专利名称：一种强肝药物的指纹图谱的建立方法
一种强肝药物的指纹图谱的建立方法技术领域
本发明属于药物分析检测领域，涉及一种强肝药物的指纹图谱的建立方法，特别涉及强肝胶囊的高效液相色谱(HPLC)指纹图谱的建立方法。
背景技术：
复方中药是中医临床用药的主要形式，是中医药学的特色与精髓。中药是一个由多成分、多因素构成的复杂体系，其化学成分的多样性与复杂性是其疗效的物质基�。⒎现幸揭┨氐愕南执柿靠刂铺逑担タ酥幸┲柿糠治鲇肫兰鄣哪烟猓慕幸┫钟兄柿靠刂品椒ㄒ殉晌嗣腔芯康目翁�。
建立对中药的质量控制体系必须立足于中药的特色。复方中药的整体作用特点决定了中药不同于西药。中药的质量控制方法必须能对起效的全部成分(有机成分、无机成分和络合物成分)进行控制。只有这样，所建立的质量控制体系才能真正达到控制中药质量、保证中药用药安全有效的目的。中药质量控制正从简单的单个成分含量测定转向以先进技术为手段，多组分、多指标含量的测定及采用中药指纹图谱方式能够有效地表征中药的质量。通过指纹图谱中主要特征峰的相对保留时间及含量或比例的制定和比对，能有效地控制中药材及中药产品质量，保证产品质量的相对稳定。中药指纹图谱不仅包括了对几个已知成分的分析，还包括了对已知成分与各未知成分之间的相对含量分析。因此，中药指纹图谱真正体现了对中药内在质量的综合评价和全面控制，尤其适用于有效成分不完全明确的情况下，对中药材及中药产品的质量控制。
目前多数中药标准还是采用光谱或色谱手段鉴别和测定某一种或几种有效成分或指标成分，以及药典规定的常规检查项目。对于化学药品而言，其药效成分为结构清晰的单一化合物，构效关系明确，其含量和纯度直接表达其有效性及安全性。然而，中医用药的特点是复方配伍，任何单一的有效或活性成分的含量高低均不能表达其整体的疗效。在德国、法国等欧洲国家对植物药质量控制采用高效液相指纹图谱方法，近几年我国也起步使用指纹图谱的质量控制方法，如中国药典2010年版一部复方丹参滴丸和注射液用双黄连标准中就采用HPLC指纹图谱作为控制物质群的质量控制方法，这是现代中药质量控制控制方法的进步，因此，其推行实施对中药的发展和规范必将起到积极的影响，同时指纹图谱也为国际社会所认可，有利于中药及其产品进入国际市场。
中药指纹图谱分析是对原药材、半成品、最终产品判断其真实性、质量一致性与稳定性的可行而有效的手段，在中药的药材鉴别、工艺生产、药效部位筛选、质量控制等方面的研究中应用广泛。利用标准指纹图谱追踪工艺过程及监测原药材与最终产品质量的稳定性、一致性，色谱指纹图谱可以较为全面地检测其多种成分在药材中分布的全貌，使药材的内在质量情况可控。
强肝胶囊收载于《国家药品标准新药转正标准》第三十五册，由茵陈、板蓝根、当归、白芍、丹参、郁金、黄芪、党参、泽泻、黄精、地黄、山药、山楂、秦艽、甘草、六神曲16味中药组成，具有清热利湿、补脾养血、益气解郁的功效。用于治疗慢性肝炎、早期肝硬化、脂肪CN 102539553 A肝、中毒性肝炎、肝纤维化等。
强肝胶囊为石家庄东方药业有限公司生产的中药大品种，经研究证明，强肝胶囊有较强的抗肝纤维化作用，具有保护肝细胞，促进肝细胞再生，恢复肝功能和抑制纤维化作用。临床上用于治疗肝纤维化、早期肝硬化、病毒性肝炎、中毒性肝病、脂肪肝等，其治疗效果已经得到临床的验证。如何保证药物的质量以及强肝胶囊中有效成分的含量，是决定强肝胶囊疗效的基础。现行的强肝胶囊质量标准规定了茵陈、白芍的薄层色谱鉴别方法和芍药苷高效液相色谱含量测定方法。作为中药大复方，仅从外观性状、简单的鉴别和单一成分含量测定等角度对强肝胶囊进行质量控制，显然不能全面准确说明其内在的质量，不能保证其疗效。要控制强肝胶囊的功效，必须根据中药多组分、多靶点、多途径作用的特点，对其物质整体予以控制，从整体上有效地表征中药的质量，建立安全、有效、稳定的质量标准体系。指纹图谱作为中药及其成方制剂的质量控制的最优方法，目前已经成为国家共识。采用中药指纹图谱方式，一方面可以通过指纹图谱的特征性，有效的鉴别样品的真伪和产地， 另一方面通过对主要指纹图谱特征峰的面积或比例的控制，能有效控制产品的质量，确保产品质量的稳定一致，从而保证产品安全有效。
有关强肝胶囊质量控制的文献报道较少。罗晨曲等建立了高效液相色谱法测定强肝胶囊中龙胆苦苷含量的方法，陈理等用反相高效液相色谱法测定强肝胶囊中丹参酮II A 及甘草酸的含量，但都仅局限于测定强肝胶囊大复方中的一、二种指标成分，但如何能够从宏观的角度对强肝胶囊制剂质量的进行宏观质量控制方法未见报道。同时，由于强肝胶囊的原料包含16味中药且中药成分之间存在复杂的相互作用，导致建立全面、有效地反映强肝胶囊内在质量和疗效的有效成分检测方法存在较大难度，因此，目前本领域存在对能够全面表征强肝胶囊这种药物的检测方法，例如指纹图谱的建立方法的需求。发明内容
为了解决上述问题，本发明的目的是提供一种建立强肝药物，如强肝胶囊内容物的指纹图谱的方法，该方法建立的指纹图谱能够全面表征这种强肝药物的药物活性组分及其含量，从而表征和控制其内在质量。
本发明的另一个目的是提供通过采用所建立的指纹图谱检测强肝药物的方法。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的
一方面，本发明提供了一种强肝药物指纹图谱的建立方法，所述强肝药物由茵陈、 板蓝根、当归、白芍、丹参、郁金、黄芪、党参、泽泻、黄精、地黄、山药、山楂、秦艽、甘草、六神曲组成(例如强肝胶囊，收载于《国家药品标准新药转正标准》第三十五册)，所述建立方法包括采用高效液相色谱法检测所述强肝药物成分，其中，所述高效液相色谱法的条件包括
色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充材料；
流动相流动相A为乙腈，流动相B为0. 05%体积分数磷酸水溶液，进行梯度洗脱，所述梯度洗脱程序如下，其中流动相比例均为体积百分比
0 15min，流动相A为0 10%，流动相B为100% 10% ；
15 50min，流动相A为10% 30%，流动相B为90% 70% ；
50 65min，流动相A为30% 60%，流动相B为70% 40% ；
65 75min，流动相A为60% 100%，流动相B为40% 0%。
75 85min，流动相A为0% 100%，流动相B为100% 0%。
优选地，所述高效液相色谱法的条件还包括
流速1. OmL/min ；
柱温30°C；
检测波长210nm 400nm ；
理论塔板数按芍药苷峰计算，应不低于6000。
优选地，上述建立方法还包括通过以下步骤制备对照品溶液取芍药苷对照品适量，加入甲醇溶解制成每ImL含0. Img的溶液，作为对照品溶液。
并且，上述建立方法还包括通过以下步骤制备供试品溶液取所述强肝药物成分 l.Og 1.2g，置于锥形瓶中，加入70%体积分数甲醇水溶液100ml，超声提取lh，放冷，离心约lOmin，取上清液浓缩至约10ml，用25ml水溶解，置分液漏斗中，用水饱和正丁醇萃取 3次，每次用量为30ml、20ml、20ml，合并3次萃取液，浓缩至干，用甲醇溶解转移至IOml容量瓶中，用0. 45 μ m滤膜滤过，弃去初滤液，取续滤液即得。
具体而言，所述高效液相色谱法检测所述强肝药物成分包括以下步骤
1)制备对照品溶液取芍药苷对照品适量，加入甲醇溶解制成每Iml含0. Img的溶液，作为对照品溶液；
2)制备供试品溶液取所述强肝药物成分1. Og 1. 2g，置于锥形瓶中，加入70% 体积分数甲醇水溶液100ml，超声提取lh，放冷，离心约lOmin，取上清液浓缩至约10ml，用 25ml水溶解，置分液漏斗中，用水饱和正丁醇萃取3次，每次用量为30ml、20ml、20ml，合并3 次萃取液，浓缩至干，用甲醇溶解转移至IOml容量瓶中，用0. 45 μ m滤膜滤过，弃去初滤液， 取续滤液即得；
3)测定精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μ 1注入高效液相色谱仪，根据以下色谱条件进行测定，得到指纹图谱
色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充材料；
流动相流动相A为乙腈，流动相B为0. 05 %体积分数磷酸水溶液，进行梯度洗脱；
流速1. OmL/min ；
柱温30°C；
紫外检测波长230nm。
所述梯度洗脱程序如下，其中流动相比例均为体积百分比
O 15min，流动相A为O 10%，流动相B为100% 10% ；
15 50min，流动相A为10% 30%，流动相B为90% 70% ；
50 65min，流动相A为30% 60%，流动相B为70% 40% ；
65 75min，流动相A为60% 100%，流动相B为40% 0% ；
75 85min，流动相A为0% 100%，流动相B为100% 0%。
根据上述建立方法得到的指纹图谱中共有14个吸收峰，其中峰8为对照品芍药苷，各峰以峰8为参照峰计算相对保留时间和相对峰面积如下
相对保留时间
峰1 :0. 382 0. 384 ；峰 2 :0. 427 0. 432 ；峰 3 :0. 479 0. 482 ；峰 4 :0. 539 549 ；峰 5 0. 664 0. 666 ；峰 6 :0. 870 0. 872 ；峰 7 :0. 939 0. 941 ；峰 8 1. 000 ；峰 9 1. 124 1. 127 ；峰 10 1. 178 1. 180 ；峰 11 1. 326 1. 329 ；峰 12 1. 596 1. 603 ；峰 13 1. 649 1. 652 ；峰 14 :1. 881 1. 889 ；
相对峰面积
峰1 0. 15 0. 23 ；峰 2 0. 59 0. 71 ；峰 3 0. 71 1. 20 ；峰 4 0. 21 0. 34 ；峰 5 0. 21 0. 34 ；峰 6 0. 94 1. 12 ；7 :0. 34 0. 40 ；峰 8 :1. 00 ；峰 9 :0. 24 0. 28 ；峰 10 0. 37 0. 49 ；峰 11 0. 55 1. 07 ；峰 12 :0. 80 1. 16 ；峰 13 :0. 62 0. 83 ；峰 14 :0. 11 0. 13。
在所述指纹图谱的吸收峰中，单峰面积超过5%的吸收峰有8个
峰2，平均保留时间RT为14. 178min, RSD为0. 41 % ；峰面积为1743. 0，RSD为 10. 15% ；
峰3，平均保留时间RT为15. 812min, RSD为0. 22 % ；峰面积为2869. 8，RSD为 21. 26% ；
峰6，平均保留时间RT为28. 666min, RSD为0. 07 % ；峰面积为2779. 5，RSD为 7. 71% ；
峰8，平均保留时间RT为32. 911min, RSD为0. 07 % ；峰面积为2711. 4，RSD为 9. 01% ；
峰10，平均保留时间RT为38. 808min, RSD为0. 05 % ；峰面积为1178. 8，RSD为 12. 27% ；
峰11，平均保留时间RT为43. 705min, RSD为0. 07 % ；峰面积为2053. 1，RSD为 19. 04% ；
峰12，平均保留时间RT为52. 705min, RSD为0. 14% ；峰面积为2807. 9，RSD为 16. 98% ；
峰13，平均保留时间RT为54. 32min, RSD为0. 07 % ；峰面积为1933. 0，RSD为 16. 00%。
并且，单峰面积超过10%的吸收峰有5个
峰3，平均保留时间RT为15. 812min, RSD为0. 41 % ；峰面积为2869. 8，RSD为 21. 26% ；
峰6，平均保留时间RT为28. 666min, RSD为0. 22 % ；峰面积为2779. 5，RSD为 7. 71% ；
号峰8，平均保留时间RT为32. 911min, RSD为0. 07% ；峰面积为2711. 4，RSD为 9. 01% ；
号峰12，平均保留时间RT为52. 705min, RSD为0. 14% ；峰面积为2807. 9，RSD为 16. 98% ；
号峰13，平均保留时间RT为54. 32min, RSD为0. 07% ；峰面积为1933. 0，RSD为 16. 00%。
其中，通过对所述强肝药物复方与全方药材的相关性研究，确认了所述强肝药物 HPLC指纹图谱的14个共有特征峰的来源。其中对应于原料药，峰2、3、7、8、11归属于所述强肝药物中的白芍，峰5归属于茵陈，峰4、12、13归属于丹参，峰6归属于秦艽，峰9归属于黄芪，峰10、14归属于甘草；
并且，采用与对照品色谱图对比及高效液相色谱-质谱(HPLC-MS)法对色谱峰进行了指认，其中峰2为没食子酸，峰4为丹参素，峰6为龙胆苦苷，峰7为芍药内酯苷，峰8 为芍药苷，峰9为毛蕊异黄酮苷，峰10为甘草苷，峰11为没食子酰芍药苷，峰12为丹酚酸 B，峰14为甘草酸。
并且峰2为没食子酸，约在Hmin出峰；峰4为丹参素，约在17min出峰；峰6为龙胆苦苷，约在^min出峰；峰7为芍药内酯苷，约在30min出峰；峰8为芍药苷，约在出峰；峰9为毛蕊异黄酮苷，约在37min ；峰10为甘草苷，约在38min出峰；峰11为没食子酰芍药苷，约在43min ；峰12为丹酚酸B，约在52min出峰；峰14为甘草酸，约在61min出峰。
在检测待测产品强肝药物，如强肝胶囊的质量时，可以将待测产品的指纹图谱与上文所获得的标准指纹图谱进行比较，计算相似度，识别两者所具有的共同吸收峰的数量， 以确定产品是否合格。
因此，在另一方面本发明还提供了一种检测强肝药物的方法，所述强肝药物由茵陈、板蓝根、当归、白芍、丹参、郁金、黄芪、党参、泽泻、黄精、地黄、山药、山楂、秦艽、甘草、六神曲组成，所述方法包括根据上述方法建立的待测样品指纹图谱并与根据上述方法建立的标准指纹图谱比较。
以下是本发明的详细描述。
色谱条件由于本样品为大复方，药味多，成分复杂，故采用梯度洗脱的方式；根据各药味成分的特点先后尝试了甲醇-水、甲醇-磷酸水溶液、乙腈-磷酸水溶液等流动相系统，并且尝试了多种不同梯度条件，经过对各种色谱图比较，最后确定乙腈-0. 05%体积分数磷酸水溶液系统，采用梯度洗脱方式，得到的多个色谱峰有较好的分离效果。
供试品溶液采用二极管阵列检测器(DAD)在210 400nm波长范围内进行全梯度扫描，并对各波长下的色谱图进行分析比较。结果表明，在230nm波长处，各色谱峰分离良好，特征峰明显且峰型较好，从图谱中可以尽可能的获取色谱组分信息及反映整体系组成的全貌，因此选定230nm为指纹图谱测定波长，结果见附图1。通过对lumuDiamonsil钻石 1代、Ameritech，菲罗门-ODS等C18色谱柱比较，最终确定用Diamonsil钻石1代C18 (5 μ m， 2. 5X460mm)；柱温:30°C ；检测波长:230nm ；流动相A为乙腈，流动相B为0. 05%体积分数磷酸水溶液；洗脱方式梯度洗脱洗脱梯度程序为0 15min，流动相A为0 10 %，流动相B为100% 10%;15 50min流动相A为10% 30%，流动相B为90% 70%;50 65min流动相A为30 % 60 %，流动相B为70 % 40 % ;65 75min流动相A为60 % 100%，流动相B为40% 0% ；75 85min流动相A为0% 100%，流动相B为100% 0% ；并记录75分钟色谱图。流速1.0ml/min。进样量10yL。
优选对照品溶液的制备方法为取芍药苷对照品适量置25ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇勻，即得。
优选供试品溶液的制备方法通过多次的试验考察确定了本质量控制方法中供试品溶液的制备方法，试验比较了用50%体积分数乙醇水溶液、70%体积分数乙醇水溶液、 50%体积分数甲醇水溶液、70%体积分数甲醇水溶液、甲醇做提取溶剂对指纹图谱的影响，确定用70%体积分数甲醇水溶液作溶剂效果佳，同时对超声和回流不同提取方法和不同提取时间做了比较。结果表明使用70%体积分数甲醇水溶液超声lh，所得色谱峰较多，峰面积较大。由于本品药味多，提取工艺为水煎，考虑到本品大分子物质较多，色谱柱负荷较大， 因此本实验还对样品除杂处理方法进行了考察，考察用正丁醇和乙酸乙酯分别萃取3次，4 次制备得到供试品溶液进行，结果表明，用水饱和正丁醇萃取3次色谱峰与用70%体积分数甲醇水溶液直接提取进样所得的色谱图相当。因此，优选条件为取本品内容物约1. 0g，精密称定，加入70%体积分数甲醇水溶液100ml，超声提取lh，放冷，离心约lOmin，取上清液浓缩至约20ml，用25ml水溶解，用水饱和正丁醇萃取3次，每次用量为30ml，20ml，20ml，合并3次萃取液，浓缩至干，用甲醇溶解转移至IOml容量瓶中，摇勻，过0. 45 μ m微孔滤膜，取续滤液作为供试品溶液。
以芍药苷为参照峰的指纹图谱的制定
精密吸取对照品溶液和供试品溶液，分别注入高效液相色谱仪，依据所得的图谱， 制定标准指纹图谱。以上述方法作为待测定强肝胶囊样品中白芍、秦艽、丹参、茵陈、甘草和黄芪中一种或几种成分指纹图谱的测试手段，将待测定强肝胶囊样品指纹图谱与上述标准指纹图谱对比，计算相似度，应为0. 90 1. 00。
与现有技术相比，本发明提供的强肝药物指纹图谱的建立方法具有以下积极效果
首先，本发明所涉及的强肝胶囊内容物为16味中药组成，各个药材所含化学成分复杂，对指纹图谱的制定造成干扰，导致各部分指纹图谱特征不稳定，所以必须严格控制流动相的色谱条件，才能得到良好的指纹图谱。也就是说，不是将药品中的秦艽、白芍和甘草、 丹参、黄芪等部分药材或制剂的指纹图谱简单叠加就能得到药品的指纹图谱。实验证明，只有采用本发明经过大量实验所得到的切实可行的、特定的色谱条件，才能得到以该药物的组成成分秦艽、白芍、甘草、丹参、黄芪、茵陈等有效成分为主要特征的指纹图谱，从而实现了活性成分特征峰的有效分离和表征，从而得到了全面、清楚的指纹图谱。
其次，通过本发明的方法获得的指纹图谱能更全面、完善地表征药物的有效活性组分及其质量。该方法实现了对强肝胶囊最大可能的化学成分的全面检测，代表着强肝胶囊的主要药理活性，能有效地表征强肝胶囊的质量，有利于对活性成分的全面监控。所建立的指纹图谱可以用于质量控制，在保证产品的稳定均一的同时，确保产品的安全有效性。
并且，本发明具有方法简便、稳定、精密度高、重现性好、易于掌握的特点。在相同测试条件下，所提供的强肝胶囊内容物指纹图谱建立方法获取了强肝胶囊中以秦艽、白芍、 甘草、丹参、黄芪、茵陈有效成分为特征的HPLC标准指纹图谱。
以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中
图1为强肝药物(即强肝胶囊内容物)的HPLC-DAD三维色谱图2为实施例3中10批强肝胶囊内容物供试品的指纹图谱叠加图3为强肝胶囊内容物的HPLC对照指纹图谱；
图4至6分别为实施例4中试验的梯度洗脱条件1至3的HPLC图7为实施例4中试验的不同检测波长下得到的HPLC图；10
图8为实施例5中采用国家药品标准WS3-133(Z-13;3)-2002 (Z)中色谱条件的流动相检测强肝胶囊得到的HPLC图9至11分别为实施例6中强肝胶囊产品1、2和3内容物的HPLC色谱图。
具体实施方式
以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。
以下各实施例中所使用的对照品来源如下
芍药苷，中国药品生物制品检定所，批号0736-9608。
以下各实施例中所使用的供试品强肝胶囊为本发明人与石家庄东方药业有限公司按照国家药品标准(新药转正标准)第35册WS3-133(Z-13;3)-2002(Z)制备，制备过程中充分注重了处方中各药材的产地属性、采收季节特征、工艺控制特征。制得的产品批号见下表1
表1实施例中采用的强肝胶囊的批号
权利要求
1.一种强肝药物指纹图谱的建立方法，所述强肝药物由茵陈、板蓝根、当归、白芍、丹参、郁金、黄芪、党参、泽泻、黄精、地黄、山药、山楂、秦艽、甘草、六神曲组成，所述建立方法包括采用高效液相色谱法检测所述强肝药物成分，其中，所述高效液相色谱法的条件包括色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充材料；流动相流动相A为乙腈，流动相B为0. 05%体积分数磷酸水溶液，进行梯度洗脱，所述梯度洗脱程序如下，其中流动相比例均为体积百分比0 15min，流动相A为0 10%，流动相B为100% 10% ；15 50min，流动相A为10% 30%，流动相B为90% 70% ；50 65min，流动相A为30 % 60 %，流动相B为70 % 40 % ；65 75min，流动相A为60% 100%，流动相B为40% 0% ；75 85min，流动相A为0% 100%，流动相B为100% 0% ；优选地，所述高效液相色谱法的条件还包括流速:1. OmL/min ；柱温:30°C ；检测波长210nm 400nm ；理论塔板数按芍药苷峰计算，应不低于6000。
2.根据权利要求1所述的建立方法，其特征在于，所述建立方法还包括通过以下步骤制备对照品溶液取芍药苷对照品适量，加入甲醇溶解制成每Iml含0. Img的溶液，作为对照品溶液。
3.根据权利要求1或2所述的建立方法，其特征在于，所述建立方法还包括通过以下步骤制备供试品溶液取所述强肝药物成分1. O 1. 2g，置于锥形瓶中，加入70 %体积分数甲醇水溶液100ml，超声提取lh，放冷，离心约lOmin，取上清液浓缩至约10ml，用25ml水溶解，置分液漏斗中，用水饱和正丁醇萃取3次，每次用量为30ml、20ml、20ml，合并3次萃取液，浓缩至干，用甲醇溶解转移至IOml容量瓶中，用0. 45 μ m滤膜滤过，弃去初滤液，取续滤液即得。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的建立方法，其特征在于，所述高效液相色谱法检测所述强肝药物成分包括以下步骤1)制备对照品溶液取芍药苷对照品适量，加入甲醇溶解制成每Iml含0.Img的溶液， 作为对照品溶液；2)制备供试品溶液取所述强肝药物成分1.O 1. 2g，置于锥形瓶中，加入70%体积分数甲醇水溶液100ml，超声提取lh，放冷，离心约lOmin，取上清液浓缩至约10ml，用25ml 水溶解，置分液漏斗中，用水饱和正丁醇萃取3次，每次用量为30ml、20ml、20ml，合并3次萃取液，浓缩至干，用甲醇溶解转移至IOml容量瓶中，用0. 45 μ m滤膜滤过，弃去初滤液，取续滤液即得；3)测定精密吸取对照品溶液与供试品溶液各 ομ1注入高效液相色谱仪，根据以下色谱条件进行测定，得到指纹图谱色谱柱十八烷基硅烷键合硅胶为填充材料；流动相流动相A为乙腈，流动相B为0. 05%体积分数磷酸水溶液，进行梯度洗脱；流速:1. OmL/min ； 柱温:30°C ； 紫外检测波长230nm。
5.根据权利要求1至4中所述的建立方法，其特征在于，所述梯度洗脱程序按如下，其中流动相比例均为体积百分比O 15min，流动相A为O 10%，流动相B为100% 10% ； 15 50min，流动相A为10% 30%，流动相B为90% 70% ； 50 65min，流动相A为30% 60%，流动相B为70% 40% ； 65 75min，流动相A为60% 100%，流动相B为40% 0% ； 75 85min，流动相A为0% 100%，流动相B为100% 0%。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的建立方法，其特征在于，所述建立方法得到的指纹图谱中共有14个吸收峰，其中峰8为对照品芍药苷，各峰以峰8为参照峰的相对保留时间和相对峰面积如下相对保留时间峰 1 0. 382 0. 384 ；峰 2 :0. 427 0. 432 ；峰 3 :0. 479 0. 482 ；峰4 :0. 539 549 ；峰 5 0. 664 0. 666 ；峰 6 :0. 870 0. 872 ；峰 7 :0. 939 0. 941 ；峰 8 :1. 000 ；峰 9 :1. 124 1. 127 ；峰 10 1. 178 1. 180 ；峰 11 :1. 326 1. 329 ；峰 12 :1. 596 1. 603 ；峰 13 :1. 649 1. 652 ；峰 14 1. 881 1. 889 ； 相对峰面积峰 1 0. 15 0. 23 ；峰 2 0. 59 0. 71 ；峰 3 :0. 71 1. 20 ；峰 4 :0. 21 0. 34 ；峰 5 0. 21 0. ；34 ；峰 6 0. 94 1. 12 ；7 :0. 34 0. 40 ；峰 8 1. 00 ；峰 9 :0. 24 0. 28 ；峰 10 0. 37 0. 49 ；峰 11 0. 55 1. 07 ；峰 12 :0. 80 1. 16 ；峰 13 :0. 62 0. 83 ；峰 14 :0. 11 0. 13。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的建立方法，其特征在于，所述指纹图谱的吸收峰中，单峰面积超过5 %的吸收峰有8个峰2，平均保留时间RT为14. 178min，RSD为0. 41%，峰面积为1743. 0，RSD为10. 15%； 峰3，平均保留时间RT为15. 812min，RSD为0. 22%，峰面积为2869. 8，RSD为21. 26%； 峰 6，平均保留时间 RT 为 28. 666min, RSD 为 0. 07%，峰面积为 2779. 5，RSD % 7. 71% ； 峰 8，平均保留时间 RT 为 32. 911min，RSD 为 0. 07%，峰面积为 2711. 4，RSD % 9. 01%； 峰10，平均保留时间RT为38. 808min，RSD为0. 05%，峰面积为1178. 8，RSD为12. 27%； 峰11，平均保留时间RT为43. 705min，RSD为0. 07%，峰面积为2053. 1，RSD为19. 04%； 峰12，平均保留时间RT为52. 705min，RSD为0. 14%，峰面积为观07. 9，RSD为16. 98%； 峰13，平均保留时间RT为32min，RSD为0. 07%，峰面积为1933. 0，RSD为16. OOV0o
8.根据权利要求1至7中任一项所述的建立方法，其特征在于所述指纹图谱的吸收峰中，单峰面积超过10%的吸收峰有5个峰3，平均保留时间RT为15. 812min，RSD为0. 41%，峰面积为2869. 8，RSD为21. 26%； 峰 6，平均保留时间 RT 为 28. 666min, RSD 为 0. 22%，峰面积为 2779. 5，RSD % 7. 71% ； 峰 8，平均保留时间 RT 为 32. 911min，RSD 为 0. 07%，峰面积为 2711. 4，RSD % 9. 01%； 峰12，平均保留时间RT为52. 705min，RSD为0. 14%，峰面积为观07. 9，RSD为16. 98%；.13 峰，平均保留时间 RT 为 54. 32min,RSD % 0. 07%,峰面积为 1933. 0，RSD 为 16. 00%。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的建立方法，其特征在于，所述指纹图谱的吸收峰中，峰2、3、7、8、11归属于所述强肝药物中的白芍，峰5归属于茵陈，峰4、12、13归属于丹参，峰6归属于秦艽，峰9归属于黄芪，峰10、14归属于甘草；并且，其中峰2为没食子酸，峰4为丹参素，峰6为龙胆苦苷，峰7为芍药内酯苷，峰8 为芍药苷，峰9为毛蕊异黄酮苷，峰10为甘草苷，峰11为没食子酰芍药苷，峰12为丹酚酸 B，峰14为甘草酸。
10.一种检测强肝药物的方法，所述强肝药物由茵陈、板蓝根、当归、白芍、丹参、郁金、 黄芪、党参、泽泻、黄精、地黄、山药、山楂、秦艽、甘草、六神曲组成，所述方法包括根据权利要求1至9中任一项所述方法建立待测样品指纹图谱并与根据上述方法建立的标准指纹图谱比较。
全文摘要
本发明提供一种强肝药物指纹图谱的建立方法，所述强肝药物由茵陈、板蓝根、当归、白芍、丹参、郁金、黄芪、党参、泽泻、黄精、地黄、山药、山楂、秦艽、甘草、六神曲组成，所述建立方法包括采用高效液相色谱法检测所述强肝药物中的芍药苷，条件包括色谱柱为以十八烷基硅烷键合硅胶为填充材料；流动相包括流动相A为乙腈，流动相B为酸性水溶液，进行梯度洗脱；流速1.0mL/min；柱温30℃；检测波长210nm～400nm；理论塔板数按芍药苷峰计算，应不低于6000。所获得指纹图谱主要以其组成成分秦艽、白芍、甘草、丹参、茵陈、黄芪有效成分为主的色谱峰。采用本发明的建立方法，能有效获得能够全面表征强肝药物活性组分的指纹图谱，具有精密度、稳定性、重复性高的特点。获得的指纹图谱可用于确保产品质量的稳定一致，从而保证产品的安全有效。
文档编号G01N30/02GK102539553SQ20111041919
公开日2012年7月4日 申请日期2011年12月15日 优先权日2011年12月15日
发明者何立新, 刘向, 刘毅, 刘素香, 张铁军, 韦辉, 韩丰年 申请人:石家庄东方药业有限公司
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