专利名称：拉曼光谱检测方法在老年性痴呆诊断中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于医学领域，涉及老年性痴呆诊断，具体涉及拉曼光谱检测法在诊断老年性痴呆中的应用。
背景技术：
阿尔茨海默病(Alzheimer, s disease,AD),即老年性痴呆,是一种至今病因不明的多源性中枢神经退行性疾�。〕坛式行苑⒄梗浞⒉÷仕婺炅湓龀ざ灾�。年龄到达65岁的老人中平均每8个人就有一个患有AD，年龄到达80岁老人患病率更是达到了50%，我过老龄人口已经超过I. 3亿，AD已成为医学和社会所面临的严峻问题。AD的诊断，尤其是早期诊断是国际难题。目前AD的诊断需要联合认知功能测试以及影像学检测来进行，主观性比较大，而且患者认知能力降低，不容易配合检查。具有轻度认知损害(MCI)的病人容易转化为AD，但确诊往往是在病人已经出现AD病理症状多年以后，所以目前急需实现对AD的早期诊断。血液中相关成分在AD早期病程中就出现了明显变化，所以血液中的某些成分可以作为AD早期诊断的生物标记。血液中的AD相关的生物标记有很多，其中血小板APP异构体比率(APPr)的变化引起了科学界的广泛关注。APP (Amyloid Precursor Protein,淀粉样前体蛋白)是在大部分的组织细胞中都有表达的I型跨膜糖蛋白，在哺乳动物进化过程中高度保守，其基因定位于人染色体21q，AD典型病例症状淀粉样蛋白(Αβ)的沉积中的Αβ就是由APP水解而来。做为人体内分布最广泛的蛋白之一，APP不仅存在于中枢神经系统，同时也存在于外周循环系统中。循环血液中血小板是表达APP并分泌APP的主要外周来源，它表达三种APP异构体APP695、APP751、APP77Q，分子量由106KD到130KD不等。近年来很多研究发现AD病人血小板中APP异构体比率发生了明显变化，确切地说就是分子量为120-130KD和110KD的异构体比率在AD病人血小板中明显降低，且这种变化在早期AD病程中就已经出现，这个发现说明血小板APPr的差异可作为辅助诊断AD的重要外周生物指标，直接对血小板的快速检测可望实现AD的早期临床诊断。但是常规蛋白质分析方法过于繁琐，阻碍了其在临床快速检测中的应用。拉曼光谱可以灵敏地反映分子结构信息，作为一种快速无损的检测方法已经用于疾病的诊断。拉曼效应是一种非弹性散射效应，其中很小部分粒子能级改变从而发生频率变化，这种散射频率的变化和受激的相关分子化学键震动有关，反应到拉曼光谱上就是对应的波数和强度。拉曼光谱对于蛋白结构变化非常敏感，用其来调查在AD病变过程中蛋白类成分有明显变化的血小板就可能成为AD早期检测的一个突破口。本发明利用血小板共聚焦显微拉曼光谱，建立了可用于老年性痴呆诊断(包括早期诊断)的快速的外周血拉曼光谱检测方法
发明内容
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本发明的任务是提供一种用于老年性痴呆诊断的外周血拉曼光谱检测方法。本发明还提供了拉曼光谱检测方法在鉴别诊断老年性痴呆、血管性痴呆(VD)和帕金森病(PD)中的应用。实现本发明的技术方案是用拉曼光谱(Raman spectroscopy)扫描法检测血小板膜淀粉样前体蛋白(AmyloidPrecursor Protein, APP)，读取 74001^1 与 1654CHT1 处峰强值。AD 病理变化与血 小板APP水平密切相关，以757CHT1处的峰做参比，740CHT1与1654CHT1处峰强增加说明APP含量增加、为AD血小板，可诊断为AD ;而且740CHT1峰强与AD病理变化程度正相关，峰强越强说明AD病情越严重。利用拉曼光谱扫描法检测血小板膜上淀粉样前体蛋白的方法包括以下步骤 步骤一从待检血液样品中分离出血小板；步骤二 取分离出的血小板滴加到光滑的金片上；步骤三将滴加有血小板的金片置于激光拉曼显微镜下进行光谱扫描；上述步骤一所述的从待检血液样品中分离出血小板的具体方法包括以下步骤步骤a.抽取5ml新鲜血液置于含有EDTA抗凝剂的离心管中；步骤b.尚心15分钟,去上清,分尚出血衆；步骤c.离心15分钟,分离沉淀,取上清；步骤d.将上清液离心15分钟，去上清，沉淀出血小板。其中步骤b和步骤c中的离心条件为转速60g，温度4°C ;步骤c中的离心条件为转速1500g，温度4°C。前述步骤二中滴加到金片上的血小板的量为1-5 μ 1，具体可以是2 μ I。前述步骤三中将滴加有血小板的金片置于激光拉曼显微镜下进行光谱扫描的扫描条件是所用光源为激发波长为633nm的半导体激光器，功率17mw，通过光栅和滤光片后，实际到达样品的功率不足lmw，确保样品成分完整。检测镜头为50倍长焦镜头(numerical aperture (NA) O. 50, Olympus, Japan),汇聚激光为直径约 I. 5 μ m 的光斑；信号采集时间为30秒，累积扫描4次，采谱范围为600-1700(311^,600线的光栅使光谱分辨率达到 5cm 1O实验资料I动物模型AD 模型4 月龄、12 月龄 APP 转基因小鼠(Tg2576mice harbor the humanAPP695containing the Swedish double mutation(HuAPP695 ；K670N/M671L, JacksonLab))，同时阴性表达的(η = 8)C57小鼠作为对照组。PD模型12周大重22到24g的雄性C57小鼠(η = 4)持续注射MPTP (l-methyl-4-phenyl-l, 2, 3,6-tetrahydropyridine, 一种线粒体联合 I 型抑制剂，在PD中破坏黑质纹状体的多巴胺通路，购于美国Sigma公司)，停止注射7天后处死。VD模型雄性C57小鼠(22到24g，η = 4)通过两侧颈动脉缺血手术建立模型使用血管钳夹住两侧颈动脉造成闭塞10分钟，之后剪掉Icm尾巴末梢并抽出0. 3ml血液使血压降到42±2mm Hg，之后回流15分钟，再闭塞10分钟。2血小板准备
从各模型所抽取的新鲜血液保存于含有EDTA抗凝剂的离心管中，首先5ml血液在60g转速下离心15分钟分离出富含血小板的血浆，然后将血浆同样条件离心沉淀血小球，再将上清液在1500g转速下离心15分钟来沉淀出血小板，整个离心过程在4°C下完成。最后将所得的血小板沉淀滴到光滑的金片上，室温风干后直接进行拉曼检测。3光谱检测所用仪器为法国Horbia Jobin Yvon公司制造的HR800型共聚焦显微拉曼光谱仪，检测前通过检测硅片来优化，使其达到最佳准确性和灵敏度。所用光源为激发波长为633nm的半导体激光器，功率17mw，通过光栅和滤光片后，实际到达样品的功率不足lmw，确保样品成分完整。检测镜头为50倍长焦镜头(numerical aperture (NA) O. 50, Olympus,Japan),汇聚激光为直径约I. 5 μ m的光斑；信号米集时间为30秒,累积扫描4次,米谱范围为eoo-noocm'eoo线的光栅使光谱分辨率达到5cm—1。每类血小板样品被分为数滴进行原位检测，每滴至少随机检测10个点。 4光谱处理及统计分析
所有光谱以TXT格式导出，基线扣除，平滑，归一化等操作全部在Origin软件及仪器上自带的NGSLabSpec软件上完成。统计学处理采用多层感知网络分析法(multilayerperceptron networks classification method)[22],全部工作都在都在Matlab软件中完成。首先提取分离特征值，分别为727和740CHT1处的最大峰强比，以及659、740、804、825、933、1118、1361 和 1550cm-1 处的最大峰强。然后用 mapstd 将光谱归一化，使所有光谱平均值为O,背离值为I。每次分离都将数据分为10份,取90%为training组，10%为test组,得出分类结果后，将test组归为training组然后从另从training组中取一组做为新的test组，得到新的分类结果；如此循环10次，最后将所有分类结果平均，得到最终分类结果。结果I.图I为转APP基因小鼠小鼠血小板的原始拉曼光谱。720nm激发光下血红素的拉曼谱峰主要出现在759，1231，1568，1626and1640CHT1，而从图I中除了 759CHT1之外，未明显出现和血红素有关的谱峰，说明血小板采集成功。2.图2显示的是不同小鼠模型的平均拉曼光谱对比。在图2中，A图为4月龄，12月龄转APP基因小鼠的平均拉曼光谱对比，箭头所示的地方存在明显的光谱差异。第一个差异为740cm—1处的峰强变化，如果以旁边757cm—1处的峰做参比，4月龄的转APP基因小鼠血小板拉曼光谱在此处峰强明显的强于对照组的，并且此峰在12月龄的转APP基因小鼠血小板拉曼光谱中进一步增强，说明740CHT1峰强随APP增加而增大。第二个光谱差异就是1654CHT1处的峰强，4月龄及12月龄转APP基因小鼠血小板光谱中该处峰强要明显弱于对照组。在图2中，B图显示的是转APP基因小鼠，VD及H)模型血小板的平均拉曼光谱。3.图3显示的是对4月龄，12月龄转APP基因小鼠及对照组的血小板光谱数据的分类结果图2显示的是不同小鼠模型的平均拉曼光谱对比。进一步对光谱数据进行分类分析表中的数字结果显示不仅能对转APP基因小鼠血小板和正常血小板进行区分，更能将不同月龄的转APP基因小鼠血小板和正常血小板都区分开来。4月龄转APP基因小鼠区分灵敏度为79%，12月龄转APP基因小鼠区分灵敏度也上升到93. 5%04.图4中A图显示了 12月龄转APP基因小鼠及VD模型小鼠的血小板拉曼光谱数据分类结果图显示了 12月龄转APP基因小鼠及ro模型小鼠的血小板拉曼光谱数据分类结果，W2和W3是对应的分类特征组合。很明显所有区分灵敏度都超过了 90%，说明该方法可以有效的将APP基因小鼠血小板与VD、PD模型血小板区分，拉曼光谱检测方法可用于鉴别诊断老年性痴呆、血管性痴呆(VD)和帕金森病(PD)。以上实验证明血小板拉曼光谱(如740CHT1峰强)能灵敏反映转APP基因小鼠血小板APP水平，AD病理变化与血小板APP水平密切相关，故拉曼光谱检测方法可用于诊断老年性痴呆。用拉曼光谱(Raman spectroscopy)扫描法检测血小板膜淀粉样前体蛋白(AmyloidPrecursor Protein, APP)，读取 74001^1 与 1654CHT1 处峰强值。以 757CHT1 处的峰 做参比，740CHT1与1654CHT1处峰强增加说明APP含量增加、为AD血小板，可诊断为AD ;而且740CHT1峰强与AD病理变化程度正相关，峰强越强说明AD病情越严重。
图I为转APP基因小鼠小鼠血小板的原始拉曼光谱。图2显示的是不同小鼠模型的平均拉曼光谱对比。图3显示的是对4月龄，12月龄转APP基因小鼠及对照组的血小板光谱数据的分
类结果。图4中A图显示了 12月龄转APP基因小鼠及VD模型小鼠的血小板拉曼光谱数据分类结果；B图显示了 12月龄转APP基因小鼠及ro模型小鼠的血小板拉曼光谱数据分类结果。
具体实施例方式I动物模型AD 模型4 月龄、12 月龄 APP 转基因小鼠(Tg2576mice harbor the humanAPP695containing the Swedish double mutation(HuAPP695 ；K670N/M671L, JacksonLab))，同时阴性表达的(η = 8)C57小鼠作为对照组。PD模型12周大重22到24g的雄性C57小鼠(η = 4)持续注射MPTP (l-methyl-4-phenyl-l, 2, 3,6-tetrahydropyridine, 一种线粒体联合 I 型抑制剂，在PD中破坏黑质纹状体的多巴胺通路，购于美国Sigma公司)，停止注射7天后处死。VD模型雄性C57小鼠(22到24g，η = 4)通过两侧颈动脉缺血手术建立模型使用血管钳夹住两侧颈动脉造成闭塞10分钟，之后剪掉Icm尾巴末梢并抽出O. 3ml血液使血压降到42±2mm Hg，之后回流15分钟，再闭塞10分钟。2血小板准备从各模型所抽取的新鲜血液保存于含有EDTA抗凝剂的离心管中，首先5ml血液在60g转速下离心15分钟分离出富含血小板的血浆，然后将血浆同样条件离心沉淀血小球，再将上清液在1500g转速下离心15分钟来沉淀出血小板，整个离心过程在4°C下完成。最后将所得的血小板沉淀滴到光滑的金片上，室温风干后直接进行拉曼检测。
3光谱检测所用仪器为法国Horbia Jobin Yvon公司制造的HR800型共聚焦显微拉曼光谱仪，检测前通过检测硅片来优化，使其达到最佳准确性和灵敏度。所用光源为激发波长为633nm的半导体激光器，功率17mw，通过光栅和滤光片后，实际到达样品的功率不足lmw，确保样品成分完整。检测镜头为50倍长焦镜头(numerical aperture (NA) O. 50, Olympus,Japan),汇聚激光为直径约I. 5 μ m的光斑；信号米集时间为30秒,累积扫描4次,米谱范围为eoo-noocm'eoo线的光栅使光谱分辨率达到5cm—1。每类血小板样品被分为数滴进行原位检测，每滴至少随机检测10个点。4光谱处理及统计分析
所有光谱以TXT格式导出，基线扣除，平滑，归一化等操作全部在Origin软件及仪器上自带的NGSLabSpec软件上完成。统计学处理采用多层感知网络分析法(multilayerperceptron networks classification method)[22],全部工作都在都在Matlab软件中完成。首先提取分离特征值，分别为727和740CHT1处的最大峰强比，以及659、740、804、825、933、1118、1361 和 1550cm-1 处的最大峰强。然后用 mapstd 将光谱归一化，使所有光谱平均值为O,背离值为I。每次分离都将数据分为10份,取90%为training组，10%为test组,得出分类结果后，将test组归为training组然后从另从training组中取一组做为新的test组，得到新的分类结果；如此循环10次，最后将所有分类结果平均，得到最终分类结果。结果I.图I为转APP基因小鼠小鼠血小板的原始拉曼光谱。720nm激发光下血红素的拉曼谱峰主要出现在759，1231，1568，1626and1640CHT1，而从图I中除了 759CHT1之外，未明显出现和血红素有关的谱峰，说明血小板采集成功。2.图2显示的是不同小鼠模型的平均拉曼光谱对比。在图2中，A图为4月龄，12月龄转APP基因小鼠的平均拉曼光谱对比，箭头所示的地方存在明显的光谱差异。第一个差异为740cm—1处的峰强变化，如果以旁边757cm—1处的峰做参比，4月龄的转APP基因小鼠血小板拉曼光谱在此处峰强明显的强于对照组的，并且此峰在12月龄的转APP基因小鼠血小板拉曼光谱中进一步增强，说明740CHT1峰强随APP增加而增大。第二个光谱差异就是1654CHT1处的峰强，4月龄及12月龄转APP基因小鼠血小板光谱中该处峰强要明显弱于对照组。在图2中，B图显示的是转APP基因小鼠，VD及H)模型血小板的平均拉曼光谱。3.图3显示的是对4月龄，12月龄转APP基因小鼠及对照组的血小板光谱数据的分类结果图2显示的是不同小鼠模型的平均拉曼光谱对比。进一步对光谱数据进行分类分析表中的数字结果显示不仅能对转APP基因小鼠血小板和正常血小板进行区分，更能将不同月龄的转APP基因小鼠血小板和正常血小板都区分开来。4月龄转APP基因小鼠区分灵敏度为79 %，12月龄转APP基因小鼠区分灵敏度也上升到93. 5%04.图4中A图显示了 12月龄转APP基因小鼠及VD模型小鼠的血小板拉曼光谱数据分类结果图显示了 12月龄转APP基因小鼠及ro模型小鼠的血小板拉曼光谱数据分类结果，W2和W3是对应的分类特征组合。很明显所有区分灵敏度都超过了 90%，说明该方法可以有效的将APP基因小鼠血小板与VD、PD模型血小板区分，以上实验证明血小板拉曼光谱(如740CHT1峰强)能灵敏反映转APP基因小鼠血小板APP水平，AD病理变化与血小板APP水平密切相关，故拉曼光谱检测方法可用于诊断老年性痴呆。用拉曼光谱(Raman spectroscopy)扫描法检测血小板膜淀粉样前体蛋白(AmyloidPrecursor Protein, APP)，读取 74001^1 与 1654CHT1 处峰强值。以 757CHT1 处的峰 做参比，740CHT1与1654CHT1处峰强增加说明APP含量增加、为AD血小板，可诊断为AD ;而且740CHT1峰强与AD病理变化程度正相关，峰强越强说明AD病情越严重。
权利要求
1.拉曼光谱检测方法在老年性痴呆诊断中的应用。
2.ー种老年性痴呆的诊断方法，其特征在于，利用拉曼光谱扫描法检测血小板膜上淀粉样前体蛋白以诊断老年性痴呆。
3.拉曼光谱检测方法在鉴别诊断老年性痴呆(AD)、血管性痴呆(VD)和帕金森病(PD)中的应用。
4.根据权利要求2所述的老年性痴呆的诊断方法，其特征在于，利用拉曼光谱扫描法检测血小板膜上淀粉样前体蛋白以诊断老年性痴呆的具体方法是用拉曼光谱扫描法检测血小板膜淀粉样前体蛋白，读取740 CnT1与1654CHT1处峰强值，AD病理变化与血小板APP水平密切相关，以757cm—1处的峰做參比，740 cm—1与1654cm—1处峰强增加说明APP含量增カロ、为AD血小板，可诊断为AD ;而且740 CnT1峰强与AD病理变化程度正相关，峰强越强说明AD病情越严重。
5.根据权利要求4所述的老年性痴呆的诊断方法，其特征在于，利用拉曼光谱扫描法检测血小板膜上淀粉样前体蛋白的方法包括以下步骤 步骤ー从待检血液样品中分离出血小板； 步骤ニ 取分离出的血小板滴加到光滑的金片上； 步骤三将滴加有血小板的金片置于激光拉曼显微镜下进行光谱扫描。
6.根据权利要求4所述的老年性痴呆的诊断方法，其特征在于，步骤一所述的从待检血液样品中分离出血小板的具体方法包括以下步骤 步骤a .抽取5ml新鲜血液置于含有EDTA抗凝剂的离心管中； 步骤b.尚心15分钟，去上清,分尚出血衆； 步骤c .离心15分钟，分离沉淀,取上清； 步骤d .将上清液离心15分钟，去上清，沉淀出血小板。
7.根据权利要求6所述的老年性痴呆的诊断方法，其特征在于，步骤b和步骤c中的离心条件为转速60g，温度4°C ;步骤c中的离心条件为转速1500g，温度4°C。
8.根据权利要求5所述的老年性痴呆的诊断方法，其特征在于，步骤ニ中滴加到金片上的血小板的量为1-5 μ I。
9.根据权利要求8所述的老年性痴呆的诊断方法，其特征在干，步骤ニ中滴加到金片上的血小板的量为2 μ I。
10.根据权利要求I所述的老年性痴呆的诊断方法，其特征在于，步骤三中将滴加有血小板的金片置于激光拉曼显微镜下进行光谱扫描的扫描条件是所用光源为激发波长为633nm的半导体激光器，功率17mw，通过光栅和滤光片后，实际到达样品的功率不足lmw，确保样品成分完整，检测镜头为50倍长焦镜头(numerical aperture (NA) O. 50, Olympus,Japan),汇聚激光为直径约I. 5Mm的光斑；信号米集时间为30秒,累积扫描4次,米谱范围为600-1700 cm^,600线的光栅使光谱分辨率达到δαιΓ1。
全文摘要
本发明提供了一种用拉曼光谱检测诊断老年性痴呆的方法，其特征在于，用拉曼光谱(Ramanspectroscopy)扫描法检测血小板膜淀粉样前体蛋白(AmyloidPrecursorProtein，APP)，读取740cm-1与1654cm-1处峰强值，AD病理变化与血小板APP水平密切相关，以757cm-1处的峰做参比，740cm-1与1654cm-1处峰强增加说明APP含量增加、为AD血小板，可诊断为AD；而且740cm-1峰强与AD病理变化程度正相关，峰强越强说明AD病情越严重。
文档编号G01N21/65GK102692404SQ20111007246
公开日2012年9月26日 申请日期2011年3月24日 优先权日2011年3月24日
发明者沈爱国, 王建枝, 田青, 胡继明 申请人:华中科技大学
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