专利名称：一种伤科接骨外用制剂的检测方法
技术领域：
本发明属于中药制剂领域，具体涉及一种外用伤科接骨的提取物、及其制备方法，和一种伤科接骨的外用制剂、及其用途和检测方法。
背景技术：
中国发明专利CN100361667C、发明名称为“一种治疗伤科疾病的药物及其制备方法”公开了一种治疗伤科疾病的药物，该药物是用于治疗跌打损伤、闪腰岔气、伤筋动骨、瘀血肿痛、损伤红肿等症的药物，其临床治疗效果较好。上述专利公开了一种制备药物的方法，第一种制备方法为将除朱砂和冰片外的药材粉碎，过100-250目筛，将朱砂制成朱砂极细粉，将冰片研细，都兑入过筛后的上述药材药粉中混合均匀。第二种制备方法为将除
红花、朱砂和冰片外的原料药粉碎，过100-250目筛，将红花加水煎煮两次，合并煎液，并浓缩至清膏；然后将红花清膏与上述原料粉碎物混合；但是，该药物的剂型仅公开了口服用制剂，剂型单一，不能满足不同患者的需求。
发明内容
本发明人研制了一种外用伤科接骨的提取物、及其制备方法、外用制剂及其检测方法，成功地克服了现有技术中的不足。本发明的目的是提供一种外用伤科接骨的提取物。本发明的另一个目的是提供上述外用伤科接骨提取物的制备方法。本发明的第三个目的是提供一种伤科接骨的外用制剂。本发明的第四个目的是提供一种伤科接骨外用制剂的制备方法及其用途。本发明的第五个目的是提供上述伤科接骨外用制剂的检测方法。具体地说，本发明提供了一种外用伤科接骨的提取物，它是由下述重量配比的药材制备的
三七 26-100份海星13-50份红花 4-24份 炙鸡骨13-50份土鳖虫13-60份煅自然铜6-26份
炙乳香1-6份炙没药1-6份马钱子粉6-25份
朱砂 3-16份甜瓜子1-6份冰片0.5-4份其中，以上十二味药材，除冰片、马钱子粉外，朱砂水飞成极细粉，其余药材粉碎成粗粉，与马钱子粉混合，用乙醇提取并浓缩成清膏，然后，与冰片、朱砂混合。作为一种优选的实施方案，本发明提供了一种外用伤科接骨的提取物，它是由下述重量配比的药材制备的三七80份海星35份红花20份
炙鸡骨40份土鳖虫25份煅自然铜15份
炙乳香6份炙没药4份马钱子粉15份
朱砂10份甜瓜子6份冰片2份其中，以上十二味药材，除冰片、马钱子粉外，朱砂水飞成极细粉，其余药材粉碎成粗粉，与马钱子粉混合，用乙醇提取并浓缩成清膏，然后，与冰片、朱砂混合。
作为一种优选的实施方案，本发明提供了一种外用伤科接骨的提取物，它是由下述重量配比的药材制备的
三七 80份海星40份红花15份炙鸡骨40份土鳖虫30份煅自然铜25份炙乳香4份炙没药6份马钱子粉20份
朱砂15份甜瓜子4份冰片3份其中，以上十二味药材，除冰片、马钱子粉外，朱砂水飞成极细粉，其余药材粉碎成粗粉，与马钱子粉混合，用乙醇提取并浓缩成清膏，然后，与冰片、朱砂混合。作为一种优选的实施方案，本发明提供了一种外用伤科接骨的提取物，它是由下述重量配比的药材制备的
三七80份海星40份红花15份
炙鸡骨45份土鳖虫20份煅自然铜25份炙乳香5份炙没药6份马钱子粉20份
朱砂10份甜瓜子4份冰片2份其中，以上十二味药材，除冰片、马钱子粉外，朱砂水飞成极细粉，其余药材粉碎成粗粉，与马钱子粉混合，用乙醇提取并浓缩成清膏，然后，与冰片、朱砂混合。作为一种优选的实施方案，本发明提供了一种外用伤科接骨的提取物，它是由下述重量配比的药材制备的
三七 80份海星40份红花 12份
炙鸡骨40份土鳖虫40份煅自然铜20份
炙乳香4份炙没药4份马钱子粉20份
朱砂10份甜瓜子4份冰片2份其中，以上十二味药材，除冰片、马钱子粉外，朱砂水飞成极细粉，其余药材粉碎成粗粉，与马钱子粉混合，用乙醇提取并浓缩成清膏，然后，与冰片、朱砂混合。在本发明提供的外用伤科接骨提取物中，其中，所述用乙醇提取是指用55-95体积％的乙醇提取一至四次；优选地，用60-90体积％的乙醇提�。叛〉赜�60或80体积％的乙醇提�。挥叛〉兀掖继崛〉拇问危挥靡掖继崛〉氖奔湮狪至9小时/次，更优选地，1. 5小时/次；乙醇的用量为粗粉与马钱子粉混合物的6至12倍(重量比)/次，优选地，为6-10倍/次，更优选地，8-10倍/次。在本发明提供的外用伤科接骨提取物中，作为一种优选的实施方案，其中，所述用乙醇提取是指用60体积％乙醇提取三次，第一次加8-12倍量(优选10倍)60%体积乙醇提取1-3小时(优选1. 5小时)，第二次加6-10倍量(优选8倍量)60体积％乙醇提取1_3小时(优选1. 5小时)，第三次加6-10倍量(优选8倍量)60体积％乙醇提取1. 5小时。 在本发明提供的外用伤科接骨提取物中，其中，在乙醇提取后可进一步地包括滤过,任选地合并滤液,回收乙醇,药液浓缩成清膏。在本发明提供的外用伤科接骨提取物中，其中，在乙醇提取后，药液浓缩成的清膏相对密度为1. 00-1. 40 (350C -450C )。第二方面，本发明提供了外用伤科接骨提取物的制备方法，包括
三七 26-100份海星13-50份红花4-24份
炙鸡骨13-50份土鳖虫13-60份煅自然铜6-26份炙乳香1-6份炙没药1-6份马钱子粉6-25份
朱砂 3-16份甜瓜子1-6份冰片0.5-4份优选地，
三七80份海星35份红花20份
炙鸡骨40份土鳖虫25份煅自然铜15份
炙乳香6份炙没药4份马钱子粉15份
朱砂10份甜瓜子6份冰片2份或
三七80份海星40份红花15份
炙鸡骨40份土鳖虫30份煅自然铜25份
炙乳香4份炙没药6份马钱子粉20份
朱砂15份甜瓜子4份冰片3份或
三七80份海星40份红花15份
炙鸡骨45份土鳖虫20份缎自然铜25份 炙乳香5份炙没药6份马钱子粉20份
朱砂10份甜瓜子4份冰片2份或
三七 80份海星40份红花12份
炙鸡骨40份土鳖虫40份缎自然铜20份
炙乳香4份炙没药4份马钱子粉20份
朱砂10份甜瓜子4份冰片2份以上十二味，除冰片、马钱子粉外，朱砂水飞成极细粉，其余药材粉碎成粗粉，与马钱子粉混合，用乙醇提取并浓缩成清膏，然后，与冰片、朱砂混合。在本发明提供的外用伤科接骨提取物制备方法中，其中，所述用乙醇提取是指用55-95体积％的乙醇提取一至四次；优选地，用60-90体积％的乙醇提�。叛〉赜�60或80体积％的乙醇提�。挥叛〉兀掖继崛〉拇问危挥靡掖继崛〉氖奔湮狪至9小时/次，更优选地，1. 5小时/次；乙醇的用量为粗粉与马钱子粉混合物的6至12倍(重量比)/次，优选地，为6-10倍/次，更优选地，8-10倍/次。在本发明提供的外用伤科接骨提取物制备方法中，作为一种优选的实施方案，其中，所述用乙醇提取是指用60体积％乙醇提取三次，第一次加8-12倍量(优选10倍)60%体积乙醇提取1-3小时(优选1. 5小时)，第二次加6-10倍量(优选8倍量)60体积％乙醇提取1-3小时(优选1. 5小时)，第三次加6-10倍量(优选8倍量)60体积％乙醇提取1. 5小时。在本发明提供的外用伤科接骨提取物中，其中，在乙醇提取后可进一步地包括滤过,任选地合并滤液,回收乙醇,药液浓缩成清膏。在本发明提供的外用伤科接骨提取物中，其中，在乙醇提取后，药液浓缩成的清膏相对密度为1. 00-1. 40 (350C -450C )。第三方面，本发明提供了一种伤科接骨外用制剂，它是由上述外用伤科接骨提取物与药学上可接受的辅料制备而成。本发明提供的伤科接骨外用制剂，可制成凝胶剂、喷雾剂、气雾剂、膏药、贴膏剂、软膏剂或涂膜剂，特别优选地制成凝胶剂。在本发明提供的伤科接骨外用制剂中，所述药学上可接受的辅料可选用，例如Raymond C. Rowe 等主编的“Handbook of PharmaceuticalExcipients”(第五版，2006 年)，所列举的。更具体地说，本发明提供的伤科接骨外用制剂制成凝胶剂时，所述药学上可接受的辅料为卡波姆940、三乙醇胺、95体积％乙醇、甘油、氮酮、羟苯乙酯以及纯化水。
更具体地说，本发明提供的伤科接骨外用制剂制成涂膜剂时，所述药学上可接受的辅料为乙醇、聚乙烯醇和甘油。更具体地说，本发明提供的伤科接骨外用制剂制成软膏剂时，所述药学上可接受的辅料为甘油、硬脂酸、三乙醇胺、液体石蜡、石蜡、羟苯乙酯和纯化水。更具体地说，本发明提供的伤科接骨外用制剂制成贴膏剂时，所述药学上可接受的辅料为橡胶、氧化锌等。第四方面，本发明提供了上述伤科接骨外用制剂的用途，在制备治疗伤科疾病的药物组合物中的应用。上述伤科接骨外用制剂具有活血化瘀， 消肿止痛，舒筋壮骨的功效。可用于跌打损伤，闪腰岔气，伤筋动骨，瘀血肿痛，损伤红肿等症；或者对骨折患者需经复位后配合使用。本发明提供的上述伤科接骨外用制剂为外用，涂于患处。此外，本发明提供的上述伤科接骨外用制剂的制备方法，包括将所述清膏、冰片、朱砂与药学上可接受的辅料相混合。第五方面，本发明提供了上述伤科接骨外用制剂的检测方法，包括如下项目性状、鉴别、检查和含量测定。优选地，本发明提供的上述伤科接骨外用制剂的检测方法，其中，所述的性状为内容物为红色胶状半固体，气微腥。所述的鉴别为(I)取本品，置显微镜下观察；不规则颗粒细�。底睾焐泄庠螅咴蛋岛谏�(2)取本品约10g，加95%乙醇50ml，超声处理30分钟，放冷，滤过，溶液蒸干，残渣加水IOml微热使溶解，转移至分液漏斗中，加水饱和正丁醇提取3次，每次10ml，合并正丁醇提取液，再用正丁醇饱和的水洗涤3次，每次5ml，水液弃去；取正丁醇液，水浴蒸干，残渣加甲醇Iml溶解，作为供试品溶液；另取三七对照药材O. 5g，按供试品溶液制备方法制备，作为对照药材溶液；照薄层色谱法(中国药典2010年版一部附录VI B)试验，吸取供试品溶液10 μ 1，对照品溶液10 μ 1，分别点于同一硅胶G薄层板上，以氯仿-甲醇-水(13 7 2)10°C以下放置12小时的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸无水乙醇溶液，在105°C加热至斑点显色清晰，置日光下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色斑点。(3)取本品约10g，加乙醚50ml，密塞，超声处理15min，滤过，乙醚液50°C水浴挥散至近干，残渣加醋酸乙酯Iml溶解，作为供试品溶液。另取冰片对照药材，加醋酸乙酯制成每Iml含IOmg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(中国药典2010年版一部附录
VIB)试验，吸取供试品溶液10 μ I与对照品溶液5 μ 1，分别点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚(60 90°C)-丙酮(9 1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以1%香草醒浓硫酸溶液。在105°C加热至斑点显色清晰。置日光下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色斑点。(4)取本品约10g，加乙醇50ml，密塞，超声处理20分钟，放冷，滤过，溶液蒸干。残渣加3% (ml/ml)硫酸溶液IOml溶解，转移至分液漏斗中，以浓氨试液调pH 9_10，加三氯甲烷提取2次，每次20ml。合并三氯甲烷液，水浴挥去三氯甲烷，残渣加三氯甲烷Iml溶解，作为供试品溶液。另取士的宁对照品、马钱子碱对照品，加三氯甲烷制成每Iml各含O. 5mg的混合溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(中国药典2010年版一部附录VI B)试验，吸取供试品溶液10 μ I与对照品溶液5 μ 1，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯-丙酮-乙醇-浓氨试液(3 6 0. 6 0. 4)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以稀碘化铋钾试液。置日光下检视，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色斑点。所述的检查为重金属及有害元素照铅、镉、砷、汞、铜测定法(附录IX B电感耦合等离子体质谱法)测定，汞不得过百分之一点五，铅不得过百万分之十(优选地不超过百万分之五);镉不得过百万分之五(优选地不超过百万分之三)；砷不得过百万分之五(优选地不超过百万分之二)；铜不得过百万分之二十(优选地不超过百万分之十)。所述的含量测定为1.马钱子粉照高效液相色谱法(中国药典2010年版一部附录VI D)测定。 色谱条件以十八烷基硅烷键合硅胶为填料，柱温室温，以乙腈-O. 01mol/L庚烷磺酸钠与O. 02mol/L的磷酸二氢钾等量混合溶液(用10%磷酸调节pH值2. 8) (21 79)为流动相，检测波长为254nm，理论塔板数按士的宁色谱峰计算，不得低于4000，优选地，不得低于5000。对照品溶液制备取士的宁对照品适量，精密称定，加甲醇溶解，制成每Iml含O. 004mg的溶液。供试品溶液制备取本品约2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50ml，密塞，称定重量，超声处理(功率200w，频率60KHz ;或者，功率250w，频率40KHz) 30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，充分振�。斯÷艘�5ml，经微孔滤膜(O. 45 μ m)滤过,滤液作为供试品溶液。测定法分别精密吸取供试品溶液与对照品溶液各10μ 1，注入液相色谱仪中，测定，即得。2.三七照高效液相色谱法(中国药典2010年版一部附录VI D)测定。色谱条件以十八烷基硅烷键合硅胶为填料，柱温室温，以乙腈-水(21 :79)为流动相，检测波长为203nm，理论塔板数按人参皂苷Rgl色谱峰计算，不得低于10000。对照品溶液制备取人参皂苷Rgl对照品适量，精密称定，加甲醇溶解，制成每Iml含O.1mg的溶液。供试品溶液制备取本品约2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50ml，密塞，称定重量，超声处理(功率200w，频率60KHz ;或者，功率250w，频率40KHz) 30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，充分振�。斯÷艘�5ml，经微孔滤膜(O. 45 μ m)滤过,滤液作为供试品溶液。测定法分别精密吸取供试品溶液与对照品溶液各10μ 1，注入液相色谱仪中，测定，即得。3.朱砂取本品约5g,精密称定,置250ml锥形瓶中，加硫酸40ml,硝酸钾6g,加热微沸30分钟，使成无色透明溶液，放冷，加水50ml，滴加I %高锰酸钾溶液至显粉红色以2min内不消失为度，再滴2%硫酸亚铁溶液至红色消失，用硫氰酸铵滴定液(0.05mol / L)滴定。每ImL硫氰酸铵滴定液(O. 05mol / L)相当于5. 815mg硫化萊。作为一种优选的实施方案，本发明伤科接骨外用制剂为凝胶剂时，其的检测方法进一步地包括pH值取本品IOgJP 10倍水溶解，照pH值测定法(中国药典2010年版一部附录VII G)操作，本品pH应在6. 5-7. 5之间;粒度取本品适量，置于载玻片上，涂成薄层，覆以盖玻片，共涂3片，照粒度测定法(中国药典2010年版一部附录XI B第一法)测定，均不得检出大于180 μ m的粒子；其他本品应符合凝胶剂项下有关的各项规定(中国药典2010年版一部附录I Q)。本发明提供的外用伤科接骨提取物、外用伤科接骨提取物制备方法、伤科接骨外用制剂及其制备方法，是以伤科接骨片原药物全粉压片的配方为基础，采用现代先进提取浓缩技术生产而成，有效的保留了药材中的活性物质和药材的有效成分，大大提高了生药成分的溶出度，同时提高了生物利用度，有效提高了治疗效果。同时克服了原有药物的不足，直接透皮吸收，起效迅速，稳定性良好，便于使用、携带和保存；本发明的工艺简单易行，原料及辅料来源稳定，易于产业化。
图1-A表示的是骨折家兔桡骨X线检查结果，治疗21天模型对照组骨折线趋于�：匀豢杉负跷薰丘枭ぃ簧丝平庸悄杭恋�、高剂量组、伤科接骨片组及活血接骨散组均有少量骨痂生长，骨折线�：�。图1-B表示的是骨折家兔桡骨X线检查结果，治疗42天模型组骨折线�：泄丘枭ぃ丝平庸悄杭恋图亮孔楣丘杳芏冉系咴挡徽耄呒亮孔�、伤科接骨片及活血接骨散组骨折断端界限几乎消失，骨痂填充缺损区域，密度接近正常骨组织密度。图2表示的是治疗42天后组织学检查结果模型对照组骨小梁生长缓慢，密度较低，缺损区域空隙较大，伤科接骨凝胶剂高剂量组骨小梁连成片状骨板，愈合良好，新生骨痂密度显著高于模型对照组，与伤科接骨片和活血接骨散组无明显差异。(X 20)
具体实施例方式实施例1药物涂膜剂的制备(I)称取下述重量配比的原料药
三七80份海星35份红花20份
炙鸡骨40份土鳖虫25份煅自然铜15份
炙乳香6份炙没药4份马钱子粉15份
朱砂10份甜瓜子6份冰片2份(2)以上十二味，除冰片、马钱子粉外，朱砂水飞成极细粉，其余药材粉碎成粗粉，与马钱子粉混合。(3)用60%乙醇煎煮3次，第一次加10倍量乙醇煎煮2小时，第二次加8倍量乙醇煎煮I小时，第三次加8倍量乙醇煎煮I小时。
(4)煎液滤过，滤液合并，煎液浓缩至相对密度为1. 00-1. 40 (35°C _45°C)。(5)加适量乙醇，放置过夜，滤过，滤液备用。(6)取聚乙烯醇适量，加60%乙醇使溶解，加入上述备用滤液，再加冰片及朱砂和甘油50g，搅拌，加60%乙醇调整总量至1000ml，即得。实施例2
软膏剂的制备(I)称取下述重量配比的原料药
三七80份海星40份红花15份
炙鸡骨40份土鳖虫30份煅自然铜25份 炙乳香4份炙没药6份马钱子粉20份
朱砂15份甜瓜子4份冰片3份(2)以上十二味，除冰片、马钱子粉外，朱砂水飞成极细粉，其余药材粉碎成粗粉，与马钱子粉混合。(3)用80%乙醇煎煮3次，第一次加12倍量80%乙醇煎煮1. 5小时，第二次加10倍量乙醇煎煮I小时,第三次加10倍量乙醇煎煮I小时。(4)煎液滤过，滤液合并，煎液浓缩至相对密度为1. 00-1. 40 (35°C _45°C)。(5)滤液中加入冰片、朱砂，混匀。(6)将上述(5)中的滤液加入到软膏基质拌均匀，制成lOOOg，即得。注软膏基质的制备取甘油80g，硬脂酸120g，三乙醇胺30g，液体石蜡180g，石蜡80g，羟苯乙酯1. 5g，蒸馏水加至lOOOg，置于一容器中，加热至85-90°C，待完全溶化，停止加热，搅拌至冷却，即得。实施例3贴膏剂的制备(I)称取下述重量配比的原料药
三七80份海星40份红花15份 炙鸡骨45份土鳖虫20份煅自然铜25份 炙乳香5份炙没药6份马钱子粉20份
朱砂10份甜瓜子4份冰片2份(2)以上十二味，除冰片、马钱子粉外，朱砂水飞成极细粉，其余药材粉碎成粗粉，与马钱子粉混合。(3)用60%乙醇提取三次，第一次加10倍量乙醇提取2小时，第二次加8倍量乙醇提取I小时，第三次加8倍量乙醇提取I小时。(4)滤过，合并滤液，回收乙醇，药液浓缩成相对密度为1.00-1.40 (35°C_45°C)
的清膏。
(5)，将上述清膏中加入冰片、朱砂极细粉混匀，另加由橡胶、氧化锌等制成基质，制成涂料。进行涂膏，盖衬，切片，即得。实施例4凝胶剂的制备
三七80g马钱子粉20g海星40g土鳖虫40g
炙鸡骨40g煅自然铜20g红花12g炙乳香4g
甜瓜子4g炙没药4g冰片2g朱砂IOg
卡波姆94OUg 三乙醇胺22.5g95%乙醇I5OmL 甘油50g
氮酮20g羟苯乙酯Ig处方量清膏约130g
蒸馆水加至IOOOg
共制IOOOg制法(a)以上十二味，除冰片、马钱子粉外，朱砂水飞成极细粉，其余药材粉碎成最粗粉。药材最粗粉与马钱子粉合并，用60%乙醇提取三次，第一次加10倍量60%乙醇提取1. 5小时，第二次加8倍量60%乙醇提取1. 5小时，第三次加8倍量60%乙醇提取1. 5小时。滤过，合并滤液，回收乙醇，药液浓缩至约130ml。(b)取卡波姆15g，加30倍量纯化水，浸泡48小时，使充分溶胀。取三乙醇胺22. 5g，用5倍量纯化水溶解，搅拌下加入，使形成凝胶。(C)取上述清膏，加入乙醇150ml、甘油50g、氮酮20g、羟苯乙酯lg、冰片，搅拌使溶解，加入朱砂，搅拌均匀后立即加入(b)中，加纯化水适量至规定量，搅拌均匀，即得。实施例5凝胶剂的制备
三七80g马钱子粉20g海星40g土鳖虫40g
炙鸡骨40g煅自然铜20g红花12g炙乳香4g
甜瓜子4g炙没药4g冰片2g朱砂IOg
卡波姆940 12g 三乙醇胺18g95%乙醇150mL 甘油5Og
氮酮20g羟苯乙酯Ig处方量清膏约130g
蒸馏水加至IOOOg
共制IOOOg制法(a)以上十二味，除冰片、马钱子粉外，朱砂水飞成极细粉，其余药材粉碎成最粗粉。药材最粗粉与马钱子粉合并，用60%乙醇提取三次，第一次加10倍量60%乙醇提取1. 5小时，第二次加8倍量60%乙醇提取1. 5小时，第三次加8倍量60%乙醇提取1. 5小时。滤过，合并滤液，回收乙醇，药液浓缩至约130ml。(b)取卡波姆12g，加30倍量纯化水，浸泡48小时，使充分溶胀。取三乙醇胺18g，用5倍量纯化水溶解，搅拌下加入，使形成凝胶。(C)取上述清膏,加入乙醇150ml、甘油50g、氮酮20g、轻苯乙酯lg、冰片,搅拌使溶解，加入朱砂，搅拌均匀后立即加入(b)中，加纯化水适量至规定量，搅拌均匀，即得。
实施例6实施例4得到的凝胶剂的检测方法性状内容物为红色胶状半固体，气微腥。鉴别(I)取本品，置显微镜下观察不规则颗粒细�。底睾焐泄庠螅咴蛋岛谏�(2)取本品约10g，加95%乙醇50ml，超声处理30分钟，放冷，滤过，溶液蒸干，残渣加水IOml微热使溶解，转移至分液漏斗中，加水饱和正丁醇提取3次，每次10ml，合并正丁醇提取液，再用正丁醇饱和的水洗涤3次，每次5ml，水液弃去。取正 丁醇液，水浴蒸干，残渣加甲醇Iml溶解，作为供试品溶液。另取三七对照药材O. 5g，按供试品溶液制备方法制备，作为对照药材溶液。照薄层色谱法(中国药典2010年版一部附录VI B)试验，吸取供试品溶液10 μ 1，对照品溶液10 μ 1，分别点于同一硅胶G薄层板上，以氯仿-甲醇-水(13 7 2)10°C以下放置12小时的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸无水乙醇溶液，在105°C加热至斑点显色清晰，置日光下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色斑点。(3)取本品约10g，加乙醚50ml，密塞，超声处理15min，滤过，乙醚液50° C水浴挥散至近干，残渣加醋酸乙酯Iml溶解，作为供试品溶液。另取冰片对照药材，加醋酸乙酯制成每Iml含IOmg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(中国药典2010年版一部附录
VIB)试验，吸取供试品溶液10 μ I与对照品溶液5 μ I,分别点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚(60 90°C )-丙酮(9 1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以1%香草醒浓硫酸溶液。在105° C加热至斑点显色清晰。置日光下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色斑点。(4)取本品约10g，加乙醇50ml，密塞，超声处理20分钟，放冷，滤过，溶液蒸干。残渣加3% (ml/ml)硫酸溶液IOml溶解，转移至分液漏斗中，以浓氨试液调pH9_10，加三氯甲烷提取2次，每次20ml。合并三氯甲烷液，水浴挥去三氯甲烷，残渣加三氯甲烷Iml溶解，作为供试品溶液。另取士的宁对照品、马钱子碱对照品，加三氯甲烷制成每Iml各含O. 5mg的混合溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(中国药典2010年版一部附录VI B)试验，吸取供试品溶液10 μ I与对照品溶液5 μ 1，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯-丙酮-乙醇-浓氨试液(3 6 :0.6:0. 4)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以稀碘化铋钾试液。置日光下检视，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色斑点。检查重金属及有害元素照铅、镉、砷、汞、铜测定法(附录IX B电感耦合等离子体质谱法)测定，铅不得过百万分之五；镉不得过百万分之三；砷不得过百万分之二 ；铜不得过百万分之十。pH值取本品IOgJP 10倍水溶解，照pH值测定法(中国药典2010年版一部附录
VIIG)操作，本品pH应在6. 5-7. 5之间。粒度取本品适量，置于载玻片上，涂成薄层，覆以盖玻片，共涂3片，照粒度测定法(中国药典2010年版一部附录XI B第一法)测定，均不得检出大于180 μ m的粒子。含量测定1.马钱子粉照高效液相色谱法(中国药典2010年版一部附录VI D)测定。色谱条件以十八烷基硅烷键合硅胶为填料，柱温室温，以乙腈-O. 01mol/L庚烷磺酸钠与O. 02mol/L的磷酸二氢钾等量混合溶液(用10%磷酸调节pH值2. 8) (21 79)为流动相，检测波长为254nm，理论塔板数按士的宁色谱峰计算，不得低于4000。对照品溶液制备取士的宁对照品适量，精密称定，加甲醇溶解，制成每Iml含O. 004mg的溶液。供试品溶液制备取本品约2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50ml，密塞，称定重量，超声处理(功率200w，频率60KHz) 30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，充分振�。斯÷艘�5ml，经微孔滤膜(0.45μπι)滤过，滤液作为供试品溶液。测定法分别精密吸取供试品溶液与对照品溶液各10μ 1，注入液相色谱仪中，测定，即得。本品每Ig含马钱子以士的宁(C 21H22N2 O2)计算，应为O. 128 O. 192mg。
2.三七照高效液相色谱法(中国药典2010年版一部附录VI D)测定。色谱条件以十八烷基硅烷键合硅胶为填料，柱温室温，以乙腈-水(21 :79)为流动相，检测波长为203nm，理论塔板数按人参皂苷Rg1色谱峰计算，不得低于10000。对照品溶液制备取人参皂苷Rg1对照品适量，精密称定，加甲醇溶解，制成每Iml含O.1mg的溶液。供试品溶液制备取本品约2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50ml，密塞，称定重量，超声处理(功率200w，频率60KHz) 30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，充分振�。斯÷艘�5ml，经微孔滤膜(0.45μπι)滤过，滤液作为供试品溶液。测定法分别精密吸取供试品溶液与对照品溶液各10μ 1，注入液相色谱仪中，测定，即得。本品每Ig含三七以人参皂苷Rg1 (C 42Η72014)计算，应为O. 128 O. 192mg。3.朱砂取本品约5g,精密称定,置250ml锥形瓶中，加硫酸40ml,硝酸钾6g,加热微沸30分钟，使成无色透明溶液，放冷，加水50ml，滴加I %高锰酸钾溶液至显粉红色以2min内不消失为度，再滴2%硫酸亚铁溶液至红色消失，用硫氰酸铵滴定液(0.05mol / L)滴定。每ImL硫氰酸铵滴定液(O. 05mol / L)相当于5. 815mg硫化萊。本品每Ig含朱砂以硫化萊(HgS)计算,应为O. 128 O. 192mg。实施例7实施例5得到的凝胶剂的检测方法性状内容物为红色胶状半固体，气微腥。鉴别(I)取本品，置显微镜下观察不规则颗粒细�。底睾焐泄庠螅咴蛋岛谏�。(2)取本品约IOg,加95%乙醇50ml,超声处理30分钟,放冷,滤过,溶液蒸干,残洛加水IOml微热使溶解，转移至分液漏斗中，加水饱和正丁醇提取3次，每次10ml，合并正丁醇提取液，再用正丁醇饱和的水洗涤3次，每次5ml，水液弃去。取正丁醇液，水浴蒸干，残渣加甲醇Iml溶解，作为供试品溶液。另取三七对照药材O. 5g，按供试品溶液制备方法制备，作为对照药材溶液。照薄层色谱法(中国药典2010年版一部附录VI B)试验，吸取供试品溶液10 μ 1，对照品溶液10 μ 1，分别点于同一硅胶G薄层板上，以氯仿-甲醇-水(13 7 2)10°C以下放置12小时的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸无水乙醇溶液，在105°C加热至斑点显色清晰，置日光下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色斑点。(3)取本品约10g，加乙醚50ml，密塞，超声处理15min，滤过，乙醚液50°C水浴挥散至近干，残渣加醋酸乙酯Iml溶解，作为供试品溶液。另取冰片对照药材，加醋酸乙酯制成每Iml含IOmg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(中国药典2010年版一部附录 VIB)试验，吸取供试品溶液10 μ I与对照品溶液5 μ 1，分别点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚(60 90°C)-丙酮(9 1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以1%香草醒浓硫酸溶液。在105°C加热至斑点显色清晰。置日光下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色斑点。(4)取本品约10g，加乙醇50ml，密塞，超声处理20分钟，放冷，滤过，溶液蒸干。残渣加3% (ml/ml)硫酸溶液IOml溶解，转移至分液漏斗中，以浓氨试液调pH 9_10，加三氯甲烷提取2次，每次20ml。合并三氯甲烷液，水浴挥去三氯甲烷，残渣加三氯甲烷Iml溶解，作为供试品溶液。另取士的宁对照品、马钱子碱对照品，加三氯甲烷制成每Iml各含O. 5mg的混合溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(中国药典2010年版一部附录VI B)试验，吸取供试品溶液10 μ I与对照品溶液5 μ 1，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯-丙酮-乙醇-浓氨试液(3 6 :0.6 :0. 4)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以稀碘化铋钾试液。置日光下检视，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色斑点。检查重金属及有害元素照铅、镉、砷、汞、铜测定法(附录IX B电感耦合等离子体质谱法)测定，汞不得过百分之一点五，铅不得过百万分之十；镉不得过百万分之五；砷不得过百万分之五；铜不得过百万分之二十。pH值取本品IOgJP 10倍水溶解，照pH值测定法(中国药典2010年版一部附录
VIIG)操作，本品pH应在6. 5-7. 5之间。粒度取本品适量，置于载玻片上，涂成薄层，覆以盖玻片，共涂3片，照粒度测定法(中国药典2010年版一部附录XI B第一法)测定，均不得检出大于180 μ m的粒子。含量测定1.马钱子粉照高效液相色谱法(中国药典2010年版一部附录VI D)测定。色谱条件以十八烷基硅烷键合硅胶为填料，柱温室温，以乙腈-O. 01mol/L庚烷磺酸钠与O. 02mol/L的磷酸二氢钾等量混合溶液(用10%磷酸调节pH值2. 8) (21 79)为流动相，检测波长为254nm，理论塔板数按士的宁色谱峰计算，不得低于5000。对照品溶液制备取士的宁对照品适量，精密称定，加甲醇溶解，制成每Iml含O. 004mg的溶液。供试品溶液制备取本品约2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50ml，密塞，称定重量，超声处理(功率250w，频率40KHz) 30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，充分振�。斯÷艘�5ml，经微孔滤膜(0.45μπι)滤过，滤液作为供试品溶液。测定法分别精密吸取供试品溶液与对照品溶液各10μ 1，注入液相色谱仪中，测定，即得。本品每Ig含马钱子粉以士的宁(C 21H22N2 O2)计算，应为O. 02 O. 20mg。2.三七照高效液相色谱法(中国药典2010年版一部附录VI D)测定。色谱条件以十八烷基硅烷键合硅胶为填料，柱温室温，以乙腈-水(21 :79)为流动相，检测波长为203nm，理论塔板数按人参皂苷Rg1色谱峰计算，不得低于10000。对照品溶液制备取人参皂苷Rg1对照品适量，精密称定，加甲醇溶解，制成每Iml含O.1mg的溶液。供试品溶液制备取本品约2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50ml，密塞，称定重量，超声处理(功率200w，频率60KHz) 30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，充分振摇，滤过，取滤液5ml，经微孔滤膜(0.45μπι)滤过，滤液作为供试品溶液。测定法分别精密吸取供试品溶液与对照品溶液各10μ 1，注入液相色谱仪中，测定，即得。本品每Ig含三七量以人参皂苷Rg1 (C42H72O14)计算，应为1. 17^2. 20mg。
3.朱砂取本品约5g,精密称定,置250ml锥形瓶中，加硫酸40ml,硝酸钾6g,加热微沸30分钟，使成无色透明溶液，放冷，加水50ml，滴加I %高锰酸钾溶液至显粉红色以2min内不消失为度，再滴2%硫酸亚铁溶液至红色消失，用硫氰酸铵滴定液(0.05mol / L)滴定。每ImL硫氰酸铵滴定液(O. 05mol / L)相当于5. 815mg硫化萊。本品每Ig含朱砂量以硫化萊(HgS)计算,应为7. O 13. Omg0药效学研究1.实验材料与动物1.1药物伤科接骨凝胶剂(实施例4制得的产品)，由辽宁中医药大学药剂教研室提供；活血接骨散，山东百草药业有限公司生产，国药准字Z21021461 ;伤科接骨片，大连美罗中药厂，国药准字Z21021461。1. 2动物新西兰家兔，2±0. 5kg，雌雄各半，由大连医科大学实验动物中心提供,动物合格证号SCXK (辽)2008-0002。1.3仪器与试剂X线摄影系统(岛津604-8511)；组织切片机(Leica, GermanySM2000R)；电子万能材料试验机(电子万能材料试验机型号TS9-TH5000-50KN);光学显微镜(Olympus, Japan) ;5804R高速冷冻离心机(德国Eppendorf公司);UV_1800紫外可见分光光度计(北京瑞利分析仪器公司)；碱性磷酸酶试剂盒，购于南京建成生物工程研究所。2.骨折动物模型制备与给药2.1骨折动物模型制备健康的日本大耳白兔90只，造模前饲养一周以适应饲养环境。随机取出12只作为空白对照组，其余家兔用于制备骨折模型。以10%乌拉坦(5ml/kg)腹腔注射麻醉，手术部位用8%硫化钠脱毛，温水洗净，75%乙醇消毒，用手术刀片在右前肢做一纵切口，逐层切开皮下组织，暴露肌肉，钝性分离肌肉组织，在桡骨中下1/3旋前圆肌止点处用钢锯锯出一段骨缺损，宽3_，深度暴露骨髓并以骨髓出血为度，保留尺骨完整，缝合皮肤，75%乙醇清洗创面，纱布缠绕，橡皮膏固定。术后肌肉注射青霉素，40万U/只，每天I次，连续3天以防止感染。2. 2分组、给药术后观察3天，再将骨折家兔随机分为6组(12只/组):模型对照组，伤科接骨凝胶剂低、中、高剂量组(O. 25g .kg'O· 5g · kg'Ig · kg'外婁女)，伤科接骨片组(O. 12g · k^1, 口服)，活血接骨散组(O. 5g · k^1,白酒调匀外敷)。术后第四天开始给药，各组外用剂按上述剂量均匀涂抹在手术部位大约4cm2的区域，纱布固定，每日换药I次；伤科接骨片组将药片磨成细粉，按上述剂量拌入饲料中，每日定时定量喂给饲料。各组连续给药42天。另取12只正常健康家兔作为空白对照组，不予任何处理。3.检测指标与方法分别于给药治疗后21、42天，每组各取出6只家兔，以空气栓塞法处死，取出桡骨，剔去筋膜肌肉等组织，保留尺骨及两端关节完整，不破坏骨痂，清水洗净，进行以下检测。3.1 X线检查分别于治疗21、42天后取出挠骨标本作X线检查，通过X光片观察骨痂形成、骨折端边缘、骨折线、骨痂密度与骨皮质等，依据上海骨伤科研究所制定的骨折X线评分标准，对每个标本进行结果评分。3. 2生物力学检查分别将上述拍摄过X线的桡骨标本放置于万能材料试验机上，保持桡骨弯曲方向一致，压头加载速度Imm · min—1，跨距为2cm，检测破断载荷，根据应力应变公式计算相应的应力指标。 3. 3组织学检察分别于给药治疗21、42天后取出桡骨，弃除全部软组织，将挠骨组织用低速锯纵形劈开，一分为二，一半在10%中性福尔马林溶液中固定，常规脱钙，石蜡包埋，切片，H. E.染色，光学显微镜检察、摄片，依据Zhukauskas组织学分级标准，以骨痂形成量为分析指标，对每个标本进行组织学评分。3. 4骨折家兔血清碱性磷酸酶(ALP)含量测定各组家兔分别于治疗14、21、28天后心脏采血2ml，2000r · min—1离心lOmin，取上层血清，_80°C冰箱中保存备用，待第28天最后一次采血得血清后一起检测，按试剂盒说明书处理血清，用紫外可见分光光度计测得吸光值，计算血清中碱性磷酸酶(ALP)含量。3. 5统计学处理结果以均值土标准差(x± S )表示，采用SPSS15. O软件完成统计处理，各组间比较采用t检验分析。4.结果4.1 X线检查结果X线摄片显示21天时模型组骨缺损部位骨折线清晰可见，只有极少量骨痂生长；伤科接骨凝胶剂高、中、低三个剂量组骨折线均已�：怯凹又兀飨钥杉丘枭ぃ辉�42天时，模型组骨折线虽已�：钥杉丝平庸悄杭寥黾亮孔楣钦巯咄耆：缦尴В丘枭ぱ杆伲负跆盥侨彼鹎颍律丘栌胫芪Ч敲苤氏嗔颐芏冉咏敲苤剩渲杏纫愿呒亮孔樽饔米蠲飨�。评分结果显示高剂量伤科接骨凝胶剂组分值最高，与模型组比较差异显著(P〈0. 01)，与伤科接骨片和活血接骨散组比较，虽略有增高，但无显著性差异(P>0. 05)，说明高剂量伤科接骨凝胶剂能显著提高骨痂形成质量，此作用与伤科接骨片和活血接骨散比较无显著差异。见图1、表I。表1.家兔烧骨X线评分结果(x±s,n=6 )
组别剖量评分
_g'kg1_21 天_42 天
模型对照-0.67士0.521.50士0.55伤科接骨凝胶剂低剂量 0.251.50±0.55*2.00±0.63 伤科接骨凝胶剂中剂量 0.5 1.50士0.55* 2.20±0.41*
伤科接骨凝胶剂高剂量I1.83±0.41 2.77±0.52**
伤科接骨片0.121.83士0.41 2.20±0.41*
活血接骨散0.51.67±0.52**2.50±0.55*
注*P < O. 05，**P < 0. 01，与模型对照组比较。4. 2生物力学检测结果21、42天时模型对照组家兔桡骨的破断载荷显著小于空白对照组(P〈0. 01)，说明模型制备成功；而伤科接骨凝胶剂组均高于模型对照组，尤以高剂量组最为显著(P〈0. 05)，说明高剂量伤科接骨凝胶剂能改善新生骨的生物力学性能，提高新骨的形成质量，此作用效果与伤科接骨片和活血接骨散无显著差异，见表2。表2伤科接骨凝胶剂对家兔桡骨生物力学的影响(V1.V1/7=6 )
权利要求
1.一种伤科接骨的外用制剂的检测方法，所述外用制剂是由下述重量配比的药材制备的三七 26-100份炙鸡骨13-50份炙乳香1-6份朱砂 3-16份海星13-50份土鳖虫13-60份炙没药1-6份红花 4-24份缎自然铜6-26份马钱子粉6-25份冰片0.5-4份甜瓜子1-6份其中，以上十二味药材，除冰片、马钱子粉外，朱砂水飞成极细粉，其余药材粉碎成粗粉，与马钱子粉混合，用乙醇提取并浓缩成清膏，然后，将该清膏、冰片、朱砂与药学上可接受的辅料制备成外用制剂；所述的检测方法包括如下项目性状、鉴别和含量测定。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其中，所述外用制剂是由下述重量配比的药材制备的三七80份海星35份红花20份炙鸡骨40份土鳘虫25份嘏自然铜15份炙乳香6份炙没药4份马钱子粉15份朱砂10份甜瓜子6份冰片2份。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其中，所述外用制剂是由下述重量配比的药材制的备三七80份海星40份炙鸡骨40份土鳖虫30份炙乳香4份炙没药6份朱砂15份甜瓜子4份红花15份缎自然铜25份马钱子粉20份冰片3份。的备
4.根据权利要求1所述的检测方法，其中，所述外用制剂是由下述重量配比的药材制三七80份海星40份红花15份炙鸡骨45份土鳖虫20份煅自然铜25份炙乳香5份炙没药6份马钱子粉20份朱砂10份甜瓜子4份冰片2份。
5.根据权利要求1所述的检测方法，其中，所述外用制剂是由下述重量配比的药材制的备.七 80份-■3.. 40 份炙鸡骨40份土鳖虫40份炙乳香4份朱砂10份4份红花 12份煅自然铜20份马钱子粉20份冰片2份。甜瓜子4份
6.根据权利要求1至5中任一权利要求所述的检测方法，其中，所述的鉴别为(1)取所述外用制剂，置显微镜下观察；不规则颗粒细�。底睾焐泄庠螅咴蛋岛谏�(2)取所述外用制剂约IOg,加95%乙醇50ml,超声处理30分钟,放冷,滤过，溶液蒸干， 残渣加水IOml微热使溶解，转移至分液漏斗中，加水饱和正丁醇提取3次，每次10ml，合并正丁醇提取液，再用正丁醇饱和的水洗涤3次，每次5ml，水液弃去；取正丁醇液，水浴蒸干， 残渣加甲醇Iml溶解，作为供试品溶液；另取三七对照药材O. 5g，按供试品溶液制备方法制备，作为对照药材溶液；照薄层色谱法(中国药典2010年版一部附录VI B)试验，吸取供试品溶液10 μ 1，对照品溶液10 μ 1，分别点于同一硅胶G薄层板上，以氯仿-甲醇-水(13 7 2)10°C以下放置12小时的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸无水乙醇溶液，在105°C加热至斑点显色清晰，置日光下检视；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色斑点；(3)取所述外用制剂约10g，加乙醚50ml，密塞，超声处理15min，滤过，乙醚液50°C水浴挥散至近干，残渣加醋酸乙酯Iml溶解，作为供试品溶液；另取冰片对照药材，加醋酸乙酯制成每Iml含IOmg的溶液，作为对照品溶液；照薄层色谱法(中国药典2010年版一部附录 VI B)试验，吸取供试品溶液10 μ I与对照品溶液5 μ I,分别点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚(60 90°C )-丙酮(9 1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以1%香草醒浓硫酸溶液； 在105°C加热至斑点显色清晰；置日光下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色斑点；(4)取所述外用制剂约10g，加乙醇50ml，密塞，超声处理20分钟，放冷，滤过，溶液蒸干；残渣加3% (ml/ml)硫酸溶液IOml溶解，转移至分液漏斗中，以浓氨试液调pH 9_10，加三氯甲烷提取2次，每次20ml ;合并三氯甲烷液，水浴挥去三氯甲烷，残渣加三氯甲烷Iml 溶解，作为供试品溶液；另取士的宁对照品、马钱子碱对照品，加三氯甲烷制成每Iml各含 O. 5mg的混合溶液，作为对照品溶液；照薄层色谱法(中国药典2010年版一部附录VI B)试验，吸取供试品溶液10 μ I与对照品溶液5 μ 1，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯-丙酮-乙醇-浓氨试液(3 6 :0. 6 :0. 4)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以稀碘化铋钾试液；置日光下检视，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色斑点。
7.根据权利要求1至5中任一权利要求所述的检测方法，其中，所述的检查为重金属及有害元素的检查，照中国药典附录IX B电感耦合等离子体质谱法测定铅、镉、砷、汞、铜测定法。
8.根据权利要求1至5中任一权利要求所述的检测方法，其中，所述含量测定为应用中国药典2010年版一部附录VI D高效液相色谱法进行测定。
9.根据权利要求1至5中任一权利要求所述的检测方法，其中，所述外用制剂为凝胶剂。
10.根据权利要求9所述的检测方法，包括性状内容物为红色胶状半固体，气微腥；鉴别(1)取所述凝胶剂，置显微镜下观察不规则颗粒细�。底睾焐泄庠螅咴蛋岛谏�(2)取所述凝胶剂约10g，加95%乙醇50ml，超声处理30分钟，放冷，滤过，溶液蒸干， 残渣加水IOml微热使溶解，转移至分液漏斗中，加水饱和正丁醇提取3次，每次10ml，合并正丁醇提取液，再用正丁醇饱和的水洗涤3次，每次5ml，水液弃去；取正丁醇液，水浴蒸干， 残渣加甲醇Iml溶解，作为供试品溶液；另取三七对照药材O. 5g，按供试品溶液制备方法制备，作为对照药材溶液；照薄层色谱法(中国药典2010年版一部附录VI B)试验，吸取供试品溶液10 μ 1，对照品溶液10 μ 1，分别点于同一硅胶G薄层板上，以氯仿-甲醇-水(13 7 2)10°C以下放置12小时的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸无水乙醇溶液，在105°C加热至斑点显色清晰，置日光下检视；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色斑点；(3)取所述凝胶剂约10g，加乙醚50ml，密塞，超声处理15min，滤过，乙醚液50°C水浴挥散至近干，残渣加醋酸乙酯Iml溶解，作为供试品溶液；另取冰片对照药材，加醋酸乙酯制成每Iml含IOmg的溶液，作为对照品溶液；照薄层色谱法(中国药典2010年版一部附录 VI B)试验，吸取供试品溶液10 μ I与对照品溶液5 μ 1，分别点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚(60 90°C)-丙酮(9 1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以1%香草醒浓硫酸溶液； 在105°C加热至斑点显色清晰；置日光下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色斑点；(4)取所述凝胶剂约10g，加乙醇50ml，密塞，超声处理20分钟，放冷，滤过，溶液蒸干； 残渣加3% (ml/ml)硫酸溶液IOml溶解，转移至分液漏斗中，以浓氨试液调pH 9_10，加三氯甲烷提取2次，每次20ml ;合并三氯甲烷液，水浴挥去三氯甲烷，残渣加三氯甲烷Iml溶解， 作为供试品溶液；另取士的宁对照品、马钱子碱对照品，加三氯甲烷制成每Iml各含O. 5mg 的混合溶液，作为对照品溶液；照薄层色谱法(中国药典2010年版一部附录VI B)试验，吸取供试品溶液.10 μ I与对照品溶液5 μ 1，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯-丙酮-乙醇-浓氨试液(3 6 :0.6 :0. 4)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以稀碘化铋钾试液；置日光下检视，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色斑点；检查重金属及有害元素照铅、镉、砷、汞、铜测定法(附录IX B电感耦合等离子体质谱法)测定，汞不得过百分之一点五，铅不得过百万分之十；镉不得过百万分之五；砷不得过百万分之五；铜不得过百万分之二十；pH值取所述凝胶剂10g，加10倍水溶解，照pH值测定法(中国药典2010年版一部附录VII G)操作，所述凝胶剂pH应在6. 5-7. 5之间;粒度取所述凝胶剂适量，置于载玻片上，涂成薄层，覆以盖玻片，共涂3片，照粒度测定法(中国药典2010年版一部附录XI B第一法)测定，均不得检出大于180 μ m的粒子；其他所述凝胶剂应符合凝胶剂项下有关的各项规定(中国药典2010年版一部附录IQ)； 含量测定
.1.马钱子粉照高效液相色谱法(中国药典2010年版一部附录VID)测定； 色谱条件以十八烷基硅烷键合硅胶为填料，柱温室温，以乙腈-O. 01mol/L庚烷磺酸钠与O. 02mol/L的磷酸二氢钾等量混合溶液(用10%磷酸调节pH值2. 8) (21 79)为流动相，检测波长为254nm，理论塔板数按士的宁色谱峰计算，不得低于5000 ； 对照品溶液制备取士的宁对照品适量，精密称定，加甲醇溶解，制成每Iml含O. 004mg的溶液； 供试品溶液制备取所述凝胶剂约2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50ml，密塞，称定重量，超声处理(功率250w，频率40KHz) 30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，充分振�。斯⌒艘�5ml，经微孔滤膜(0.45μπι)滤过，滤液作为供试品溶液； 测定法分别精密吸取供试品溶液与对照品溶液各10μ 1，注入液相色谱仪中，测定，SP得; .2.三七照高效液相色谱法(中国药典2010年版一部附录VID)测定； 色谱条件以十八烷基硅烷键合硅胶为填料，柱温室温，以乙腈-水(21 79)为流动相，检测波长为203nm，理论塔板数按人参皂苷Rgl色谱峰计算，不得低于10000 ； 对照品溶液制备取人参皂苷Rgl对照品适量，精密称定，加甲醇溶解，制成每Iml含.O.1mg的溶液； 供试品溶液制备取所述凝胶剂约2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50ml，密塞，称定重量，超声处理(功率250w，频率40KHz) 30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，充分振�。斯÷艘�5ml，经微孔滤膜(0.45μπι)滤过，滤液作为供试品溶液； 测定法分别精密吸取供试品溶液与对照品溶液各10μ 1，注入液相色谱仪中，测定，即得; .3.朱砂 取所述凝胶剂约5g,精密称定,置250ml锥形瓶中，加硫酸40ml,硝酸钾6g,加热微沸·30分钟，使成无色透明溶液，放冷，加水50ml，滴加I %高锰酸钾溶液至显粉红色以2min内不消失为度，再滴2%硫酸亚铁溶液至红色消失，用硫氰酸铵滴定液(0.05mol / L)滴定；每ImL硫氰酸铵滴定液(O. 05mol / L)相当于5. 815mg硫化萊。
全文摘要
本发明公开了一种伤科接骨外用制剂的检测方法。所述伤科接骨外用制剂是由十二味药材制备而成，用乙醇提取并浓缩成清膏，然后，该清膏、冰片、朱砂以及药学上可接受的辅料相混合。本发明是采用现代先进提取浓缩技术生产而成，有效的保留了药材中的活性物质和药材的有效成分，大大提高了生药成分的溶出度，同时提高了生物利用度，有效提高了治疗效果。同时，克服了现有技术的不足，直接透皮吸收，起效迅速，稳定性良好，便于使用、携带和保存；本发明的工艺简单易行，原料及辅料来源稳定，易于产业化。
文档编号G01N30/02GK102998412SQ20121055585
公开日2013年3月27日 申请日期2012年12月19日 优先权日2011年12月27日
发明者张成海, 周文波, 李冬梅, 陈菲 申请人:大连美罗中药厂有限公司
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