CSFV的特异性荧光RT-PCR反应，同时以健康猪内脏组织提取的核酸为阴性对照。反应体系使用 TAKARA公司的一步法RT-PCR试剂盒，每条特异性引物终浓度为0. 2 μ mol/L,探针浓度为 0. 1 μ mol/L,加入DEPC H2O将每个反应补足到25 μ L。反应条件为42°C 30min, 92°C 2min, 92°C 10s,55°C 30s，40个循环；CSFV特异性试验的结果如图2所示，仅CSFV有扩增曲线。(3)临床样品检测建立的荧光RT-PCR检测方法对15送检的组织样品进行检测， 同时进行病毒分离。8、用于检测CSFV的荧光定量RT-PCR的方法确立。本发明所提供的实时荧光定量RT-PCR检测CSFV的方法具体步骤如下
S100、样品的预处理对采集的样品分别编号进行编号，在样品中加适量青、链霉素双抗溶液，勻浆，取上清，4°C过夜。S200、RNA提取使用Invitrogen公司的TRIzol试剂对采集的样品提取RNA，操作步骤按试剂盒说明书进行。S300、CSFV实时荧光定量RT-PCR反应以上述步骤所提取的RNA为模板，使用 TAKARA公司的一步法RT-PCR试剂盒进行PCR扩增，每条特异性引物终浓度为0. 2 μ mol/ L,特异性探针浓度为0. 1 μ mol/L,加入DEPC H2O将每个反应补足到25 μ L。反应条件为 420C 30min,92°C 2min，92°C 10s，55°C 30s,40个循环。反应所使用的特异性引物序列F 5，-GAGCTCCCTGGGTGGTCTAA-3，，R :5，-AGCATMTCGAGGTGGGCTTCT-3，；特异性探针序列 P FAM-TACAGGACAGTCGTCAGTAGTTC GAC-BHQ 1。S400、根据CSFV实时荧光RT-PCR反应结果，鉴定样品中是否含有CSFV。实施例1
珠海出入境检验检疫局技术中心动物检疫实验室受理一项检疫猪肉组织是否含有猪瘟病毒、蓝耳病病毒、2型圆环病毒、细小病毒、链球菌2型业务，共15批样品，计划使用本发明中所建立荧光RT-PCR方法检测。具体实施步骤如下
1、样品的预处理首先对样品编号1-15。用高压灭菌后的剪刀减去少量组织，加适量青、链霉素双抗溶液，勻浆，取上清，4°C过夜。2、病毒RNA提取使用Invitrogen公司的TRIzol试剂对采集的样品提取RNA，操作步骤按试剂盒说明书进行。
3、CSFV实时荧光定量RT-PCR反应以上述步骤所提取的RNA为模板，使用TAKARA公司的一步法RT-PCR试剂盒，每条特异性引物终浓度为0. 2 μ mol/L,特异性探针浓度为0. lymol/L，加入DEPC H2O将每个反应补足到25 μ L。反应条件为 420C 30min,92°C 2min，92°C 10s，55°C 30s,40个循环。反应所使用的特异性引物序列F 5，-GAGCTCCCTGGGTGGTCTAA-3，，R :5，-AGCATMTCGAGGTGGGCTTC T-3，；特异性探针序列 P FAM-TACAGGACAGTCGTCAGTAGTTCG AC-BHQl。4、结果如图3所示，CSFV实时荧光定量RT-PCR反应中出现2份阳性(2/15)。5、病毒分离按照常规病毒分理操作。结论本发明中荧光RT-PCR检测CSFV方法结果同传统病毒分离结果一致 (2/15)。但是却大大缩短了检测时间，并且本发明方法操作简单，污染性�。挚梢钥古科詹樯秆。阌谠谑导柿俅仓杏τ�。应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
权利要求
1.一种用于实时荧光定量RT-PCR检测CSFV的特异性引物，其特征在于，CSFV的特异性引物序列如SEQ NO. 1-2所示。
2.一种用于实时荧光定量RT-PCR检测CSFV的特异性探针，其特征在于，CSFV的特异性探针序列如SEQ NO. 3所示。
3.根据权利要求2所述的用于实时荧光定量RT-PCR检测CSFV的特异性探针，其特征在于，所述CSFV特异性探针的5’端标记发光基团FAM，3'端标记泯灭基团BHQl。
4.一种使用如权利要求1所述的特异性引物和如权利要求2所述的特异性探针的实时荧光定量RT-PCR检测CSFV的方法，其特征在于，包括以下步骤S100、样品的预处理对采集的样品分别进行编号，在样品中加适量青、链霉素双抗溶液，勻浆，取上清，4°C过夜；S200、RNA提取对采集的样品提取RNA ；S300、CSFV实时荧光定量RT-PCR反应以上述步骤所提取的RNA为模板，加入CSFV特异性引物和特异性探针，使用TAKARA公司的一步法RT-PCR试剂盒进行PCR扩增；S400、根据CSFV实时荧光定量RT-PCR反应结果，鉴定样品中是否含有CSFV。
5.根据权利要求4所述的实时荧光定量RT-PCR检测CSFV的方法，其特征在于，所述步骤S300中的实时荧光定量RT-PCR反应体系为25 μ L，每条特异性引物终浓度为0. 2 μ mol/ L，特异性探针浓度为0. 1 μ mol/L ；反应条件为 42°C 30min，92°C 2min，92°C 10s，55°C 30s，40 个循环。
全文摘要
本发明公开了一种实时荧光定量RT-PCR检测CSFV的方法，经过对本发明所建立的方法进行了特异性、灵敏度的验证，结果显示本方法可以较好的将CSFV同口蹄疫病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪呼吸与繁殖障碍综合征病毒和2型猪圆环病毒区分开，且灵敏度可以达到10拷贝数的数量级。另外，本发明所建立的方法整个反应过程是闭管操作，在最大程度上减少了体系的污染。本发明在诊断时间上同传统方法相比自获得待检样品到提取核酸，配制荧光定量RT-PCR反应体系，直到出现反应结果，整个过程可以在2.5h内完成，在保证检验结果的基础上大大缩短了检验所需时间。
文档编号G01N21/64GK102206709SQ20111008497
公开日2011年10月5日 申请日期2011年4月6日 优先权日2011年4月6日
发明者廖秀云, 徐海聂, 沙才华, 王振全, 罗宝正, 苏惠龙, 薄清如, 陈轩 申请人:珠海出入境检验检疫局检验检疫技术中心
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