专利名称：一种高敏c反应蛋白测定试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明属于医学免疫学领域，涉及一种免疫检测试剂，进一步地，本发明涉及一种高敏C反应蛋白测定试剂盒。
背景技术：
C反应蛋白(CRP)是一种能和肺炎链球菌的荚膜C多糖结合，由5个相同的亚单位(23KD)以非共价链聚集形成的环状五聚体蛋白，分子量为115KD，是机体受到微生物入侵或组织损伤等炎性刺激时肝细胞合成的急性时相蛋白。在炎症开始数小时CRP就升高，随着组织结构和功能的复原其含量恢复正常。因此，CRP的测定对病程监测、治疗效果判断和预后评价有重大意义。
健康人无感染时的CRP水平还可预测将来心肌梗塞及中风的危险性。健康人CRP参考范围的中位数基本为0.58～1.13mg/L.CRP含量＞2.1mg/L的人，比较CRP含量≤1mg/L者，将来发生心肌梗塞的危险性为后者的2.9倍；发生缺血性中风的危险性为后者的1.9倍；发生外周动脉血管性疾病的危险性为后者的4.1倍。CRP与血脂(总胆固醇，总胆固醇高密度脂蛋白胆固醇的比值)的联合测定，较其他的危险因子更能预示发生心、脑血管疾病的危险性，是目前进行冠心病危险评估的最佳模型。
高敏CRP(HS-CRP)是基于其测定方法更敏感而命名。临床常规测定CRP的方法为免疫比浊法，测定范围一般为3～200mg/L，灵敏度相对较低，无法准确测定3mg/L以下水平的CRP的含量。即无法作为心、脑血管疾病的危险指标，预测将来心、脑血管疾病发生的危险性。
常规的CRP试剂的构成为R-1(缓冲液)和R-2(CRP抗体)。其原理为血清中的C-反应蛋白与抗人C-反应蛋白抗体结合，产生抗原抗体反应，形成凝集。测定此凝集反应在一定波长处的吸光度，对照标准曲线可求出C-反应蛋白的含量。
但是，使用常规的CRP测定方法(如免疫比浊法或普通的胶乳凝集反应法)往往灵敏度低，无法保证低含量范围测定结果的准确性，虽然可用于对感染性疾病的诊断或疗效观察，但是不适用于对将来心脑血管疾病的预测或预后评估。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种高灵敏度的，准确测定3mg/L以下水平的CRP的含量的高敏C反应蛋白测定试剂盒，所述的试剂盒包含试剂R-1、试剂R-2，所述的试剂R-1为结合有羊抗人C-反应蛋白抗体的苯乙烯胶乳溶液，胶乳颗粒直径为200-240nm，置于适当的缓冲液中；所述的试剂R-2为结合有羊抗人C-反应蛋白抗体的苯乙烯胶乳溶液，胶乳颗粒直径为30-70nm，置于适当的缓冲液中。
进一步的，在本发明所述的高敏C反应蛋白测定试剂盒中，试剂R-1中结合有羊抗人C-反应蛋白抗体的苯乙烯胶乳溶液的含量为0.05～0.5mg/ml；试剂R-2中结合有羊抗人C-反应蛋白抗血清的苯乙烯胶乳溶液的含量为0.5～1.0mg/ml。更进一步的，在本发明所述的高敏C反应蛋白测定试剂盒中，试剂R-1中结合有羊抗人C-反应蛋白抗体的苯乙烯胶乳溶液的含量为0.1mg/ml；试剂R-2中结合有羊抗人C-反应蛋白抗体的苯乙烯胶乳溶液的含量为0.6mg/ml。
在本发明所述的高敏C反应蛋白测定试剂盒中，还可包含CRP参考血清。进一步的，所述的CRP参考血清中CRP含量为0～300mg/L之间的6个含量。更进一步的，CRP参考血清1为5％蛋白含量的牛血清白蛋白；CRP参考血清2-6为不同CRP含量的人血清。
进一步的，在本发明中，所述的缓冲液包括但不限于磷酸缓冲液或甘氨酸缓冲液，以及其他具有相似性质的缓冲液。
更进一步的，其中还可以包含一种使用说明书。
采用本发明所述的高敏C反应蛋白测定试剂盒进行测定时，先将样品与试剂R-1混合，读取吸光度A-1，之后加入R-2，读取吸光度A-2，计算反应吸光度，最后获得C-反应蛋白的含量。更进一步的，采用6点定标的方法，以样条函数作为计算模式，根据吸光度与参考血清的值作剂量/响应曲线，根据吸光度值在剂量/响应曲线上算出样品含量。
本发明作出改进的主要目的是提高CRP测定的灵敏度，即保证低含量水平的测定灵敏度。本发明的试剂盒中采用的试剂与同类的现有试剂相比，存在诸多的优点，具体可参见表1所述。
表1
本发明采用胶乳凝集反应法。胶乳凝集反应法是一种间接凝集试验，其原理是包被了抗原或抗体的胶乳微粒(免疫胶乳)，与标本中相应抗体或抗原发生免疫反应后，形成凝集颗粒，凝集物的形成使反应混合系统形成一定浊度，浊度增加的程度与标本中被检物浓度成正比关系，在一定波长下进行浊度测定，即可测出标本中被检物的含量。
在本发明中，血清中的C-反应蛋白与结合在胶乳颗粒表面的羊抗人C-反应蛋白抗体结合，产生抗原抗体反应，使胶乳颗粒形成凝集。测定此凝集反应在570nm波长处的吸光度，对照标准曲线可求出C-反应蛋白的含量。
在本发明中，胶乳凝集反应所使用的是苯乙烯胶乳(日本的UNF公司)，本发明中为了说明的方便起见，在一些地方将“苯乙烯胶乳”简称为“胶乳”，本领域人员应明白，在本发明的上下文中所指的“胶乳”均为“苯乙烯胶乳”。
本发明的胶乳凝集反应法既保证了低含量水平的测定灵敏度，可测得的最低含量为0.1mg/L；又保证了高含量水平的测定线性，可测至350mg/L。本测定试剂为液体双试剂，具有灵敏、准确、特异、抗干扰性强等优点，适用于自动分析仪测定血清中CRP的含量。
图1显示了6种不同含量的CRP参考血清的反应曲线，每条曲线代表了1种含量的参考血清，其中X轴表示测光点；Y轴表示吸光度。
图2显示了6种不同含量的CRP参考血清的标准曲线，每个点代表1种含量的参考血清，其中X轴表示CRP的含量；Y轴表示吸光度。
图3显示了2种CRP含量不同的人血清经不同倍数稀释后测得的结果，每条曲线由下至上的10个点分别代表了不同的稀释倍数，其中X轴表示不同的稀释倍数；Y轴表示CRP的含量。
图4是对应表2所作的图，中间的6个点表示的是6种不同CRP含量的样品的测定结果均值(MEAN)，点上的竖线的上端为均值+2SD；下端为均值-2SD。
图5是分别采用本试剂和日本A公司的胶乳凝集反应法在试剂，采用日立7020型自动分析仪对50份人血清进行测定，测定的结果作相关图。其中X轴表示的是采用日本A公司试剂测得的结果；Y轴表示的是采用本公司试剂测得的结果；相关系数Y＝0.999，回归方程y＝0.994x+0.136。
图6是采用本发明一种高敏C反应蛋白试剂盒测定蛋白含量方法的示意图。
具体实施例方式
实施例1 本发明的测定试剂的制备本发明的试剂盒涉及的试剂的主要原材料如下1.CRP抗体(购自日本UNF公司)。采用免疫电泳法测定，抗体与人CRP之间呈现单一的沉淀�。徊捎玫味ǚú舛ǎЪ畚�5mg抗原/ml抗体以上。
2.胶乳。本发明采用苯乙烯胶乳(购自日本UNF公司)。两种胶乳的颗粒直径分别为30-70nm和200-240nm。
3.人血清(购自上海生物制品研究所)。采用经HBsAg、HCV、HIV-1/HIV-2抗体、梅毒血清学检测为阴性，ALT值在正常范围内的不同CRP含量的人血清。
本实施例的主要试剂的配制如下试剂R-1用磷酸缓冲液稀释CRP抗体，加入胶乳(胶乳颗粒直径200-240nm)并混匀后，离心弃上清，经抗体和胶乳结合确认试验后，再以磷酸缓冲液调整至含量0.1mg/ml。该试剂为乳白色溶液。
试剂R-2用磷酸缓冲液稀释CRP抗血清，加入胶乳(胶乳颗粒直径30-70nm)并混匀后，离心弃上清，经抗体和胶乳结合确认试验后，再以磷酸缓冲液调整至含量0.6mg/ml。该试剂为乳白色溶液。
C-反应蛋白参考血清1取牛血清白蛋白溶解于纯化水中，使蛋白含量为5％，除菌过滤。该参考血清为微黄色澄清液体。
C-反应蛋白参考血清2～6不同CRP含量的人血清，除菌过滤。这些参考血清均为微黄色澄清液体。
C反应蛋白参考血清定值以日本进口的C反应蛋白参考血清为原始标准，采用胶乳凝集反应法，分别对C反应蛋白参考血清2-6进行20次测定，取均值为各含量的定值。
实施例2 高敏C反应蛋白的测定1.本发明的测试方法的一些测试条件以及参数如下试剂空白吸光度采用日立7020型自动分析仪，以生理盐水或C反应蛋白参考血清中的含量为0mg/L的参考血清为样品，测定其原始吸光度，测光点第35点处的原始吸光度A0应≤0.600。
试剂测定范围采用日立7020型自动分析仪，以C反应蛋白参考血清中的含量约为300mg/L的参考血清为样品，测定其原始吸光度，测光点第35点处的原始吸光度A300mg/L应≥1.200。
精密度批内变异CV≤10.0％；批间变异CV≤15％。
准确性校正品(定值质量控制血清)的实测值应为标示值±20％。
2.高敏C反应蛋白含量测定方法(如图6所示)分析方法2点终点法；主波长570nm，副波长800nm(可不用)；样品量6.0ul；R-1300ul；R-2100ul；校准方式样条函数Spline；反应方向上升；测定温度37℃样品与R-1混匀后，于第40秒读取吸光度A1；于5分钟时加入R-2，于10分钟时读取吸光度A2。反应吸光度的计算为A2与A1的校准差值。
计算方法6点定标，以样条函数作为计算模式。根据吸光度与参考血清的值作剂量/响应曲线，样品含量可根据其吸光度值在剂量/响应曲线上算出。
参考范围血清＜3mg/L；健康人无感染时C-反应蛋白＞1mg/L能预示将来发生心、脑血管疾病的危险性。
通过本发明的方法，获得的反应曲线见图1所示，采用日立7020型自动分析仪测得了6种不同含量的CRP参考血清的反应曲线。每条曲线代表1种含量的参考血清。其中X轴表示的是测光点；Y轴表示的是吸光度。
采用日立7020型自动分析仪测得的6种不同含量的CRP参考血清的标准曲线见图2所示。每个点代表了1种含量的参考血清。其中X轴表示的是CRP的含量；Y轴表示的是吸光度。
图3表示两种CRP含量不同的人血清经不同倍数稀释后测得的结果。每条曲线由下至上的10个点分别代表了不同的稀释倍数，即0、1/10、2/10、3/10、4/10、5/10、6/10、7/10、8/10、9/10和10/10(即原倍)。其中X轴表示的是不同的稀释倍数；Y轴表示的是CRP的含量。
实施例3 本发明的检测试剂的灵敏度、精密度以及干扰试验1.灵敏度试验图4是根据表2(表2的数据是采用日立7020型自动分析仪测得)所作的图，显示了本发明的检测试剂的灵敏度。中间的6个点表示的是6种不同CRP含量的样品的测定结果均值(MEAN)，点上的竖线的上端为均值+2SD；下端为均值-2SD。从图4可见，本发明的检测试剂对于极低的CRP含量也是非常灵敏的。
表2
2.精密度试验使用二种CRP含量不同的人血清样品(从医院实验室获得的人血清样品)，测定本发明的检测试剂的精密度(日间变异)。将2份样品在20天中每天各测定1次，获得均值、最小值、最大值、标准差和变异系数见表3。同一样品在不同时间测得的结果是很相近的，表明使用本发明的测定试剂进行测定时的精密度是很高的。
表3
3.干扰试验本发明还对所述的检测试剂进行了干扰试验，在同一份样品(从医院实验室获得的人血清样品)中分别加入不同含量的干扰物质后测定。加入干扰物质后的测定值除以加入干扰物质前的测定值即为影响率，获得的结果见表4。加入干扰物质后，影响率保持在100％附近，可见即使加入干扰物质，但是对本发明的测定结果影响极小。
表4添加量单位mg/dl；影响率单位％
实施例4 本发明的测定试剂的稳定性试验在2-8℃贮存条件下，分别在0月(配制后)、6月和14月时采用本试剂R-1和R-2测得的空白吸光度和标准(300mg/L)吸光度(上述吸光度均为日立7020自动分析仪第35测光点的原始吸光度)、定值质量控制血清测定值和标示值之比、根据对定值质量控制血清5次测定结果计算的批内变异。结果见表5，在6月和14月时与0月相比，质控测得值差异很�。杉痉⒚髦惺褂玫氖约猎�2-8℃贮存条件下可稳定一年。
表5
在37℃贮存条件下，分别在0天(配制后)、3天、5天和7天时采用本试剂测得的空白吸光度和标准(300mg/L)吸光度(上述吸光度均为日立7020自动分析仪第35测光点的原始吸光度)、定值质量控制血清测定值和标示值之比、根据对定值质量控制血清5次测定结果计算的批内变异。结果见表6，在3天、5天和7天时与0天相比，质控测得值差异很小，可见在37℃贮存条件下本发明中的试剂可稳定7天。
表6
试剂开封后，在49天内，10次测定6种不同含量的CRP参考血清所得的吸光度均值、最小值、最大值、标准差和吸光度日间变异见表7，可见本发明中使用的试剂即使在开封后，可稳定一个月以上。
表7
权利要求
1.一种高敏C反应蛋白测定试剂盒，其特征在于，包含试剂R-1、试剂R-2，所述的试剂R-1为结合有羊抗人C-反应蛋白抗体的苯乙烯胶乳溶液，胶乳颗粒直径为200-240nm，置于适当的缓冲液中；所述的试剂R-2为结合有羊抗人C-反应蛋白抗体的苯乙烯胶乳溶液，胶乳颗粒直径为30-70nm，置于适当的缓冲液中。
2.根据权利要求1所述的高敏C反应蛋白测定试剂盒，其特征在于，在试剂R-1中，结合有羊抗人C-反应蛋白抗体的苯乙烯胶乳溶液的含量为0.05～0.5mg/ml；在试剂R-2中，结合有羊抗人C-反应蛋白抗体的苯乙烯胶乳溶液的含量为0.5～1.0mg/ml。
3.根据权利要求2所述的高敏C反应蛋白测定试剂盒，其特征在于，在试剂R-1中，结合有羊抗人C-反应蛋白抗体的苯乙烯胶乳溶液的含量为0.1mg/ml；在试剂R-2中，结合有羊抗人C-反应蛋白抗体的苯乙烯胶乳溶液的含量为0.6mg/ml。
4.根据权利要求1所述的高敏C反应蛋白测定试剂盒，其特征在于，其中还包含CRP参考血清。
5.根据权利要求4所述的高敏C反应蛋白测定试剂盒，其特征在于，所述的CRP参考血清中，CRP含量为0～300mg/L之间的6个含量。
6.根据权利要求4所述的高敏C反应蛋白测定试剂盒，其特征在于，CRP参考血清1为5％蛋白含量的牛血清白蛋白；CRP参考血清2-6为不同CRP含量的人血清。
7.根据权利要求1所述的高敏C反应蛋白测定试剂盒，其特征在于，所述的缓冲液选自磷酸缓冲液或甘氨酸缓冲液。
8.根据权利要求1所述的高敏C反应蛋白测定试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中还包含一种使用说明书。
全文摘要
本发明属于医学免疫学领域，公开了一种高敏C反应蛋白测定试剂盒，其中包含试剂R－1、试剂R－2，所述的试剂R－1为结合有羊抗人C－反应蛋白抗体的苯乙烯胶乳溶液，胶乳颗粒直径为200－240nm，置于适当的缓冲液中；所述的试剂R－2为结合有羊抗人C－反应蛋白抗体的苯乙烯胶乳溶液，胶乳颗粒直径为30－70nm，置于适当的缓冲液中。本发明的试剂通过胶乳凝集反应法进行测定，使用本发明的方法保证了低含量水平的测定灵敏度，既可用于对感染性疾病的诊断或疗效观察，又可用于对心脑血管疾病的预测或预后评估。本试剂使用便捷，在规定的贮存条件下可稳定一年。
文档编号G01N21/75GK1769894SQ20041006768
公开日2006年5月10日 申请日期2004年11月1日 优先权日2004年11月1日
发明者费华, 周玲玲 申请人:上海申索佑福医学诊断用品有限公司
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