专利名称：一种基于纳米钯标记及其催化沉积放大的生物检测方法
技术领域：
本发明属于生物分子检测与纳米材料的应用领域，特别涉及到纳米Pd在生物分 子(DNA、蛋白质等分子)标记、自催化信号放大，提供了一种除传统放射性标记、荧光标记及 纳米金标记之外的一种新型生物分子标记与检测技术。
背景技术：
生物分析和生物信息采集是生物医学研究和疾病临床诊断的基�。绾谓⒁桓� 灵敏度高、选择性好、成本低、分析速度快、自动化及能在复杂体系中在线连续检测等优点 的检测方法，对疾病的预防、诊断和治疗有着重要的理论意义与应用价值。根据检测信息量 的多少，通常将检测技术分为单个生物传感器、生物传感芯片及生物芯片等几个方面。其本 质均是利用生物分子识别原理，将其过程中产生的各种变化转换成光、电、磁、压电、声等物 理信号进行检测分析。在各种检测手段中，电化学检测与光学检测是研究最多的两大类型 检测技术。特别是先对生物分子进行荧光物质或化学发光底物酶标记，然后通过光学信号 检测的路线，仍然是现在的主流检测手段。但以上传统方法同时也存在各种局限性，如前者 容易出现重复性差、而后者往往存在荧光分子的光漂白现象、动力学范围窄及需要精密的 光学系统等缺点，所以不断寻找新的检测手段仍是科学家的梦想。近年来，纳米材料在生物分子的标记与检测中的应用已成为生物分析领域最具 活力的研究方向。纳米材料通常具有比表面积大、高活性、极微小性等特点，而这些特性与 传感器所要求的多功能化、微型化、高速化等要求相对应。此外，纳米颗粒还在光学、磁性、 催化等方面表现出一些特异性能。比如，由于半导体纳米粒子具有荧光产率极高、发射峰 窄、Mocks位移随粒径可调等优点，自1998年kience报道用于生物大分子的标记以来， 量子点就被广泛地用于各种生物分子的发光材料标记，为开辟高灵敏度与多通道的同时检 测的光学生物传感器供了可能。利用各种金属纳米颗粒(Au、Ag)的表面等离子体共振对光 学影响的特性而发展起来各种标记与检测方法更是其中的一个亮点，其中最为典型的就是 围绕纳米Au所开展的一系列工作。如Mirkin教授等利用纳米Au在DNA片段作为组装分 子的引导下可形成超分子结构的特点，建立了用巯基化寡核苷酸探针标记纳米Au并检测 特定多核苷酸序列的新方法。1997年，他们利用纳米Au粒子在聚集过程中距离变化而产生 红色到黄色的颜色变化，检出lOfmol/L的多聚核苷酸。2000年，他们结合纳米Au标记与 银染显色技术，有效地放大了杂交信号，比现有最灵敏的共聚焦诱导荧光检测方法灵敏100 倍。2002年，他们加以改进使得正配/单碱基错配的信号强度比大大提高，达到了 105:1， 而检测灵敏度提高到500fmol。另外，在专利ZL2113147. 3中，刘等人也提出利用一种基因 芯片的纳米金标记银染检测方法。在本发明中，我们提出了一种新型的利用纳米Pd进行生物分子标记，并结合纳米 Pd的催化性能，利用化学镀进行信号放大，最终借助化学镀后所表现出的性能如光学、磁 性等特性进行检测的一种新型生物分子检测路线，如图1所示。与目前各种文献及专利所 报道的方法相比，该路线具有以下优点(1)从目标分子与探针分子的反应动力学角度看，纳米Pd标记时更利于反应的进行。因为连有纳米颗粒的目标分子向探针表面的扩散速度 一般反比于颗粒的粒径，即颗粒的直径越�。浞从λ俣仍娇�。此外，由于纳米Pd粒径表面 对生物分子的非特异性吸附较少，从而更利于标记的目标生物分子在溶液中分散、保存，有 效避免了一些其它纳米颗粒标记目标生物分子时所出现的颗粒间相互团聚现象；(2)相对 于其它检测手段来说，通过Pd的催化作用进行化学沉积技术路线更为简单、方便，不需要 昂贵的检测仪器。这一点类似于专利ZL2113147. 3，但鉴于目前Pd的价格要低于Au，因此 该技术路线在成本上将更为低廉。同时，又不丧失检测灵敏度，溶液中只需少量的目标分子 结合到探针分子上，就可以通过Pd的催化作用进行检测。(3)跟专利ZL2113147. 3所用的 相对纳米金标记银染方法相比，由于纳米Pd是传统的催化材料，被广泛地应用各种催化反 应中，因而具有更广的催化性能，不仅能催化Ag+，同时还可以催化Cu2+、CO2+、Ni2+等各种金 属离子。因此，从催化放大效应及随后的所镀(或所染)金属性质来看，我们所提路线将更优 于传统的Au标银染技术。比如，传统的Au标银染技术虽然也是通过纳米Au对Ag+的还原 有催化作用，而将Ag沉积在Au颗粒表面。但最终信号检测是通过肉眼来观察单质银所呈现 的黑色斑点，或用普通的扫描仪扫描后再用相关软件来分析信号的灰度。很显然，这种信号 强度取决于银沉积斑点的大小与颜色深度。但以纳米Pd为标记时，不仅可以通过沉积的颜 色来检测(如Cu的沉积)，而且还可以利用通过催化M或Co等磁性材料进行磁学检测如利 用巨磁阻效应的磁敏元件进行信号读�。耸保浼觳饬槊舳冉对陡哂谏厦娴难丈觳狻� 另外，也可利用电化学手段如循环伏安法等对上述Pd催化沉积结果进行检测。
发明内容
技术问题本发明的目的是提出一种基于纳米钯标记及其催化沉积放大的生 物检测方法，目的之一是提出一种对生物分子如(DNA或蛋白质等)进行纳米Pd标记的方 法，即先通过巯基或氨基等功能团与Pd表面的配位络合作用，将特定稳定剂连接到纳米颗 粒表面，同时再利用稳定剂上的其他功能团如羧基等进一步将生物分子如(DNA或蛋白质 等)连接到其表面。最终要求以上所制颗粒在缓冲溶液中
有着良好的分散性。本发明的目的之二是着眼于Pd的催化性能，通过化学镀方法，实现检测物的信号 放大，最终借助于沉积后的各种物理性质如光、磁、电等进行检测。技术方案根据上述目标，首先要寻找到一种合适的纳米Pd颗粒制备与表面修 饰路径，要求所得颗粒能满足进行生物分子标记与检测的一些基本要求如粒径较小、均 一、能稳定存在缓冲溶液中如PBS以及在方便与生物分子连接的同时，能降低对其他生物 分子的非特异性吸附。其次，找到一种简易的基于Pd颗粒的催化沉积过程，要求该过程对 生物分子之间的相互作用无明显影响，同时又能具有明显的信号放大与方便检测。本发明的基于纳米钯标记及其催化沉积放大的生物检测方法利用纳米钯颗 粒对
生物分子进行标记，并结合纳米钯的催化性能，利用化学镀进行信号放大，最终借助化 学镀后所表现出的光学、磁性特性进行检测。所述的纳米钯颗粒，其粒径在O-IOOnm之间，以乙醇或水合胼为还原剂，以柠檬酸 钠、PVP、PEG-SH、CTAB或SDS为稳定剂还原得到。
所述的生物分子包含DNA片段、蛋白质。 在对纳米钯表面修饰生物分子之前，利用二步法，将HS- (CH2) n-C00H或H2N- (CH2) n-C00H取代稳定剂分子连接到钯颗粒表面；所谓两步法是指第一步先将纳米钯颗粒表面的 稳定剂被TA取代，然后利用第二步，再将纳米钯颗粒表面的TA部分被HS-(CH2)n-COOH取 代；其中，η在4-20之间；
直接将获得的Pd纳米颗粒与所述生物分子直接孵育制得纳米Pd颗粒标记生物分子。将所获得的HS-(CH2)n-COOH修饰钯纳米颗粒与生物分子孵育制得纳米Pd颗粒标 记生物分子。在纳米钯颗粒标记的生物分子与探针分子发生生物作用之后，利用化学镀过程， 借助Pd的催化作用，在纳米钯颗粒周围进一步沉积上金属颗粒进行信号放大。化学镀过程指在不通电的情况下，利用氧化还原反应在纳米Pd周围获得一层金 属单质或合金；其中，涉及的金属包括镍、铜、锌、钴、银、金、铁或它们间组合成的合金。所述的检测是基于上述化学镀后所表现出的光学、磁性及其它特性；光学指沉积 后的颜色变化，能依据肉眼进行判断，活用灰度扫描仪进行；磁性指镀层所表现出的磁学特 性，借助巨磁阻效应和超导量子干涉仪进行信号检测；其他特性包括将以上镀层溶解后，再 借助电化学技术，检测溶解后的金属离子浓度。该检测过程不仅适用于生物芯片检测，进行高通量的筛�。币部捎糜诘ジ錾� 物传感器，进行单个生物分子的检测。有益效果与前面已报道的文献或专利相比，尽管本发明中所陈述的技术方案，从 某种程度看，上述路线有点类似“Au标银染”技术，同样也是利用金属纳米颗粒标记，再利 用其催化作用进行信号放大，但从信号检测的灵敏度角度看，该路线又要优于“Au标银染”。 因为前者的催化过程更广，价格也更为低廉。从纳米材料与生物检测相结合的学科发展趋 势看，本专利所延伸出的纳米Pd标记生物分子技术将扩大了生物分子标记技术，并在其他 生物检测技术如电化学检测中发挥一定作用，迎合了学科的发展。
下面结合附图和具体实施方式
对对本发明的技术方案作进一步详细的描述
图1、基于纳米Pd标记自催化放大的检测过程示意图。图Ia为DNA微阵列，图Ib为待 测DNA与Pd标记DNA在生物分子作用下结合到特定的序列上，图Ic化学镀后的微阵列，图 Id与图Ic 一样显示了化学镀后的微阵列表面，在纳米Pd颗粒周围沉积上一层金属层。图2、基于两步法进行Pd纳米颗粒表面修饰的示意图，第一步先用硫辛酸将前 面的稳定剂取代，第二步，再用HS-(CH2)n - COOH将硫辛酸取代，最终得到Pd - S-(CH2)n -COOH纳米颗粒。图3、基于镀层磁学特性的检测示意图。图3a、图北显示了经过DNA-Pd NPs与不 同序列杂交及化学镀后的微阵列，图3c、图3d分别显示了利用巨磁阻效应的检测头进行信 号读�。渲校�3c处由于没有镀层，因此信号为零，图3d因镀层的存在，而给出响应信号。
具体实施例方式下面对上面技术路线作进一步解释，首先以柠檬酸钠为稳定剂，利用共沉淀法制备了平均粒径在IOnm左右的Pd纳米颗粒。在进行DNA标记时，可以利用直接法或间接法两 种途径将其连接到纳米Pd表面。前者指将先前制得纳米Pd颗粒直接与巯基或氨基修饰的 DNA片段孵育而得到。后者指在连接DNA分子之前，先用两步法，如图2所示，将压^⑴吐、 -COOH (其中，η在4-20之间)取代前面制备Pd颗粒的稳定剂，然后再在EDC与NHS的作 用下，将氨基修饰的DNA，通过形成的希夫键(Schiff bond)连接到Pd纳米颗粒表面，从而 完成目标分子的纳米Pd标记。上述过程得到的Pd纳米颗粒标记生物分子在缓冲溶液中 将比直接法更为稳定。完成纳米钯标记后，通过生物分子之间的相互作用(如杂交过程)将 纳米Pd颗粒标记的目标分子上连接到已知序列的生物芯片表面。在清洗掉非特异性吸附 在微阵列表面的目标分子后，按照图1所示过程，将所得芯片浸人到含铜的化学镀液中进 行信号放大，数分钟后取出芯片用水简单清洗，最终在连接目标分子的Pd颗粒周围沉积上 大量的铜颗粒。结果显示，利用化学镀非�：玫那至送耆ゲ�(铜颜色很深)、错配一个 碱基(铜颜色较浅)及错配两个碱基(铜颜色较浅)的DNA序列，其灵敏度与Au标银染技术 相当，能达到500fmol左右。需要说明的是，上面所述中，纳米Pd的制备是以柠檬酸钠为稳定剂、乙醇为还原 剂在水溶液中制备。当以PE(}2_-SH、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB) 或十二烷基酸钠(SDS)等为稳定剂，或以水合胼为还原剂时，所制得的纳米Pd颗粒也同样 适用于上面所提及的两步法表面修饰过程，最终将其转化为5-巯基十一烷酸修饰Pd纳米 颗粒。此外，从修饰的生物分子类型看，不仅包含了氨基修饰DNA分子链，同时也可以扩展 到蛋白质分子，均可以利用希夫键将这些分子修饰到Pd颗粒表面。从化学镀的过程看，纳 米Pd不仅可以对Cu2+进行催化沉积，同时还可以对Ni2+、Co2+等离子进行沉积，从而实现检 测信号放大。而当以M2+、Co2+等离子为镀液时，还可以根据所镀层的磁学性质对其进行定 量分析。图3给出了以巨磁阻感应传感器为检测磁头的检测示意图，当在没有镀层的位点， 其检测信号为零，只有在完全正配的位点，才有检测电流，从而提高了检测灵敏度，便于进 行高通量筛选。另外，从检测技术角度看，上面所列举的过程中是通过探针固定在玻璃基材 上所制的微阵列进行检测的，事实上该过程还适合单个生物传感器、生物传感芯片及生物 芯片等范围。对于单个生物传感器比如压电石英晶体的生物传感器，也可通过基于纳米Pd 的催化沉积过程，进行信号放大。实施例一以乙醇为还原剂、柠檬酸钠为稳定剂制备纳米Pd颗粒
以c (柠檬酸钠)/ c (H2PdCl4) =10，c (H2PdCl4)=O. 5mM为例，先向IOOmL的圆底烧瓶 中加入15mL H2PdCl4溶液QmM)、0. 0882g柠檬酸钠、2mL乙醇和43ml ddH20，机械搅拌加热 回流池。溶液由棕黄色变成棕褐色，即得到柠檬酸钠稳定的Pd纳米颗粒。接着，将所制颗 粒高速离心(12000rmin, 30min),除去上清液，再重新溶解于ddH20中，如此反复操作3次， 留着下一步使用。从表征结果可以看出，所得颗粒大小均一，呈圆形，平均粒径在10 nm左 右ο实施例二 以乙醇为还原剂、PVP为稳定剂制备纳米Pd颗粒
将106. 4 mg PdCl2、6.0 mL浓度为0. 2 M的HCl水溶液加人到四4 mL 二蒸水中，超声 30分钟，配成2.0 mM &PdCl4溶液。取其中15 mL，并与35 mL水与乙醇的混合溶液(乙醇 的含量在10-70 vol %之间)及一定量的PVP (0. 333-133 mg之间)一起加入到100 mL的 圆底烧瓶中加热回流池。反应后，将所制颗粒高速离心(12000rmin，30min)，除去上清液，再重新溶解于ddH20中，如此反复操作3次，留着下一步使用。实施例三以PEG 2k-SH为稳定剂、水合胼为还原剂制备纳米Pd颗粒、
将0.500 g PdCl2、0. 33 g NaCl加人到250 mL 二蒸水中，超声30分钟，配成0. Oil M Na2PdClyK溶液。然后将0.55 mmol PEG 2k_SH溶于10 mL以上制备的Na2PdCl4水溶液中。 在剧烈搅拌下，向该混合溶液中逐滴加入10 mL含有0.22 mmol水合胼及0. 22 mmol氢氧 化钠的水溶液。随着反应的进行，溶液的颜色迅速变为黑色。滴加完后，反应在继续搅拌30 分钟。反应后，将所制颗粒高速离心(12000rmin, 30min),除去上清液，再重新溶解于ddH20 中，如此反复操作3次，留着下一步使用。实施例四以CTAB为稳定剂、乙醇为还原剂制备纳米Pd颗粒
在30 ° C下，将4 g乙酰丙酮钯、5 g CTAB溶解于200 mL体积比为5/1的甲苯/四 氢呋喃混合溶液中，并向其中加入25 mL无水乙醇。接着，在65 ° C下，将上面所得混合 溶液加热回流12 h。随着反应的进行，溶液的颜色逐渐转为棕黑色。反应结束后，搅拌下向 所得混合溶液中加入IOOmL无水乙醇，以促进Pd纳米颗粒从溶液中沉积出来。去掉上清液 后，将所得沉淀用乙醇溶液清洗三次，以便除去多余的稳定剂及残留的甲苯溶液。最后，用 水清洗两次，从而将所制Pd纳米颗粒转移到水溶液中，配成lmg/ml的pd纳米颗粒水溶液， 留着下一步使用。实施例五Pd纳米颗粒的HS-DNA直接修饰
将2 mL实施例一至四所制备的Pd胶体溶液与1 OD巯基探针Pl(Pd-5’-HS-AGC TCT CAA ACT TTT _3’，其最终浓度大约在3. 51 μ M)混合，室温下孵育16 h。加入3 ml磷酸 缓冲液(10 mM PB，0. 1 M NaCl，pH 7)，继续孵育 48 h。然后在 14000rpm 下离心 25 min, 以分离未标记的DNA。离心后除去上层清液，底层的黑色沉淀重新用5 ml磷酸缓冲液(10 mM PB，0.1 M NaCl, pH 7)稀释，再次在HOOOrpm下离心25 min，除去上清液，下层黑色 沉淀加入Iml 2XPBS液(10 mM PB，0.3 M NaCl, pH 7)，母液贮存于4°C备用。
实施例六利用两步法对Pd纳米颗粒表面进行的HS-(CH2)n-COOH修饰 对部分前面所得Pd纳米颗粒还可以利用两步法(其过程如图2所示)，对其表面进行 HS- (CH2) η-COOH,以便进一步提高所得Pd纳米颗粒在缓冲溶液中的稳定性及对生物分子的 非特异性吸附。第一步，将2 ml实施例一、实施例二与实施例四所制备的胶体Pd溶液与1 ml lmol/L的TA水溶液混合、超声2分钟，然后再室温下孵育8 h。然后，在HOOOrpm下离心25 min,除去未交换到Pd表面的TA及交换下来的柠檬酸钠稳定剂(或其他稳定剂)。重复以上 过程两次，每次离心后除去上层清液，底层的黑色沉淀重新用5 ml水溶液稀释分散。第二 步，将以上溶液分散在2 ml水中，并加入1 ml 0.5 mol/L的HS-(CH2) n-C00H水溶液混合， 孵育M小时。之后，在HOOOrpm下离心30 min,除去未交换到Pd表面的HS- (CH2) n_C00H及 交换下来的TA。缓冲冲液每次的DNA接着，加入3 ml磷酸缓冲液(10 mM PB，0. 1 M NaCl, PH 7)，重复以上过程两次，每次离心后除去上层清液，底层的黑色沉淀重新用2 ml (10 mM PB，0.1 M NaCl, pH 7)缓冲溶液稀释分散。最后，将下层黑色沉淀加入Iml 2XPBS液(10 mM PB，0.3 M NaCl, pH 7)，母液贮存于 4°C备用。实施例七将 Pd-S-(CH2)5-COOH 纳米颗粒与 KN-DNAOl2N AGC TCT CAA ACT TTT_3’ )直接修饰。 将以上实施例六所得ImlPd-S-(Cffi) 5-C00H溶液，在14000rpm下，离心30min，除 去上清液，然后将底层的黑色沉淀用MES缓冲液稀释至1ml，加入0. 4mg EDC(约2mM)和 0. 6mg NHS室温反应15分钟。然后，将1 OD的H2N AGC TCT CAA ACT TTT -3，溶液加入 上述溶液中，继续孵育Mh。反应后，将以上混合溶液在14000rpm下离心30min。去除上清 液后，将下层黑色沉淀加入Iml 2XPBS液(10 mM PB，0.3 M NaCl, pH 7)，母液贮存于4°C实施例八DNA微阵列的制备及与Pd纳米颗粒修饰目标DNA之间的杂交
利用点样仪将以下四条16个碱基的寡核苷酸探针(又上海生工合成)点在事先经过醛 基化修饰的玻璃载片表面，并进行孵育固定。5，-AGC TCT CAA ACT TTT C _3， 正配
5，-AGC TCT CAC ACT TTT C -3， 错配 1 个碱基 5，-AGC TCT CCC ACT TTT C -3， 错配 2 个碱基 5，-AGC TCT GCC ACT TTT C -3， 错配 3 个碱基
然后与实施例五或实施例七得到的Pd-5’-HN AGC TCT CAA ACT TTT _3’进行杂交，杂 交液为MicroHyb，杂交条件与荧光法相同。杂交后，分别用2XSSC/0. 1%SDS和0. IXSSC/ 0. P/oSDS溶液各清洗10 min,除去非特异性吸附在玻璃片上的Pd纳米颗粒。实施例九将杂交后的微阵列进行铜化学镀
将实施例八所得杂交后的片基浸入铜染镀液中进行信号放大与显影。其中，镀液成分 由以下A和B两种溶液构成，在进行化学镀之前，现场配制。A溶液3g CuSO4,4g NaOHU4g 酒石酸钠钾、IOOml水，B溶液37. 的福尔马林溶液。化学镀前，直接将以上A、B两种溶液 混合，然后将以上获得微阵列浸入进行反应。室温下反应10 min，水洗吹干。结果显示，利 用化学镀非�：玫那至送耆ゲ�(铜颜色很深)、错配一个碱基(铜颜色较浅)及错配两 个碱基(铜颜色较浅)的DNA序列。其灵敏度与Au标银染技术相当，能达到500fmol左右。实施例十将杂交后的微阵列进行镍化学镀
将实施例八所得杂交后的片基浸入镍染镀液中进行信号放大与显影。其中，镀液成 分由以下A和B两种溶液构成，在进行化学镀之前，现场配制。A溶液为还原液，胺基硼烷 (DMAB )0. 39/ L0另外，还原剂还可以为NaBH4 ,KBH4等碱金属硼氢化物、三甲胺基硼烷、 三乙胺基硼烷等胺基硼烷以及胼等，以DMAB为佳。B溶液中为NiSO4 (以Ni2 +计Vg^L “1 4 7、NaH2PO2 · H2O/ g · L - 1 20 40 苹果酸 / g · L - 1 10 30 琥珀酸 / g · L- 1 5 15。化学镀前，直接将以上A、B两种溶液混合，并将其pH值调至4 5。然后将以上 获得微阵列浸入进行反应，70 93°C下反应10 min，水洗吹干。实施例十一将杂交后的微阵列进行镍、钴合金化学镀
将实施例八所得杂交后的片基浸入镍、钴混合镀液中进行信号放大与显影。其中，镀液 成分由以下A和B两种溶液构成，在进行化学镀之前，现场配制。A溶液为还原液，胺基硼 烷(DMAB )0. 39/ L0另外，还原剂还可以为NaBH4 ,KBH4等碱金属硼氢化物、三甲胺基硼 烷、三乙胺基硼烷等胺基硼烷以及胼等，以DMAB为佳。B溶液中为NiSO4 30 g/L、CoS04 8-14 g/L、NaH2 PO2 20 g/L、C6H5O7Na3 64 g/L、络合剂 0. 020 g/L、稳定剂 0· 003 g/L、表面活性 剂0. 5 g/L。化学镀前，直接将以上A、B两种溶液混合，并将其pH值调至8 8.5。然后
8将以上获得微阵列浸入进行反应，30 40°C下反应10 min，水洗吹干。实施例十二 鉴于镀层的磁性特性进行的信号检测
当以Co、Ni或其混合物为化学镀物质时，由于所形成的镀层不仅具有类似前面Cu镀 层所表现出的颜色变化，同时他们自身还具有磁性特性，而这些特性可以通过不同的生物 磁场检测设备进行信号读�。缱孕Т衅�(Spin Valves)、巨磁阻感应传感器(GMR Sensors )、超导量子干涉仪(SQUIDs)、各向异性磁阻(AMR)环式传感器、小规模的霍 耳组合传感器(Hall Crosses)以及隧道结(TMR)传感器等。下面以巨磁阻感应传感器为例说明其应用(其原理过程请见图3)。当实施例十 和实施例十一将杂交后的微阵列进行化学镀后，先用去离子水清洗芯片3遍，除去游离的 Ni2+、Co2+离子及其他镀液成分，然后再用PBS缓冲溶液清洗2遍，最后再用双蒸水清洗一 次。在用氩气将芯片吹过后，置于真空干燥箱里过夜。接着，将芯片置于实验室自制的GMR 传感器装置中进行信号读取。其中，GMR读取头由spin valve构成，灵敏度为1.3 mV/V*0e， 线性范围士200e。参照文献，采用惠斯通电桥可以把电阻信号转变为电压信号输出。由于 对沿表面的磁场分量非常敏感。当外加磁场倾斜时，GMR传感器的基准信号会发生变化，产 生的有效GMR信号也会发生变化。把传感器表面的平均磁场和传感器灵敏度直接相乘，就 得到GMR传感器的电阻信号变化。实验中发现，上述信号的变化能非�：玫姆从澄⒄罅兄� DNA序列的变化，当序列完全配对时与错配一个时电信号，可以产生约20 μ V的电信号差 别。这与前面的灰度测试结果相吻合，充分的说明该路线的可行性。
权利要求
1.一种基于纳米钯标记及其催化沉积放大的生物检测方法，其特征是利用纳米钯颗 粒对生物分子进行标记，并结合纳米钯的催化性能，利用化学镀进行信号放大，最终借助化 学镀后所表现出的光学、磁性特性进行检测。
2.根据权利要求1所述的基于纳米钯标记及其催化沉积放大的生物检测方法，其特 征是所述的纳米钯颗粒，其粒径在O-IOOnm之间，以乙醇或水合胼为还原剂，以柠檬酸钠、 PVP, PEG-SH、CTAB或SDS为稳定剂还原得到。
3.根据权利要求1所述的基于纳米钯标记及其催化沉积放大的生物检测方法，其特征 是所述的生物分子包含DNA片段、蛋白质。
4.根据权利要求2所述的基于纳米钯标记及其催化沉积放大的生物检测方法，其 特征是所述纳米钯表面修饰生物分子，在标记之前，利用二步法，将HS-(CH2)n-COOH或 H2N-(CH2)n-COOH取代稳定剂分子连接到钯颗粒表面；所谓两步法是指第一步先将纳米钯颗 粒表面的稳定剂被TA取代，然后利用第二步，再将纳米钯颗粒表面的TA部分被HS-(CH2) n-C00H取代；其中，η在4-20之间。
5.根据权利要求4所述的基于纳米钯标记及其催化沉积放大的生物检测方法，其特征 是所述钯纳米颗粒与生物分子直接孵育制得纳米钯颗粒标记生物分子。
6.根据权利要求4所述的基于纳米钯标记及其催化沉积放大的生物检测方法，其特 征是将所述HS-(CH2)n-COOH修饰钯纳米颗粒与生物分子孵育制得纳米钯颗粒标记生物分 子。
7.根据权利要求1所述的基于纳米钯标记及其催化沉积放大的生物检测方法，其特征 是所述利用化学镀进行信号放大是在纳米钯颗粒标记的生物分子与探针分子发生生物作 用之后，利用化学镀过程，借助钯的催化作用，在纳米钯颗粒周围进一步沉积上金属颗粒进 行信号放大。
8.根据权利要求1或7所述的基于纳米钯标记及其催化沉积放大的生物检测方法，其 特征是所述化学镀过程指在不通电的情况下，利用氧化还原反应在纳米钯周围获得一层 金属单质或合金；其中，涉及的金属包括镍、铜、锌、钴、银、金、铁或它们间组合成的合金。
9.根据权利要求8所述的基于纳米钯标记及其催化沉积放大的生物检测方法，其特征 是所述的检测是基于上述化学镀后所表现出的光学、磁性及其它特性；光学指沉积后的 颜色变化，能依据肉眼进行判断，活用灰度扫描仪进行；磁性指镀层所表现出的磁学特性， 借助巨磁阻效应和超导量子干涉仪进行信号检测；其他特性包括将以上镀层溶解后，再借 助电化学技术，检测溶解后的金属离子浓度。
10.根据权利要求1所述的基于纳米钯标记及其催化沉积放大的生物检测方法，其特 征是该检测过程适用于生物芯片检测、进行高通量的筛选、用于单个生物传感器或进行单 个生物分子的检测。
全文摘要
本发明提出一种基于纳米钯标记及其催化沉积放大的生物检测方法，并结合纳米Pd的催化性能，利用化学镀进行信号放大，最终借助化学镀后所表现出的性能如光学、磁性等特性进行检测的一种生物分子检测方法。该路线中，首先合成了粒径在1-100nm左右的Pd颗粒，然后借助表面化学技术，对其进行修饰，使其能稳定存在于缓冲溶液中，并将所需标记生物分子连接到Pd颗粒表面，从而完成生物分子的纳米Pd标记。接着，在完成生物分子相互作用后，利用Pd的催化特性，通过化学镀过程进行检测信号放大。最后，进行检测时的手段是基于上述化学镀后所表现出的性能如光学、磁性及其它特性。该路径对实验设备要求较低，大大的拓宽了上述检测路线在未来中的应用。
文档编号G01N27/26GK102147358SQ20111002392
公开日2011年8月10日 申请日期2011年1月21日 优先权日2011年1月21日
发明者何农跃, 沈彬, 王志飞, 颜士飞 申请人:东南大学
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