亚星游戏官网-www.yaxin868.com

专利名称：一种大豆11s球蛋白含量的检测方法
技术领域：
本发明涉及一种检测大豆、豆粕及相关产品中大豆11S球蛋白含量的方法，具体地说，涉及一种ELISA (酶联免疫吸附测定法)定量检测大豆、豆粕及相关产品中大豆11S球蛋白含量的方法。
背聚技术
大豆IIS球蛋白是大豆的主要抗原蛋白，当其进入幼年动物及疾病导致的免疫力低下和遗传性过敏体 质动物体内就会产生免疫反应，其主要临床表现为腹泻。
大豆脱脂后的产品为豆粕，其粗蛋白含量在46%左右，且约60%为大豆球蛋白。大豆球蛋白由7S球蛋 白和11S球蛋白组成，后者约占全部球蛋白的60%。虽然豆粕是重要的蛋白饲料原料，但是由于其抗原蛋 白的存在，在一定程度上限制了它在幼年动物日粮中的添加量。由于不同品种、不同来源大豆及不同加工 工艺均影响豆粕中抗原蛋白的量，因此不能对大豆抗原蛋白进行有效的定量分析，就不能准确把握豆粕在 幼年动物日粮中的安全添加量。建立准确、快速、灵敏和方便的大豆抗原检测方法，对有效监控豆粕中大 豆抗原蛋白水平，促进豆粕在幼年动物中的安全使用具有十分重要的现实意义。本发明就是应用ELISA(嗨 联免疫吸附测定法)建立大豆11S球蛋白的准确、快速、灵敏和方便的定量检测方法。

发明内容
在分析比较了间接抑制酶联免疫法检测大豆球蛋白灵敏度不够布的不足后，发明人采用双抗体夹心酶 联免疫吸附測定法测定大豆、豆粕及相关产品中大豆IIS球蛋白的含量。
本发明的目的是这样实现的以等电点沉淀和凝胶层析等方法纯化的大豆IIS球蛋内为抗原免疫动物 获得抗体，将抗体与辣根过氣化物酶连接作为酶标抗体，再将其用作双抗体夹心ELISA检测大豆、豆粕及
相关产品中大豆iis球蛋白含量。
本发明的优越性灵敏度高。本发明的大豆llS球蛋白的检测限为2.5ng,而间接抑制酶联免疫法检 测大豆球蛋白的检测限则为16ng，此外，常用的SDS-PAGE方法只能进行大豆球蛋白的定性检测，不能定 量。


图1为双抗体夹心ELISA检测标准曲线图。其中，检测孔OD值为纵轴，抗原浓度为横轴。
具体实施例方式
1) 脱脂大豆粉在缓冲液A中提取得到含大豆球蛋白的溶液，
2) 将溶液pH调至6. 4得到沉淀1和上清液，
3〉将沉淀1溶解在缓冲液B中，并加固^9R酸铵制得51-66繊酸铵沉淀组分，过凝胶过滤柱'得到 纯化的大豆球蛋白，
4)用大豆球蛋白免疫动物，获得抗血清， 5)盐析和凝胶过滤层析纯化抗体，检測抗体效价，
6)将纯化抗体与辣根过氧化物酵连接作为酶标抗体，7)用双抗体夹心嘛联免疫法检測大豆、豆粕及相关产品中大豆11S球蛋白含量。
本发明所述的缓冲液A为0.01-0. 03mol/L的Tris-HCl的缓冲液，含10咖ol/L 2-巯基乙醇，p朋.0 。
本发明所述的缓冲液B为磷酸盐缓冲液(2.6咖ol/L KH2P0,， 32.5 mmol/L K2HP0J，含0. 4mol/L的 NaCl, 10mmol/L 2-巯基乙酵，pH7.6 。
本发明所述的凝胶过滤介质为S印harose CL-6 B。
本发明所述的免疫动物为健康雄性新西兰大白兔。
本发明所述的纯化抗体凝胶介质为S印hadex G-200。
本发明所述的酶标法采用过碘酸钠改良法标记辣根过氧化物酶。
本发明所述的酶联免疫方法为双抗体夹心酶联免疫法。
详细描述本发明大豆US球蛋白含量的ELISA检测方法的建立过程和检测过程如下
1) 将脱脂大豆粉与0.01-0.03raol/L, p朋.0的Tris-HC1缓冲液A混合，料水比1: 15-25, 25-37X: 提取l-2小时。收集上清液l。将上淸液l pH调至6.4 , 5000rmp离心20min。得到沉淀1。
2) 将沉淀1用磷酸盐缓冲液B (含0. 4raol/L的NaCl, 10咖ol/L 巯基乙醇，PH7.6 )溶解，加硫 酸铵制得51-66%硫酸铵沉淀组分,离心收集上清过S印harose CL-6 B，用磷酸盐缓冲液B(0.26-0. 52,ol/L KftPO,, 3. 25酺ol/L K,HPO。洗脱，收集对应吸收峰的溶液，即纯化的大豆11S球蛋A。
3) 将纯化的大豆11S球蛋白装入截留分子量8,000-14,000的透析袋，对PBS缓冲液透析过夜。收集 透析液，浓縮，小份分装。
4) 取上述纯化浓缩的11S球蛋白用PBS缓冲液配成200ug/mL的溶液，分别与等量的弗氏完全佐剂 乳化，初次免疫健康雄性新西兰大白兔，每只大白兔剂紫l-1.5raL，免疫部位为背部皮下。两周后用以上 蛋白溶液与弗氏不完全佐剂的乳化液加强免疫，免疫剂量为l-1.5mL/只人白兔，免疫部位为背部皮下。再 —周后用以上蛋白溶液再次加强免疫，免疫剂量为l-1.5mL/只大白兔，免疫部位为腹腔。琼脂糖双扩成间 接ELISA检測抗体效价。效价合适后心脏采血收集抗血清。
5) 将收集的抗大豆11S球蛋白的抗血清用盐析和凝胶过滤层析法纯化，再次检测效价后小量分装。
6) 将纯化抗体与辣根过氧化物,结合制得酶标抗体。
7) 双抗体夹心ELISA标准曲线的建立。其方法是方阵滴定法检測血清IgG最佳浓度包被酶标板，4 ^C包被过夜，次日洗板，然后各孔中加入封闭液lOOlil， 28-37 1C孵育30-60min，洗板，然后将大豆11S 球蛋白分别做10000、 5000、 2500、 1250、 625、 312、 156、 78、 39、 20、 10、 5、 2.5、 1.25、 0.625 、 0.312 ng/mL的系列稀释，取100ul依次加入酶标板孔中，每个梯度3个重复，每孔加入最佳稀释度酶标抗体IgG 各100 W,解育1小时后洗板，每孔加入TMB底物100 W， 37 T显色10-30 min后，每孔加入50u 1 2 mol/L 的琉酸终止液。然后送入酵标仪中在450咖波长下检测每孔0D值。用以上梯度稀释的抗原检测到的0D 值建立标准曲线以检测孔OD值为纵轴，抗原浓度为横轴。
大豆球蛋白的定量检测。按方法7)建立标准曲线，待测蛋白溶液稀释到合适浓度后也按方法7)做3 个重复后检測0D值。根据待测蛋白的0D值在标准曲线中査出蛋白溶液的实际浓度。
本发明的优越性在于这种方法检测准确、过程简单、灵敏度极髙，可满足实际生产的检测需求。
4具体实施方法
按本发明大豆US球蛋白含量的ELISA检测方法，A体实施操作步骤如下-
1) 将豆粕粉碎与0. 01-0.03迈ol/L, p朋.0的Tris-HCl缓冲液混合，料水比h 25, 25TC提取2小 时。收集上清液。将上清液pH调至6.4 , 5000 rmp离心20 min。得到沉淀1。
2) 将沉淀1用磷酸盐缓冲液(含0.4 mol/L的NaCl, 10酺ol/L 2-巯基乙醇，pH 7. 6)溶解，加 硫酸铵制得51-66繊酸铵沉淀组分，离心收集上清过S印harose CL-6 B，用磷酸盐缓冲液(同前)洗脱， 收集对应吸收峰的溶液，即纯化的大豆球蛋白(IIS蛋白)。
3) 将纯化的大豆球蛋白(IIS蛋白)装入截留分子量8,000-14,000的透析袋，对PBS缓冲液透析过 夜。收集透析液，浓缩，小份分装，冷冻干燥保存。
4) 取适量大豆球蛋白用PBS缓冲液配成200 Mg/mL的溶液，与等量的弗氏完全佐剂乳化，初次免疫 健康雄性新西兰大白兔，每只大白兔剂量lraL,免疫部位为背部皮下。两周后用以上蛋白溶液与弗氏不完 全佐剂的乳化液加强免疫，免疫剂量为1 mL/只大白兔，免疫部位为背部皮下。再一周后用以上蛋白溶液 再次加强免疫，免疫剂量为l mL/只大白兔，免疫部位为腹腔。琼脂糖双扩或间接ELISA检测抗体效价。 效价合适后心脏采血收集抗血清。
5) 将收集的抗大豆球蛋白的抗血清用盐析和凝胶过滤层析法纯化，间接ELISA检测效价后小量分装。
6) 双抗体夹心ELISA标准曲线的建立。其方法是方阵滴定法检测血清IgG最佳包被浓度包被酶标 板，每孔IOO W, 4 1C包被过夜，次日洗板，然后各孔中加入封闭液100 W, 28-37匸孵育30~60 min， 洗板，并将大豆球蛋白分别做10000、 5000、 2500、 1250、 625、 312、 156、 78、 39、 20、 10、 5、 2.5、 1.25、 0.625、 0.312 ng/mL的系列稀释，取100 W依次加入酶标板孔中，每个梯度3个重复，每孔加入 最佳稀释度酶标抗体IgG各lOO W，孵育l小时，然后洗板，每孔加入TMB底物lOOlil， 371C显色15min 后，每孔加入50ul 2mol/L的硫酸终止液。然后送入酶标仪中在450咖波长下检测每孔OD值。用以上 梯度稀释的抗原检测到的OD值建立标准曲线以检测孔OD值为纵轴，抗原浓度为横轴。
7) 大豆11S球蛋白的定量检测。按方法7)建立标准曲线，待测蛋A溶液稀释到合适浓度后也按方法 7〉做3个重复后检测OD值。根据待测蛋白的OD值在标准曲线中汽出蛋白溶液的实际浓度。
权利要求
1、大豆11S球蛋白含量的ELISA检测方法，在于它使用等电沉淀、盐析和凝胶过滤层析纯化大豆11S球蛋白作为抗原免疫动物获得抗体，将其用作双抗体夹心酶联免疫法检测大豆、豆粕及相关产品中大豆11S球蛋白含量，其具体步骤如下1)脱脂大豆粉在缓冲液A中提取得到含大豆球蛋白的溶液；2)将溶液pH调至6.4得到沉淀1和上清液；3)将沉淀1溶解在缓冲液B中，并加固体硫酸铵制得51-66％硫酸铵沉淀组分，过凝胶过滤柱，得到纯化的大豆11S球蛋白；4)用大豆11球蛋白免疫动物，获得抗血清；5)盐析和凝胶过滤层析，检测抗体效价；6)将纯化抗体与辣根过氧化物酶连接作为酶标抗体；7)用双抗体夹心酶联免疫法检测大豆、豆粕及相关产品中大豆球蛋白含量。
2、 按权利要求1所述的大豆11S球蛋白含量的ELISA检测方法，其特征在于缓冲液A为0.01-0. 03mol/L的Tris-HCl的缓冲液，含10,ol/L 2-巯基乙醉，p朋.0 。
3、 按权利要求l所述的大豆US球蛋白含量的ELISA检测方法，其特征在于缓冲液B为磷酸盐缓冲液，含0.4mol/L的NaCl， 10,ol/L 2-巯基乙醉，pH7.6 。
4、 按权利要求1所述的大豆US球蛋白含量的ELISA检测方法，其特征在于凝胶过滤介质为S印harose CL—6 B。
5、 按权利要求1所述的大豆IIS球蛋白含量的ELISA检测方法，其特征在于免疫动物为兔。
6、 按权利要求1所述的大豆球蛋白含量的ELISA检测方法，其特征在于纯化抗体凝胶介质为S印hadex G~200。
7、 按权利要求1所述的大豆球蛋白含量的ELISA检测方法，其特征在于采用过碘酸钠改良法标记辣根过氧化物酶。
8、按权利要求1所述的大豆球蛋白含量的ELISA检测方法，其特征在于酶联免疫方法为双抗体夹心法。
全文摘要
本发明公开了一种测定检测大豆、豆粕及相关产品中11S球蛋白含量的ELISA方法。本发明采用等电点沉淀与凝胶层析纯化大豆11S球蛋白作为抗原，并免疫动物获得抗血清，然后提取抗大豆球蛋白抗体与辣根过氧化物酶连接作为酶标抗体，用作双抗体夹心酶联免疫法检测大豆、豆粕及相关产品中大豆11S球蛋白的含量。本发明的优越性在于该法检测快速、准确且灵敏度极高。
文档编号G01N33/68GK101482567SQ200810246198
公开日2009年7月15日 申请日期2008年12月30日 优先权日2008年12月30日
发明者宋国福, 张邦辉, 李吕木, 韩景华 申请人:安徽农业大学;安徽天邦饲料科技有限公司;安徽天邦生物技术有限公司