专利名称：一种肠道病毒71型(ev71)胶体金快速检测试纸条的制作方法
技术领域：
本发明属于生物检测领域，具体涉及一种肠道病毒71型(EV71)抗原检测试纸条及其应用。
背景技术：
肠道病毒71型(EV71)属于肠病毒属A型，是克萨奇病毒A16 (CA16)的近亲，EV71 W^^nTl^-^iji^A^n^l (hand, foot and mouth disease, HFMD) (encephalitis) 菌性脑膜炎(as印icmeningitis)和脊髓灰质炎样麻痹(poliomyelitis-like paralysis) 等多种与神经系统相关的疾病。目前，人类是EV71病毒唯一已知的自然宿主，病毒主要通过人群间的密切接触传播。根据核苷酸序列的差异，可将EV71分为A、B、C等3个基因型， B型和C型又可进一步分为B1、B2、B3、B4以及Cl和C2亚型。中国大陆已发现的7株EV71 病毒(SHZH03、SHZH98、SH2F1、SH2F2、SH2H25、SH2H26 和 CHN287)与 EV71 病毒 C 基因型代表株比较，同源性在89. 3% 94. 6%之间，较为接近，而与A、B基因型代表株比较，则同源性在81. 3% 84. 0%之间。说明中国大陆的10株EV71病毒皆属于EV71病毒C基因型。EV71的病毒颗粒为球形结构，无包膜和突起，病毒粒子的衣壳组成非常复杂，首先由EV71病毒基因组编码4个外壳蛋白，VP1、VP2、VP3暴露在病毒的表面，通过拼装成原聚体和亚单位，最终形成病毒外壳。蛋白VP4则包埋在病毒外壳内侧起连接作用。VP1、VP2和VP3三个多肽暴露在病毒外壳的表面，其抗原表位主要集中于VP1、VP2 和VP3上。VPl不但具有显著的基因多态性，而且集中了中和抗原决定簇，直接影响病毒的抗原性。VPl基因序列不仅可作为肠道病毒属内不同血清型分类的依据，并可作为小RNA病毒科内不同属的分类参考，因此VPl基因是EV71分子流行病学主要的研究内容。外壳蛋白VPl由891个核苷酸组成，存在着EV71主要中和抗原表位。因此通过基因工程获得该抗原的表达蛋白，并用其作为抗原检测EV71的特异性IgM抗体。目前，手足口病的诊断，除了依据临床症状外，实验室诊断是不可缺如的环节。实验室的诊断标准如下1)血液检查的细胞总数一般正常或偏高，分类时淋巴细胞较高，中性粒细胞较低。 2)有中枢神经系统并发症时，脑脊液细胞数可增多，蛋白升高。幻发病后从粪便、咽喉漱口液分离或检测到相关病毒。4)从脑脊液或疱疹液分离或检测到相关病毒。幻从早期血清中检测出相关病毒IgM抗体。6)恢复期血清中和抗体比急性期有>4倍的增长。然而到目前为止，还没有一种能够方便、快捷检测肠道病毒71型的检测方案的报道。
发明内容
(一 )、要解决的技术问题发明的目的是提供一种使用方便、快捷，用于检测肠道病毒71型(EV71)的试纸条，检测人类中肠道病毒71型(EV71)特异性抗原，用于肠道病毒71型(EV71)的辅助诊断。(二)、技术方案本发明提供了一种检测试纸条，它包含以下成分(1)包被肠道病毒71型特异性抗原VPl的单克隆抗体或多克隆抗体和质控二抗 IgG两个条带的反应膜；(2)含有胶体金标记肠道病毒71型特异性抗原VPl的单克隆抗体的结合物释放垫。上述二抗可以是抗鼠IgG 二抗，所述反应膜可以是硝酸纤维素膜，所述结合物释放垫可以是玻璃纤维膜。本发明检测试纸条可以按如下方法制备1)制备肠道病毒71型特异性抗原VPl的单克隆抗体或多克隆抗体；2)将步骤1)制备的肠道病毒71型特异性抗原VPl的单克隆抗体或多克隆抗体以及二抗IgG在反应膜上分别形成检测带和质控带，备用；3)用胶体金标记肠道病毒71型特异性抗原VPl的单克隆抗体，包被到结合物释放垫中；4)将制备好的反应膜以及结合物释放垫与样本垫、吸水垫和反应支持物组装成试纸条。本发明还公开了所述试纸条在检测肠道病毒71型(EV71)中的应用。本发明通过采用纯化的肠道病毒71型(EV71)特异性抗原VPl的单克隆抗体或多克隆抗体和抗鼠IgG分别固相于硝酸纤维膜上(NC膜)，结合胶体金标记的肠道病毒71型 (EV71)特异性抗原VPl的单克隆抗体，应用膜层析双抗体夹心法的原理检测标本中的肠道病毒71型(EV71)。(三)、有益效果本发明的试纸条利用胶体金标记技术和膜层析技术，用于快速定性检测样本中可能存在的肠道病毒71型(EV71)，达到快速筛检病人，及时控制疫情的目的。节省了大量人力物力，方便、快速、简捷，不需特殊仪器设备，不需专业培训，结果清晰易辨，操作简单， 易于推广，适合基层，适合于突发事件的大批量现场检测，适合早期诊断，对肠道病毒71型 (EV71)的感染诊断起到辅助作用。
图1 :A本发明试纸条的正面示意图；B本发明试纸条的侧面示意图。其中，1 吸水垫；2 硝酸纤维膜(T 肠道病毒71型(EV71)特异性抗原VPl的单克隆抗体或多克隆抗体的条带；C 包被抗鼠IgG的质控条带)；3 含有胶体金标记的肠道病毒71型(EV71)特异性抗原VPl的单克隆抗体的聚酯膜；4 样品垫；5 反应支持物。图2 检测结果示意图。其中，从左至右依次为T、C两条线阳性；C 一条线阴性； Τ、C两条线阴性或仅有T线，无效。
具体实施例方式以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。实施例1 抗肠道病毒71型VPl蛋白单克隆抗体的制备(1)免疫小鼠制备的基因工程抗原从-20低温冰箱取出溶解后，给BALB/C小鼠背部皮下注射 (O.aiil/只)，间隔10天。融合前3日，在小鼠腹腔以抗原0.15ml进行攻击。免疫效果用 ELISA法进行检测。(2)骨髓瘤细胞SP2/0骨髓瘤细胞购于军事医学科学院微生物流行病研究所。用时将存储在液氮罐中的SP2/0细胞复苏，在含有10%小牛血清DMEM培养基中培养48-72小时，待细胞生长良好，细胞浑圆、透亮、大小均一、排列整齐、呈对数分裂，准备融合。(3)细胞融合制备好的SP2/0细胞和免疫的BALB/C小鼠的脾淋巴细胞分别配制成2 X 107/ml和 IXlOVml0各取Iml室温下混合。用0. 8ml，50%的PEG (分子量1500)作为融合剂；培养液用10%小牛血清DMEM。(4)阳性孔的检测和筛选ELISA法检测。包被EV71全病毒抗原酶标板。对融合细胞的培养上清液进行检测，选择ELISA效价OD值大于1. 0的阳性孔进行亚克隆。共检出阳性克隆19株，选择9株进行亚克隆操作。(5)单抗细胞株的亚克隆用有限稀释法对阳性克隆细胞株进行克隆化筛选。对筛选的的阳性克隆经过冻存、复苏、传代等过程，最终获得6株可稳定分泌特异性抗布鲁氏菌外膜蛋白bp^的单克隆抗体杂交瘤细胞株。杂交瘤细胞株号为1A11，2E11，2B9，2C6， 3G11，3F10。(6)单克隆抗体细胞株检定细胞株核型分析对上述杂交瘤细胞染色体进行检测为96条；证明他们是SP2/0 骨髓瘤与小鼠细胞的杂交瘤细胞。细胞株稳定性对6株产生单克隆抗体的杂交瘤细胞株经连续克隆化检测单克隆抗体阳性率100%，在体外传代5个月，并经反复冻存复苏均能达到保持稳定的分泌抗体， 培养上清效价 1 400-1 500(++) IFA0实施例2 抗肠道病毒71型VPl蛋白单克隆抗体的检定(1)单抗腹水制备小鼠SPF级小鼠，经检查无鼠源病毒污染，在腹水生产过程中如发现动物不健康、咬伤、感染者应弃掉。细胞株扩大培养取生产批细胞管1支复苏，加营养液扩大培养，1只生产细胞只用一次，不再冻存。杂交瘤细胞株接种制备腹水均需在无菌条件下进行，注射杂交瘤细胞之前，每只小鼠腹腔注射液体石蜡0. 5ml。一周后每只小鼠腹腔注射杂交瘤细胞1-3X 106/0. 2mL·腹水采集注射细胞株7-10天，或小鼠濒死前一次采集腹水，置_20°C保存。
(2)单克隆抗体的提纯采用硫酸铵沉淀法粗提，进而用Hi1Trap rProteinA柱纯化，经SDS-PAGE电泳检定，仅显示单一蛋白带。(3)抗体亲合力测定采用NaSCN竞争ELISA实验，测定其ED50的下降值，来间接反映其抗体亲合力的大小。检测表明，6株单抗亲合力大小依此为1A11 > 3F10 > 2B9 > 2C6 > 2E11 > 3G11。(4)亚型检定采用免疫扩散法对细胞培养上清的单抗进行Ig亚类的检测。上述6株单克隆抗体的Ig亚类分别是=IgGl有三株1A11，3F10，2C6 ；IgG^i有两株2E11，2B9，IgG2b有一株 3G11。(5)抗原位点检定用相加ELISA法对6株单抗的抗原结合位点进行检测。结果表明，1A11、2E11、2C6， 及3F10不是同一结合位点，而2B9和3G11可能是同一结合位点。实施例3 肠道病毒71型(EV71)检测试纸条(胶体金)(参见图1)(1)胶体金-VPl单克隆抗体结合物的制备经实验确定，抗VPl单克隆抗体胶体标记的其最佳结合pH值为8.0，胶体金和抗体的配比为40μ g/ml胶体金。标记胶体金经稳定剂处理后，按每平方厘米65 μ 1的量，取胶体金-抗体结合物溶液，均勻吸附于玻璃纤维上，冷冻干燥，并在干燥环境中保存。(2)包被抗原于硝酸纤维膜将VPl的另一株识别不同抗原位点的单抗用0. OlMPBS稀释成1. 5mg/ml。将抗鼠 IgG多克隆抗体用0. OlMPBS稀释成2mg/ml。用喷膜机将二者以1 μ 1/cm的速度喷于硝酸纤维膜上，分别形成检测线和对照线。两条线之间的间隔为0. 5cm。把固定有抗体的硝酸纤维置37°C烤箱中干燥2小时。干燥环境中保存备用。(3)肠道病毒71型(EV71)检测试剂盒组成反应支持物为6. 5cmX0. 4cm PCV板；吸水垫为2cmX0. 4cm的滤油纸； 1. 8cmX0. 4cm的硝酸纤维膜依次包被抗鼠IgG，肠道病毒71型(EV71)特异性表达蛋白VPl 的单克隆抗体，0. 4cmX0. km的含有胶体金标记的抗VPl的另一株单抗的聚酯膜；样品垫为2. 7cmX0. km的滤纸纤维；即形成了肠道病毒71型(EV71)检测试纸条(胶体金法)。实施例4检测方法(参见图2)将待检标本(尿液、全血、血浆或血清)直接滴加入实施例3试纸条“4”处，样品液沿膜上行，10-15分钟判读结果。结果如样本中含有肠道病毒71型(EV71)抗原，则与试纸条上胶体金标记的肠道病毒 71型(EV71)特异性抗原的单克隆抗体形成相应的复合物，上行与包被在硝酸纤维膜上的肠道病毒71型(EV71)特异性抗原的单克隆抗体或抗肠道病毒71型(EV71)特异性抗原的多克隆抗体，形成红色线条，即在T处形成红色条带。无论是否含有相对应的抗原，胶体金标记肠道病毒71型(EV71)特异性抗原的单克隆抗体继续向上爬行与包被在膜上的抗鼠IgG形成红色沉淀线，即在“C”处形成红色条带。此线是质控线，如胶体金失效，此线就不会出现，说明试纸条失效。
取200例血清样本，其中，150例为肠道病毒71型临床阳性血清样本，50例为正常血清样本，按上述的检测方法用实施例3的的试纸条对样本进行检测。结果表明，150例临床阳性样本中检测出149例，正确率为99. 3%，50例正常血清样本有1例为假阳性，正确率为 98%。
权利要求
1.一种检测试纸条，其特征在于，它包含(1)包被肠道病毒71型特异性抗原VPl的单克隆抗体或多克隆抗体和质控二抗IgG两个条带的反应膜；(2)含有胶体金标记肠道病毒71型特异性抗原VPl的单克隆抗体的结合物释放垫。
2.如权利要求1所述的检测试纸条，其特征在于，所述反应膜为硝酸纤维素膜。
3.如权利要求1所述的检测试纸条，其特征在于，所述结合物释放垫为玻璃纤维膜。
4.如权利要求1或2所述试纸条，其特征在于，所述的二抗IgG为抗鼠IgG。
5.一种制备权利要求1 4任一项所述试纸条的方法，其包括如下步骤1)制备肠道病毒71型特异性抗原VPl的单克隆抗体或多克隆抗体；2)将步骤1)制备的肠道病毒71型特异性抗原VPl的单克隆抗体或多克隆抗体以及二抗IgG在反应膜上分别形成检测带和质控带，备用；3)用胶体金标记肠道病毒71型特异性抗原VPl的单克隆抗体，包被到结合物释放垫中；4)将制备好的反应膜以及结合物释放垫与样本垫、吸水垫和反应支持物组装成试纸
6.权利要求1-4之任一所述试纸条在检测肠道病毒71型中的应用。
7.肠道病毒71型特异性抗原VPl及其单克隆抗体在制备肠道病毒71型抗原检测试纸条中的应用。
全文摘要
本发明提供了一种用于检测肠道病毒71型(EV71)的快速检测试纸条。它是在硝酸纤维膜(NC膜)上包被肠道病毒71型(EV71)特异性抗原VP1的单克隆抗体或多克隆抗体和质控抗鼠IgG，结合胶体金标记的肠道病毒71型(EV71)特异性抗原VP1的单克隆抗体，应用膜层析双抗体夹心法，检测标本中肠道病毒71型(EV71)。应用本发明试纸条检测，操作简单、方便、快速、简捷，不需特殊仪器设备，不需专业培训，结果清晰易辨，操作简单，易于推广，适合基层，适合于突发事件的大批量现场检测，适合早期诊断，对肠道病毒71型(EV71)的感染诊断起到辅助作用。
文档编号G01N33/558GK102323413SQ201110150289
公开日2012年1月18日 申请日期2011年6月7日 优先权日2010年6月4日
发明者刘明 申请人:北京庄笛浩禾生物医学科技有限公司
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