专利名称：用于测量生物元素的电活性的装置及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种测量一个或多个生物元素的电活性的装置，尤其涉及可并行测量大量生物元素的电活性的装置。
本发明还涉及该装置的应用。
在以上和以下内容中，术语“生物元素”要理解为所有天然或人造元素，它的至少一部分是由生物膜构成的，或者它可以再现生物膜的结构和/或功能特性。
于是，它可以是整个生物细胞、或者包括液胞、高尔基体、线粒体、内质网、溶酶体、胞质体等的生物细胞的细胞器类型、可能具有胞质成分的生物膜断片、人造脂质双层体(如卵磷脂或磷脂酰甘油薄膜)、或者其它仿生膜，其中所述人造脂质双层体设有一个或多个蛋白质孔隙。
生物细胞中出现的电信号的产生和传送取决于用于构成原生质膜的厚度中的孔隙、并确保离子(Na+、Ca++、K+和Cl-)穿过这些膜的贯穿细胞膜的蛋白质，这些孔隙就叫“离子通道”。大多数离子通道都响应它们所在的膜的特定分裂而打开，该分裂或者与该膜的电位变化有关(于是将它们称为电压敏感或电压相关通道)，或者和配位体与膜受体的结合有关(于是将它们称为受体通道)。
目前已知的是，某些离子通道的机能障碍与很多病变有关，这些病变包括癫痫、肌强直、脑脊髓共济失调、高血压、心功能不全、心律失调(如室性四重心律失调综合症、Jervell与Lange-Nielsen综合症)、囊性纤维化、糖尿症、以及某些肾功能失调(如Bartter氏和Gritelman氏综合症)、以及1型假性低醛甾酮症(PHA-1)。同样，在引起剧烈疼痛和慢性疼痛的疼痛讯息的产生和调节过程中，也会涉及到某些离子通道的出现。
于是本发明的装置构成了一种药学研究的备用工具，尤其是为了在细胞水平上更好地了解与离子通道机能障碍的失调有关的机理而进行研究的备选工具，以便识别已被认为在处理这些失调过程中很有效的药物的作用位置和作用模式，由此研发出比这些已有的药物更有活性和特效更强的新药。
具体来说，本发明的装置可用于研究以下药学领域抗击某些毒素或毒液(例如蝎毒)的解毒药和药物，中量或大量筛选出具有作为靶的离子通道、并因此具有治疗价值的分子，或者筛选候选药物以评价其效果和/或其毒性，本发明的装置也可用于药物警戒领域。
本发明还可用于诊断与离子通道功能障碍有关的病变。
另外，由于离子通道电活性的任何变化都反映了它们能检测的分子的存在，从而受体通道型的离子通道可用作“通道传感器”。因此，依照本发明的装置可用于环境领域(例如用于检测污染物)，还可用于要对其生产线和由该生产线产出的产品进行质量控制的工业中，这些工业如农副产品、制药和化妆品工业，另外还可用于把毒性学分析作为标准操作的其它部门。
依照本发明的装置还可用于许多其它目的，例如用于检测保留了细胞膜完整性的活细胞，或者相反用于检测细胞膜失去了完整性的死细胞，用于检测细胞因胞吐作用而释放出的物质，检测由于细胞与另一细胞或者泡囊融合而导致的膜电容变化，用于刺激细胞，用于研究细胞网络、组织或共培养的细胞内活性，用于研究细胞对施加给其它细胞的电刺激的响应，或者甚至为了提供“机械式”传感器而对机械敏感的离子通道进行研究。
背景技术：
1981年，Neher和Sakmann研发出用于研究离子通道的技术，该技术在今天也是最有效的，即“膜片钳”技术(Hamill等人，PflugersArch.，1981，39185-100)[1]。该技术可以检查(“夹钳”)原生质膜断片(“膜片”)或整个细胞内的贯穿细胞膜的电位差，由此直接获得通过该膜片或该细胞的离子通道的离子通量。
实践中，该技术是将玻璃微量吸管施加到细胞的原生质膜上，通过微量吸管的抽吸在该微量吸管端部和与该微量吸管相结合的膜片(“细胞结合”结构)之间产生数量级为1千兆欧姆(一般称为“千兆密封”)的高阻力密封，可连续进行抽吸，直到在该膜片上产生孔(“完整细胞”结构)。然后通过机械切除(“里-外”或“外-外”结构)将该膜片与细胞的其余部分分开。
然后通过向膜片或细胞施加恒定电压并记录该电压的变化，以测量由于细胞结合结构或切除结构中被单独分出的膜片上、或全细胞结构中整个细胞膜上的离子通道的状态变化(打开或闭合)所导致的电活性。
尽管毫无疑义的是，膜片钳技术因其灵敏性而在了解离子通道过程中取得了很大进展，它为制药工业提供了一种用于筛选出可对离子通道起作用的分子的工具，但事实证明该技术并非让人彻底满意。
这是因为，首先，它具有以下缺陷它对电噪声和来自周围介质的振动非常敏感，因此需要一个被设计成能抵消该噪声和振动的干扰作用的、相对结实的基础结构(抗振工作台、法拉第笼等)。
此外，这是一种完全人工的方法，尤其是因为每次测量前都必需通过拉制和加工毛细管来准备该方法要用的玻璃微量吸管(这需要有训练有素的实验员)，特别是，由于形成千兆密封所需的抽吸要用吸管嘴来实施，故而这些微量吸管要被适当定位以获得千兆密封，所以该方法实施起来相当麻烦。
再有，每个时间单位能检测的样本数很少，失效百分比很高。已表明，实施膜片钳技术的实验员每天最多作二十次测量。
因此，要理解的是膜片钳技术不能用于制药研究所希望的中量或大量药物筛选，或者用于需要以离子通道为传感器的常规化验。
Neher和Sakmann提出的膜片钳技术的限定遭遇以下事实近年来，基因组研究和信息技术的进步已经证实，离子通道的高度多样性和高度复杂性已让许多人试图改进该技术。
具体而言，已探索出了两种方法第一，旨在让测量自动化，同时仍采用与原型技术(玻璃微量吸管)中的电极相同的电极；第二，旨在利用电子芯片进行测量。
于是，例如-NEUROSEARCH研发出一种自动细胞识别和测量装置，用于在分隔的腔室中测量8个单独的细胞。该装置公开于WO-A-96/13721[2]中，它能高效地进行电活性测量。但是，由于要在固体表面上培养和“修补”细胞，它需要对细胞进行非常精确的选择，并要使用吸液管定位系统，以形成能防止玻璃记录电极破裂的高阻力密封。
-SOPHION BIOSCIENCES开发了一种标准基底，它能记录生物膜内的电现象。该基底公开于WO-A-01/25769[3]中，它有多个截面为方形的部位，这些部位里集成了电极。但是，事实证明，使用过程中，这些部位不适合与细胞形成高阻力密封。
-CENES介绍了一种新型的膜片钳系统来测量完整细胞的电活性。该系统公开于WO-A-01/71349[4]中，它包括将细胞悬浮于液体介质中，在玻璃毛细管的气/液界面处为它们提供电极。该系统具有能消除因周围介质发出的振动所导致的问题以及不需要非常精确地定位电极的优点。但是，它不能并行测量。
-最后一家公司在WO-A-00/66329[5]中也提出了一种多孔或有孔的基底，这些孔以池的方式布置，池的两侧有电极。细胞以细胞层的形式设置在该基底上，所以说它也不能测量各个细胞。
-CYTION在WO-A-99/31503[6]中公开了一种细胞定位装置，它具有以下特征每个芯片仅包括一个一体化的测量部位，它没有细胞约束结构。所以，它在细胞流散和若干细胞位于同一部位方面有较大风险。
-AXON目前正致力于装置的设计改型，该装置采用了Yale大学在其国际申请WO-A-01/59447[7]中提出的平面硅弹性体电极。初步试验表明该装置仍需要进行一些实质性改进。
-最后，WO-A-00/25121[8]中描述了这样一种装置它试图将离子通道产生的离子运动转化成能够检测和测量的交变电流。该装置包括设有一个孔的基底，装置使用前将离子通道或包括一个或多个离子通道的膜断片结合到这个孔中，该装置根本不适合测量整个生物元素(如细胞或细胞的细胞器)的电活性。
于是发明人提出的目的在于提供一种能利用膜片钳技术测量生物元素、尤其是细胞的电活性的装置，以便能在得益于该技术的优点、尤其是灵敏度方面的优点的同时，又不具备它的缺点，可利用该装置以一定速率和可靠性同时测量细胞的电活性，这使得它尤其适合中量、大量筛选有潜在治疗价值的物质，或者适合常规检验、特别是诊断或毒性检验。
发明人的目的还在于，提供一种在具备上述优点的同时又在制造成本和操作成本方面令人满意的装置。
发明概述这些目的可通过本发明来实现，本发明提出了一种用于测量至少一个生物元素的电活性的装置。
该装置包括大体平的基底，它具有下表面和上表面，并至少有一个用于容纳生物元素的通孔，所述孔由一组侧壁来限定，该装置的特征在于-它包括两块大致平的板，这两块板置于基底的上下表面任一侧上，并与所述那组侧壁一起限定成腔室，该腔室在使用该装置时装满液体介质；-每块板在其面对基底的表面上设有至少一个面对基底中的孔的电极；-每块板还有至少一个通道，它们始于腔室内部，将腔室与装置外部连接起来；以及-腔室仅通过所述通道与装置外部相连。
于是，对于希望测量电活性的每个生物元素而言，依照本发明的装置包括-腔室，它被设计成在为该目的而设置的外罩内装满了液体介质，生物元素将浸在所述液体介质中，如果所述生物元素是活的元素，所述液体介质用于确保电流传导和生物元素的存活；-一对电极，它分布在两块板上，一块板构成腔室的顶部，而另一块板构成腔室的基座，所述电极面对生物元素的外罩，这些电极具有向所述生物元素施加电压并记录由于生物元素离子通道的状态变化(开或闭)所导致的电压变化的功能；以及-至少两个通道，它们将腔室内部与装置外部连接起来，一个通道始于腔室底部，它通过在该腔室内产生真空而在生物元素及其外罩之间形成高阻力密封，而另一通道始于腔室顶部，它用于将物质导入腔室和/或将这些物质从所述腔室中排出。
依照本发明的第一个有利布置方案，基底中的孔包括三个同轴部分，即上部、中间部和下部，上部和中间部构成了用于容纳生物元素的杯子，而下部构成了用于容纳足以通过抽吸作用在里面产生真空的一定体积液体介质的储槽，其中所述真空适合在所述杯子和生物元素之间形成高阻力密封。
根据此处所用的，术语“高阻力密封”是指具有阻力至少一百兆欧、有利的是一千兆欧以上的密封。
优选的是，用于容纳生物元素的杯子(后面为了方便仅用“杯子”来表示)为漏斗形，其截头圆锥部分对应于基底中的孔的上部，它用作生物元素的容器，其圆柱部分对应于该孔的中间部，用于在该元素和所述杯子之间形成高阻力密封。
考虑到生物元素的形状和完整性，尤其当它们是生物细胞时，为了确保在下邻储槽中产生真空的过程中生物元素发生形变，或者保证细胞膜发生形变从而获得高阻力密封，已证明杯子的这种形状——漏斗形实际上非常适合约束生物元素。
依照本发明，用作生物元素容器的杯子的平截圆锥部分的尺寸优选与该元素的尺寸相配，由此可以进一步改善它的约束力，并获得高阻力密封。
于是，例如，当生物元素是常规尺寸(也就是说直径在10到30微米左右)的细胞(淋巴细胞，CHO细胞，海拉细胞，HEK细胞，…)时，杯子的平截圆锥部分——它对应于基底中孔的上部——的最大直径优选在20到100微米之间，最小尺寸优选在10到30微米之间，高度在10到50微米之间，而该杯子的圆柱部分——它对应于基底中孔的中间部——的直径优选在0.1到3微米之间，高度在100微米以下。
作为一个变型例，在生物元素是大型细胞(也就是说一个直径测量值约为0.7到1mm的细胞)时，通常是用非洲蟾蜍卵母细胞的情况，杯子的平截圆锥部分的最大直径优选在500微米和1.5mm之间，最小直径在200和600微米之间，高度在300微米和10mm之间，而该杯子的圆柱部分的直径优选在0.1和3微米之间，高度在100微米以下。
所有情况下，基底中的孔的下部优选是圆柱形的，有利的是其直径测量值为10到100微米，高度为300到700微米。
依照本发明的装置的另一有利布置方案，基底由一种或多种可微加工的材料制成，微加工是一种非常适合形成尺寸范围在十分之一微米到几百微米的孔的技术。
优选的是，基底以硅为基�。闪娇楣杵钩桑饬娇楣杵挥谒且艄痰狡渖系闹屑淠さ牧讲啵鲋屑淠た捎墒屎衔⒓庸ぜ际醯木挡牧现瞥桑蛘咴谙Ｍ銮克鲋屑淠な保筛鞅砻嫱扛擦司挡牧系墓杵钩�。绝缘材料可以是矿物材料，例如氧化物(例如SiO2)或者氮化物(例如Si3N4)，或者有机材料(例如聚酰亚胺)。
在该情况下，基底中孔的上部(即杯子的平截圆锥部分)由位于中间膜两侧的两块硅片之一中形成的通槽侧壁限定，而基底中孔的下部(即储槽)由在另一个所述硅片内形成的通槽的侧壁来限定。
基底中孔的上下部之间是孔的中间部(即杯子的圆柱部分)，在该装置的最简单实施例中，它由中间膜中形成的通槽的侧壁来限定。
但是，基底中孔的中间部还可形成一种微量吸管，它伸到基底中孔的上部，并由对应于中间膜中形成的通槽的侧壁的第一圆柱形侧壁和从该第一圆柱形侧壁伸向基底上表面的第二圆柱形侧壁限定。该结构的尺寸最好是可精确控制的，这容易通过绝缘体上外延硅(SOI)技术来实现，第二圆柱形侧壁的高度优选在1到30微米之间，直径在十分之几微米到几个微米之间。
显而易见的是，前述材料之外的微加工材料也完全适用于制造基底，例如玻璃或塑料。
依照本发明的装置的另一有利布置方案，基底的上表面覆有由可生物相容、柔软(任选)的材料制成的薄膜，该薄膜设有至少一个通孔，该通孔与下邻的基底中的孔的上部同轴，它们的几何形状也相同，但前者横截面较大。
该布置方案在希望测量大型细胞的电活性时特别有用，它不仅能使得对该类型细胞的约束最佳，而且如果基底完全由硅之类的微加工材料制成，这还可以降低微加工材料制成的基底部分的厚度，由此与原来相比降低了基底的制造成本。
优选的是，覆盖基底上表面的薄膜中的孔是截头圆锥体形的，其最大直径在500微米和1.5mm之间，其最小直径在200到600微米直径，高度在300微米到1mm之间。
有利的是，该薄膜可通过模塑法来制造，这样其制造成本降到足以在每次使用装置时用新薄膜来代替，于是该薄膜由能够进行模塑的材料制成，例如聚四氟乙烯(PTFE)型热塑性体、或者硅弹性体如聚二甲基硅氧烷(PDMS)。
根据制成薄膜和基底的材料的性质，可通过结合或者压力作用下的粘接剂作用将薄膜固定就位在基底上。
根据本发明，位于基底的上下表面两侧上的板可以相同或不同，它们优选由绝缘材料制成，例如玻璃-环氧树脂，而由这些板承载的电极优选是平面电极。
所述平面电极具体而言可以是Ag/AgCl-接触器，也可以采用由其它氧化还原对，例如Pt/PtCl-对构成的接触器。
所有情况下，将电极设计成在完成了各装置元件的组装后再连接到供电电路和电量测量电路上。
根据本发明的又一有利布置方案，面对基底上表面设置的板有两个通道，即用于将物质引入腔室的通道和将这些物质从腔室中排出的通道，而面对基底下表面设置的板只有一个通道，所述通道用于形成高阻力密封。
将用于引入和排出物质的通道设计成分别通过即时或永久方式与毛细管相连，所述毛细管分别与自动或手动液体输送系统和自动或手动液体抽吸系统相连，这两个系统能够彼此相连，以便将所述物质再循环到腔室中。
将用于产生高阻力密封的通道设计成可通过即时或永久方式与毛细管相连，所述毛细管将它们与液体抽吸系统连接起来。
根据本发明，这些各种各样的通道通过穿过它们所在的板的厚度将腔室与装置外部连接起来。
作为一个变型例，它们还可通过以大致平行于该板的方式散布在它们所在的板内、直到到达所述板的一边，从而腔室与装置外部连接起来。
根据依照本发明的装置的优选布置方案，基底中的孔、面对基底下表面设置的板的电极和通道是同轴的，该布置方式尤其使杯子与生物元素之间产生的高阻力密封最佳化，并使为测量生物元素的电活性而向生物元素施加的电压、该电压变化的记录、以及由此获得的测量质量最佳化。
根据依照本发明的装置的另一优选布置方案，后者包括用于密封腔室的装置，该装置还用于衰减电噪声和从周围介质发出的振动，为了方便起见，后面仅用术语“密封装置”来表示。
该密封装置优选由第一垫片和第二垫片构成，所述第一垫片插在基底和面对该基底下表面设置的板之间，所述第二垫片可与或不与前一个垫片相同，它插在基底和面对该基底上表面设置的板之间，所述每个垫片都设有至少一个穿孔，穿孔被布置成环绕着板上与该板形成接触的电极。
有利的是，制成这些垫片的材料除了不透液体之外，还是柔软的、可略微压缩的和能模塑的，因此垫片可通过模塑制成，由此一方面可以理想地使它们与基底结构相适配，另一方面又能以足够低的成本来制造，这样在每次使用装置时都可以用新垫片来替换。该材料例如硅弹性体之类的弹性体，例如聚二甲基硅氧烷。
依照又一优选布置方案，基底、位于该基底的上下表面两侧的板和密封装置是以可拆卸方式组装的�？椤�
该情况下，有利的是依照本发明的装置包括用于将这些�？楣潭ň臀辉谧樽昂玫淖刺淖爸�。
这些固定装置可以是紧固到基板的上下表面两侧的板上、并加以配合从而将这些板以可拆卸方式彼此固定在一起的装置，例如铰链、滑板或螺纹装置。它们也可以是独立于这些板、并适合安装到由各�？楣钩傻牡闾宓谋咴瞪系淖爸�。
�？榈淖樽�、尤其是基底中孔的轴、由位于基底上下表面两侧上的板承载的电极、以及密封装置中穿孔的对齐可通过(尤其所述板上的)机械导向装置(对齐销、角槽等)、光学导向装置(穿过穿孔的光纤)或者其它导向装置来实现。
根据本发明，该装置优选能并行测量若干种生物元素的电活性，该情况下-基底有多个均匀隔开的同样的通孔；-位于该基底的上下表面两侧上的板是印刷电路板，它们每个都设有与基底所具有的通孔的数目一样多的电极；-面对基底下表面设置的板至少具有与基底所具有的通孔的数目一样多的通道；-面对基底上表面设置的板至少具有与基底所具有的通孔的数目一样多的物质引入通道，至少与基底所具有的通孔的数目一样多的物质排出通道；所述基底及其通孔、所述板、所述电极和所述通道按上述方式进行定义。
依照该装置的一个优选实施例，后者还包括两个同样的垫片，每个垫片都设有与基底所具有的通孔的数目一样多的穿孔，这些垫片和这些穿孔按上述方式进行定义。
此外，依照该优选实施例，该装置还包括两个同样的夹子，它们安装在由基底、位于该基底的上下表面两侧上的板以及垫片构成的叠层体的边缘上。
该情况下，依照本发明的装置尽管包括了七个元件，但它仅由五个不同�？楣钩桑庑┠？榭筛菀庠缸樽昂筒鹦叮渲谢锥杂τ诘谝荒？椋挥诨椎纳舷卤砻媪讲嗌系陌宸直鸲杂τ诘诙？楹偷谌？椋嫫杂τ诘谒哪？榈牧礁隼樱凶佣杂τ诘谖迥？榈牧礁隼�。
依照本发明的装置有多个优点。
这是因为，它能在根据膜片钳技术的原理进行细胞电活性测量的同时，通过以下技术大大简化了该技术的实施-首先，它消除了制备玻璃微量吸管和对这些微量吸管进行处理的操作和获得千兆密封所需的嘴抽吸操作，并消除了使用显微镜和使用适合避免或在极小的限度上避免由于电噪声和周围介质发出的振动所产生的任何干扰的装备的需要；以及-第二，它可实现这些电活性测量的全部或部分自动化，尤其是形成高阻力密封、将物质输送到彼此独立的腔室中、施加电压并对该电压变化进行记录的全部或部分自动化，它能在计算机系统的控制下设置抽吸和物质输送系统、供电和电量测量电路。
由此可见，对于本领域没有任何经验的实验室和用户来说，依照本发明的装置使得膜片钳技术容易得到实施。另外还可以看出，该装置能以令人非常满意的效率水平进行电活性测量，同时又能保证这些测量的可靠性、尤其是再现性。
另外，就其能以细胞结合结构和完整细胞结构方式既可对多个同时处理的细胞进行电活性测量、也可对单个细胞进行电活性测量、并且在对若干个细胞实施并行测量时可针对不同细胞采用不同参数而言，这提供了很大的使用灵活性。因此，例如存活的介质，将测试或检测的物质，该物质的浓度和电压可以是对每个细胞彼此不同。
此外，除了完整细胞之外，它能接受生物细胞的细胞器，或者可能具有胞质成分或人造脂类双层体的生物膜或其它仿生膜的断片。
当依照本发明的装置是�？榛低呈保捎诟们榭鱿赂髂？榭稍谝淮斡忠淮蔚牟饬抗讨�、或者一组测量又另一组测量的过程中更换，或者相反进行再利用，这进一步增强了该操作的灵活性。
最后，该装置的制造非常便宜，尤其是在该装置是模块化系统的形式时，因为制造过程既不包括组装操作，也不包括对组装质量进行检查的操作，所以制造成本更便宜。与之类似，该装置的操作成本也非常有优势，在构成装置的某些�？榻龃蛩阌靡淮危蛘咭蛭承┠？槭芩穑耸庇忠Ａ羝渌？榈那榭鱿拢涂梢愿徽庑┠？�。
考虑到前述内容，依照本发明的装置能够构成以下工作的备选工具-为治疗目的筛查分子；-诊断与离子通道功能障碍有关的病变；-在环境领域、或者农副产品、药剂学或化妆品工业中检测毒性物质；-检测细胞膜完整性得以保留的活细胞，或者相反检测失去了细胞膜完整性的死细胞；-检测细胞因胞吐作用而分泌出的物质；-测量由于细胞与另一细胞或者与泡囊融合所导致的膜电容的变化；-例如为了研究、促进、甚至加速神经元再生、新生或者可塑性而刺激细胞(如神经)；-研究细胞网络、(器官型)组织或细胞共培养的细胞内活性；-研究细胞A对施加给细胞B的电刺激的响应；或者甚至-为了提供“机械”传感器而研究机械敏感的离子通道。
除了上述方案外，本发明还包括其它布置方案，这些方案通过与依照本发明的实施例相关的其余描述部分变得显而易见，其通过参照附图以说明方式而不是限制方式给出。
附图的简要说明
图1是按照分解透视方式看到的依照本发明的装置的示意性表示图，这是为并行测量九个生物细胞的电活性而设计的实施例；图2是按照图1中以平面P的剖视方式看到的示意性表示图；图3到图5是按照与图2相同的方式看到的依照本发明的装置的一部分的示意性表示图，但它们是该装置的三个可选择性实施例；
图6是按照剖视方式看到的用于依照本发明的装置的结构中的一部分基底的示意性表示图，它是适合测量大型细胞的电活性的基底的第一实施例；图7和图8是按照剖视方式看到的用于依照本发明的装置的结构的一部分基底的示意性表示图，它们是该基底的另外两个实施例。
具体实施例方式
首先参照图1和图2，这两幅图以示意性方式示出了依照本发明的装置10，该实施例被设计成可以并行测量九个生物细胞的电活性。
图1是分解透视图，其示出了装置10在组装前的各个部件，而图2对应于图1中平面P的截面，其示出了被组装后的这些相同部件。
如图1和图2所示，装置10大致呈正方形，它由七个部件构成，这七个部件按照可拆卸方式组装，即-第一印刷电路板11，它构成了该装置的基座；-大致平的基底12，它被设置在印刷电路板11的顶部，具有通过该基底中的通孔120来约束细胞18的作用；-第二印刷电路板13，它本身位于基底12的顶部，构成装置10的盖；该印刷电路板与印刷电路板11、基底12中的孔120一起限定出腔室19，腔室中心将放置希望测量电活性的细胞18，一个细胞一个腔室，因此这些腔室都要充满细胞外介质或者可用作细胞外介质的介质；-两个带穿孔的垫片4和5，它们中的第一个插在印刷电路板11和基底12之间，第二个插在该基底和印刷电路板13之间，所述垫片用于确保装置、尤其是腔室19之间的密封，并用于衰减电噪声和周围介质发出的振动；以及-两个夹子6和7，它们的作用是按照装配状态将上述部件固定就位。
这七个部件对应于五个不同的�？榧矗∷⒌缏钒�11对应于第一�？榛蚰？锳；基底12对应于第二�？榛蚰？锽；印刷电路板13对应于第三�？榛蚰？镃；垫片4和5对应于第四�？榛蚰？镈的两个例子；而夹子6和7对应于第五模块或�？镋的两个例子。
如图1和2所示，基底12或�？锽代表装置10的中心，它有九个通孔120，这些通孔按三行三列分布。
通孔120有两个作用，即一方面用于构成能约束希望测量电活性的细胞的微型杯子40，另一方面是当位于这些杯子下方的腔室19部分内产生真空时，可在这些杯子和这些细胞之间形成阻力至少为一百兆欧、优选至少一千兆的密封。
如图2所示，按照这种方式，基底12分别由两块薄片121和123构成，它们设置在它们所固定的中间膜122的两侧上，这些薄片和这个膜按以下方式形成凹槽一方面，用于约束细胞18的杯子40的形状为漏斗形，它的平截圆锥部分35由薄片121中形成的平截圆锥形通槽的侧壁36来限定，而它的圆柱形部分25由中间膜122中形成的圆柱形通槽的侧壁26来限定；以及另一方面，杯子40与下邻的圆柱形储槽60相通，储槽60与杯子同轴，并由薄片123中形成的圆柱形通槽的侧壁16来限定，它能容纳通过抽吸作用在里面产生足以获得高阻力密封所需的真空的一定体积的液体介质。
如图2所示，图2以非常简略的方式示出了获得高阻力密封之前的细胞(左侧细胞)和获得高阻力密封后的细胞(右侧细胞)，杯子40的平截圆锥部分35用作细胞18的容器，而其圆柱部分25用于产生高阻力密封，后者实际上通过让所述细胞的原生质膜变形、并利用内陷作用将该原生质膜粘附到所述圆柱形部分的侧壁26上来实现。
举例说明杯子-杯子的平截圆锥部分35的最大直径测量值为50微米，最小直径为30微米，高度为10微米，并且-杯子的圆柱形部分25的直径测量值为1.5微米，高度至少为1微米，以及-杯子座落在圆柱形储槽60上方，该储槽的直径为50微米，高度为450微米，经证实，这特别适合常规尺寸的细胞。
所以可以理解的是，基底12的薄片121和123优选由易于微加工的材料制成，尤其是硅，中间膜122优选由介电常数高、适合共同微加工(微技术)、并且可通过粘结接合到硅片上的材料制成。当薄片121和123由硅制成时，中间膜材料例如是二氧化硅(SiO2)或者氮化硅(Si3N4)。
印刷电路板11或�？锳与印刷电路板13或�？镃一起用于通过它们所浸浴的液体介质向细胞18施加电压。印刷电路板11还用于记录由于所述细胞离子通道的状态(开或闭)变化所导致的电压变化。
于是，印刷电路板11和13(由玻璃-环氧型传统材料制成的绝缘支持件)每个都在面对基底12的表面上承载着九个电极触头110和130，这些电极触头被设置成能让它们每个的轴与杯子的圆柱形部分的轴重合，并被设计成与供电和电量测量电路相连(该电路在图1和2中未示出)。
于是，例如印刷电路板13的电极触头与恒定电位源(例如地)相连，而印刷电路板11的电极触头110既通过放大器与发电器相连，又与适合顺序地采集由这些触头记录下来的电压变化的寻址电路相连。该寻址电路本身也可通过放大器与能够测量电量变化的装置如电压表或安培表相连，它与印刷电路板13的电极触头130所连的同一恒定电位源相连。
用于供电和测量电量、并对采集的数据进行分析的电路操作优选由与膜片钳领域中已经使用的计算机系统来控制。
还有九个流体微通道穿过印刷电路板11的厚度，这些微通道的直径为几百微米，其作用是通过抽吸在圆柱形储槽60内产生获得高阻力密封所需的真空。于是，这些通道111穿过电极触头110，并被设计成在印刷电路板11的外表面上与毛细管(图1和2中未示出)相连，毛细管本身又与一个或多个抽吸系统相连，例如现有的用于抽吸液体的那些系统(例如水泵)相连。
也有流体微通道穿过印刷电路板13的厚度，这些微通道的直径为几百微米，但这里有18根微通道，它们被分布成有九根通道131用于为腔室19导入物质，有九根通道132用于从所述腔室中除掉这些物质。这些通道131和132还用于让这些物质再循环到腔室19中。
在依照图1所示的本发明的装置的实施例中，通道131和132位于电极触头130的两侧。与通道111相同的是，通道131和132被设计成与毛细管(图1和2中未示出)相连，这些毛细管本身又与一个或多个液体输送系统(微量注射器，微型泵等)以及一个或多个液体抽吸系统或一个或多个适合将物质再循环到腔室19中的系统相连。
在此同样是这些输送、抽吸或再循环系统的操作优选由计算机系统控制。
如上所述，对应于�？镈的两个例子的两个垫片4和5中的第一垫片插在印刷电路板11和基底12之间，在第二垫片插在该基底和印刷电路板13之间，以便为装置、尤其是腔室19之间形成密封，并用于衰减电噪声和环境介质发出的振动。
为此，这些垫片分别设有圆形穿孔140和150，它们的直径略大于杯子40的最大直径和圆柱形储槽60的直径，它的轴与这些杯子和这些圆柱形储槽的轴重合。
此外，这些垫片的厚度仅有几微米厚，它们由不透液体的、可略微压缩的、能变形的材料制成，这些材料优选是硅树脂弹性体之类的弹性体，例如聚二甲基硅氧烷(PDMS)。
另外，它们优选通过模塑法制造，这样一方面它们能非�：玫赜牖�12的构造配合，另一方面它们的制造成本也足以低至在每次使用装置10时可用新的垫片来替换。
对应于�？镋的两个例子的夹子6和7具有当�？锳、B、C和D一旦完成装配就将它们固定就位的作用。夹子的横截面为U形，长度大致等于印刷电路板11和13的边长，可在向由这些�？楣钩傻牡闾迓晕⑹┭购蠼饬礁黾凶庸潭ǖ礁玫闾宓谋咴瞪稀�
现在参照图3到5，这些图表示装置10的一部分，它们是流体微通道131和132的布置方案的三个实施例，它们彼此都不同、并且也不同于图1和2所示的实施例。
在图3所示的实施例中，通道131和132都穿过电极触头130。
在图4所示的实施例中，这两个通道中只有一个通道(例如通道131)穿过电极触头130，通道132设置在该电极触头侧面，而在图5所示的实施例中，这两个通道131和132都设置在侧面，并位于所述电极触头的同一侧。
图6表示打算用于装置10的构造的基底12的一部分，该实施例被设计成能测量大型细胞的电活性，也就是说可以测量直径在0.7到1毫米左右的细胞。
在该实施例中，基底12的上表面覆有由可生物相容、柔软(任选)的材料(如PDMS、树脂或热塑性塑料)制成的薄膜126，并且这些薄膜都设有通孔127，通孔与基底中的孔120同轴。薄膜通孔127的尺寸如此设置以使该情况下杯子包括两个叠置的平截圆锥部分，即对应于薄片121中形成的凹槽35的第一部分和对应于薄膜126中的孔127的第二部分。
举例说明杯子-杯子的第一平截圆锥部分的最大直径测量值为500微米，最小直径为300微米，高度为450微米，-杯子的第二平截圆锥部分的最大直径测量值为1mm，最小直径为600微米，高度为1mm，以及-杯子的圆柱形部分的直径测量值为1.5微米，高度小于1微米，这样的杯子能给出良好效果。
在此优选的是薄膜126通过模塑法来制造，这样它的制造成本可足以低至象垫片4和5那样在每次使用装置10时用新薄膜来替换。
图7和8也表示打算用于装置10的构造的基底12的一部分，但是，其中从中间膜122中形成的每个圆柱形凹槽25的侧壁26上伸出了一个圆柱形侧壁50，这样该圆柱形侧壁50与侧壁26一起构成一种伸入基底孔120的上部35中的微型吸管。
在图7所示的实施例中，中间膜122仅由一种材料制成，优选由介电常数高的可微加工材料制成，而在图8所示的实施例中，中间膜122通过硅片增强，于是该中间膜是由在所有表面都涂覆了一层介电常数高的材料层52的硅片51构成的。
在这两种情况下，圆柱形侧壁50都由与构成设置于中间膜122中的圆柱形凹槽25的侧壁26的材料相同的材料构成。
举例说明，当打算利用装置10来测量常规尺寸的细胞的电活性时，基底12(如图2所示)可以是以硅为基础的，例如它可通过包括以下步骤的工艺来制造a)薄片123的制备-对第一硅片的两面进行抛光，直到厚度约为450微米，-在硅片的两个表面上淀积一层SiO2，-在两SiO2层中的一个SiO2层的厚度方向上形成直径大约为1.5微米的圆柱形孔，以及-在另一SiO2层和硅片的厚度方向上通过深化学刻蚀法形成直径为50微米的圆柱形凹槽，同时设法保证这些凹槽的轴线与前述步骤中形成的孔的轴线重合；b)通过硅片结合法将这样得到的硅片123固定到两侧预先经过抛光的第二硅片上，该第二硅片将形成后面的薄片121；c)对该第二硅片进行抛光，直到厚度为10微米；d)在该第二表面上淀积一层SiO2或Si3N4；以及e)在Si3N4层和第二硅片的厚度方向上形成平截圆锥形凹槽。
当打算用装置10测量大型细胞的电活性时，图2和图6所示的基底12可以是以硅为基础的，例如可通过包括以下步骤的工艺来制造a)按照上面所述的方式制备硅片123；b)通过以下方式制备硅片121-对第二硅片的两侧进行抛光，直到厚度大约为450微米，-在该硅片的两侧淀积一层SiO2或Si3N4，-在两SiO2或Si3N4层之一的厚度方向上形成直径大约为500微米的圆柱形孔，以及-在该硅片的厚度方向上通过深化学刻蚀法形成始于这些孔的平截圆锥形凹槽；c)通过硅片结合法将这样得到的硅片121固定到硅片123上，然后任选的是；d)将薄膜126简单地压到晶片121上实现结合或粘附。
装置10的使用非常简单。
实际上，在将模块D沉积到�？锳上、然后将与打算测量电活性的细胞尺寸相配的模块B装配到�？镈上之后，为�？锽的杯子装满细胞外介质或可用作细胞外介质的介质，该介质必需能保证电流的传导和细胞的存活。
借助液体微通道111吸出储槽60中存在的空气，以便让细胞外介质流入这些储槽。该操作重复进行，直到圆柱形储槽60、杯子40已完全充满了所述细胞外介质。
在测量直径大约为0.7到1mm的大型细胞(如非洲蟾蜍卵细胞)的情况下，例如通过试管让这些细胞沉积到杯子40中，一个杯子放一个细胞，再次通过流体微通道111对圆柱形储槽60进行抽吸，以便在每个细胞与放置细胞的杯子之间形成高阻力密封，然后如果希望对完整细胞结构进行操作的话，可刺破这样密封后的原生质膜断片。
一旦为所有细胞实现了密封，就将�？镈覆到�？锽上，然后将�？镃覆到�？镈上，在向所得的�？锳、B、C和D的层叠体略微施压后，安上�？镋。
在常规尺寸的细胞(如淋巴细胞或CHO细胞)的情况下，将细胞悬浮液(例如含106细胞/ml的悬浮液)分散到整个基底12上。通过流体微通道111对储槽60进行抽吸，以便在每个细胞与放置该细胞的杯子之间形成高阻力密封，然后可刺破这样密封后的原生质膜断片。清洗基底12，以去掉未被密封的细胞。然后按前述方式闭合装置。
接着，将装置10与供电和电量测量电路相连，除了通过流体微通道131将要测试或检测的物质导入腔室19中之外，按原有的膜片钳技术精确测量细胞的电活性。
在完成了测试时，容易地将装置10拆开以备再次使用。在断开了供电和电量测量电路之后，所需的就是将�？镋拆下，以便将�？锳、B、C和D彼此分开。在适当清洗了�？锳、B和C之后，它们还可以再利用，而�？镈则要丢弃，下次使用所述装置时再用新�？榇妗�
本发明决不限于已经描述的实施例。因此，例如，依照本发明的装置能适用于并行测量大量细胞的电活性，例如1000个细胞或者更多细胞，该情况下要将基底12设计成可以容纳这么多数量的细胞。
另外，依照本发明的装置可连接或整合到其它分析系统(例如可检测荧光或发光信号的系统)之中。该情况下，印刷电路板13由透明材料制成。该连接或整合可将电活性与离子信号通知实时联系起来，由此可同时获得结构和功能上的响应，即动态响应。
参考文献[1]HAMILL et al.Pflügers Arch.，1981，39185-100[2]WO-A-96/13721[3]WO-A-01/25769[4]WO-A-01/71349[5]WO-A-99/66329[6]WO-A-99/31503[7]WO-A-01/59447[8]WO-A-00/2512权利要求
1.一种用于测量至少一种生物元素的电活性的装置(10)，它包括一个大致平的基底(12)，该基底具有下表面(1)和上表面(3)，并具有至少一个用于容纳该生物元素(18)的通孔(120)，所述通孔由一组侧壁(16，26，36)来限定，其特征在于-它包括两个大致平的板(11，13)，这些板置于该基底的上下表面两侧，并与所述那组侧壁一起限定出腔室(19)，所述腔室在使用装置时充满液体介质；-每块板在其面对基底的表面上设有至少一个面对基底中的孔的电极(110，130)；-每块板还有至少一个通道(111，131，132)，它们始于所述腔室内部，并将所述腔室与装置外部连接起来；以及-腔室仅通过所述通道与装置外部连通。
2.根据权利要求1所述的装置(10)，其特征在于，基底(12)中的孔(120)包括上部(35)、中间部(25)和下部(15)，它们是同轴的，上部和中间部构成了用于容纳生物元素(18)的杯子(40)，而下部构成了用于容纳一定体积的液体介质的储槽(60)，所述一定体积的液体介质通过抽吸足以在里面产生适合在所述元素和所述杯子之间形成高阻力密封的真空。
3.根据权利要求2所述的装置(10)，其特征在于，基底(12)中的孔(120)的上部(35)是平截圆锥形，而该孔的中间部(25)是圆柱形。
4.根据权利要求3所述的装置(10)，其特征在于，基底(12)中的孔(120)的上部(35)的最大直径在20到100微米之间，最小直径在10到30微米之间，高度在10到50微米之间，而该孔的中间部(25)的直径在0.1到3微米之间，高度在100微米以下。
5.根据权利要求3所述的装置(10)，其特征在于，基底(12)中的孔(120)的上部(35)的最大直径在500微米到1.5mm之间，最小直径在200到600微米直径，高度在300微米到10mm之间，而该孔的中间部(25)的直径在0.1到3微米之间，高度在100微米以下。
6.根据权利要求2到5中任一项所述的装置(10)，其特征在于，基底(12)中的孔(120)的下部(15)是圆柱形，其直径测量值介于10到100微米直径，高度在300到700微米之间。
7.根据在前任一项权利要求所述的装置(10)，其特征在于，基底(12)由一种或多种可微加工的材料制成。
8.根据权利要求7所述的装置(10)，其特征在于，基底(12)是以硅为基础的。
9.根据在前任一项权利要求所述的装置(10)，其特征在于，基底(12)由两个硅片(121，123)构成，它们位于它们要固定的中间膜(122)的两侧。
10.根据权利要求9所述的装置(10)，其特征在于，中间膜(122)由绝缘材料或者各表面都涂覆了绝缘材料的硅片制成。
11.根据权利要求10所述的装置(10)，其特征在于，绝缘材料是二氧化硅或氮化硅。
12.根据权利要求9到11中任一项所述的装置(10)，其特征在于，基底(12)中的孔(120)的上部(35)由在中间膜(122)任意一侧的一个硅片(121，123)中形成的通槽的侧壁(36)来限定，而基底(12)中的孔(120)的下部(15)由另一所述硅片中形成的通槽的侧壁(16)来限定。
13.根据权利要求9到12中任一项所述的装置(10)，其特征在于，基底(12)中孔(120)的中间部(25)由中间膜(122)中形成的通槽的侧壁(26)来限定。
14.根据权利要求9到12中任一项所述的装置(10)，其特征在于，基底(12)中孔(120)的中间部(25)由对应于中间膜(122)中形成的通槽的侧壁的第一圆柱形侧壁(26)和从第一圆柱形侧壁伸向基底上表面(3)的第二圆柱形侧壁(50)一同限定。
15.根据权利要求2到10中任一项所述的装置(10)，其特征在于，基底(12)的上表面(3)覆有薄膜(126)，所述薄膜由生物相容性材料制成，并设有至少一个通孔(127)，该通孔与基底中的孔(120)的上部(35)同轴，它们的几何形状也相同，但所述通孔(127)的横截面大。
16.根据权利要求15所述的装置(10)，其特征在于，薄膜(126)中的通孔(127)是平截圆锥形，其最大直径在500微米到1.5mm之间，最小直径在200到600微米之间，高度在300微米到1mm之间。
17.根据在前任一项权利要求所述的装置(10)，其特征在于，位于基底的上下表面两侧上的板(11，13)由绝缘材料制成，并且由这些板承载的电极(110，130)是平面电极，具体而言是Ag/AgCl-接触器。
18.根据在前任一项权利要求所述的装置(10)，其特征在于，面对基底(12)的上表面(3)设置的板(13)有两个通道(131，132)。
19.根据在前任一项权利要求所述的装置(10)，其特征在于，面对基底(12)的下表面(1)设置的板(11)只有一个通道(111)。
20.根据权利要求18所述的装置(10)，其特征在于，面对基底(12)的上表面(3)设置的板(13)的通道(131，132)穿过所述板的厚度。
21.根据在前任一项权利要求所述的装置(10)，其特征在于，面对基底(12)的下表面(1)设置的板(11)的通道(111)穿过所述板的厚度。
22.根据权利要求18所述的装置(10)，其特征在于，面对基底(120)的上表面(3)设置的板(13)的通道(131，132)以大致平行于所述板的表面的方式散布在该板的厚度内，直到到达所述板的一个边。
23.根据权利要求18所述的装置(10)，其特征在于，面对基底(12)的下表面(12)设置的板(11)的通道(111)以大致平行于所述板的表面的方式散布在该板的厚度内，直到到达所述板的一个边。
24.根据在前任一项权利要求所述的装置(10)，其特征在于，基底(12)中的孔(120)、由设置在该基底的上下表面两侧上的板(11，13)承载的电极(110，130)、以及面对基底的下表面(1)设置的板(11)的通道(111)是同轴的。
25.根据在前任一项权利要求所述的装置(10)，其特征在于，它包括用于密封腔室(19)和用于衰减电噪声和从周围介质发出的振动的装置(4，5)。
26.根据权利要求25所述的装置(10)，其特征在于，用于密封腔室和用于衰减电噪声和从周围介质发出的振动的装置由第一垫片(4)和第二垫片(5)组成，所述第一垫片插在基底(12)和面对该基底的下表面(1)设置的板(11)之间，第二垫片插在基底(12)和面对该基底的上表面(3)设置的板(13)之间，每个垫片都设有至少一个穿孔(140，150)，它们的结构和尺寸被布置成环绕着板上与该板接触的电极。
27.根据权利要求25或26所述的装置(10)，其特征在于，基底(12)、设置在该基底(12)的上下表面两侧上的板(11，13)、用于密封腔室和用于衰减电噪声和从周围介质发出的振动的装置(4，5)是以可拆卸方式组装的�？�。
28.根据权利要求27所述的装置(10)，其特征在于，它包括将基底(12)、位于该基底的上下表面两侧上的板(11，13)、以及用于密封腔室和用于衰减电噪声和从周围介质发出的振动的装置(4，5)按组装状态固定就位的装置(6，7)。
29.根据在前任一项权利要求所述的装置(10)，其特征在于，当利用该装置并行测量若干生物元素的电活性时-基底(12)有多个均匀隔开的同样的通孔(120)；-在该基底的上下表面两侧上设置的板(11，13)是印刷电路板，它们每个都设有和基底(12)拥有通孔的数目一样多的电极(110，130)；-面对该基底的下表面设置的板(11)至少有和基底(12)拥有通孔的数目一样多的通道(111)；-面对该基底的上表面设置的板(13)至少有和基底(12)拥有通孔的数目一样多的用于引入物质的通道(131)和与基底(12)拥有通孔的数目一样多的用于排出物质的通道(132)。
30.根据权利要求29所述的装置(10)，其特征在于，它包括两个同样的垫片(4，5)，每个垫片都设有与基底(12)拥有通孔(120)的数目一样多的穿孔。
31.根据权利要求30所述的装置(10)，其特征在于，它包括两个同样的夹子(6，7)，这些夹子安装在由基底(12)、设置在该基底的上下表面两侧上的板(11，13)和垫片(4，5)构成的叠层体的边缘上。
32.根据权利要求1到31中任一项所述的装置(10)的用途，它用于为治疗目的而筛选分子。
33.根据权利要求1到31中任一项所述的装置(10)的用途，它用于诊断与离子通道机能障碍有关的病变。
34.根据权利要求1到31中任一项所述的装置(10)的用途，它用于检测毒性物质。
35.根据权利要求1到31中任一项所述的装置(10)的用途，它用于检测活细胞或保留了细胞膜完整性的细胞。
36.根据权利要求1到31中任一项所述的装置(10)的用途，它用于检测死细胞或失掉了细胞膜完整性的细胞。
37.根据权利要求1到31中任一项所述的装置(10)的用途，它用于检测因胞吐作用而从细胞释放出的物质。
38.根据权利要求1到31中任一项所述的装置(10)的用途，它用于测量由于细胞与另一细胞或泡囊融合所导致的膜电容的变化。
39.根据权利要求1到31中任一项所述的装置(10)的用途，它用于刺激细胞。
40.根据权利要求1到31中任一项所述的装置(10)的用途，它用于研究细胞网络、组织、或细胞共培养的胞内活性。
41.根据权利要求1到31中任一项所述的装置(10)的用途，它用于研究细胞A对施加给细胞B的电刺激的响应。
42.根据权利要求1到31中任一项所述的装置(10)的用途，它用于为提供“机械”传感器而研究机械敏感的离子通道。
全文摘要
本发明涉及一种用于测量生物元素的电活性的装置，它包括基底(12)，该基底具有上下表面和至少一个通孔(120)，所述通孔由一组侧壁来限定，其特征在于它包括在该基底的上下表面两侧上设置的两块板(11，13)，它们与所述那组侧壁一起限定出腔室(19)；每块板在其面对基底的表面上设有至少一个面对基底中的孔的电极(110，130)；每块板还包括至少一个始于所述腔室内部并将腔室与装置外部连接起来的通道；以及腔室仅通过所述通道与装置外部连通。
文档编号G01N33/487GK1678909SQ03820379
公开日2005年10月5日 申请日期2003年8月28日 优先权日2002年8月28日
发明者N·皮科莱特－达汉, P·凯拉特, F·雷沃尔－卡瓦利耶, F·沙特莱因, F·索泰 申请人:法国原子能委员会
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