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专利名称：：神农香菊指纹图谱的测定方法
技术领域：
：本发明涉及神农香菊指纹图谱的测定方法，具体的说是应用指纹图谱特征对烟用神农香菊的质量进行控制的测定方法。
背景技术：
：神农香菊系菊科菊属的一个新变种，产于湖北省神农架林区，分布于海拔2000m以上向阳开阔的空旷地，全株具有特殊的浓郁香气。民间以其花、叶阴干作香囊。神农香菊中含有的木犀草素具有镇咳、祛痰、抗炎、抑菌、抗过敏和免疫增强作用，用于慢性支气管炎和其他呼吸道疾病的痰多咳嗽者。神农香菊在黄鹤楼淡雅香品类中，能使产品香气淡雅纯正、丰满细腻，口味自然醇和、纯净舒适，并且具有镇咳祛痰的作用。但目前对神农香菊的研究均是研究其化学成分，探讨神农香菊挥发油中的化学成分，主要是一些单萜类，倍半萜及其含氧衍生物。如天然产物研究与开发.1994,6(3),32-34;武汉植物学研究.2005,23(6).-610-612;中国中药杂志.2002，27(8).598-599。昔纹图谱作为中草药等质量控制的方法，在国际上已形成共识。指纹图谱技术针对中药复杂体系整体性和指纹性特点，是中药质量控制和生产工艺控制的一种有效技术手段，并已正式出现在相关指导性文件中。指纹图谱技术结合了指纹图谱整体定性和指标成分定量两种手段，可全面反映工艺过程中各类成分质和量的变化情况。指纹图谱作为神农香菊的质量控制方面目前还没有研究。菊花指纹图谱目前也有一些研究，程宏英分析科学学报.2007,23(3),257-262、赵玉丛中草药.2005,36(10)，1552-1555等研究了不同来源、不同品种菊花的指纹图谱。但因神农香菊和一般菊花的活性成分含量有很大的差异，主要是神农香菊中的木犀草素含量较高，试验研究用他们的方法很难将神农香菊中的木犀草素与其他物质较好的分开，具有一定的局限性。
发明内容基于目前对神农香菊的研究弱点，本发明建立了一种能将神农香菊活性成分进行有效分离的色谱方法，构建了神农香菊的色谱指纹图谱，并利用该指纹图谱特征对神农香菊的质量迸行全面控制。本发明通过下述步骤来实施(a)标准溶液的制备精密称取木犀草素，加甲醇溶解、混匀、定容，制成每lml含l.Omg木犀草素的溶液，即得标准溶液；(b)供试品溶液制备精密称取神农香菊粉末(20目)，精密加入甲醇1040ml，称定重量，超声提取1060分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，过滤，滤液置蒸发皿中蒸干，残渣用甲醇溶解并转移至25100ml量瓶中，定容，摇匀，过滤，取滤液，即得供试品溶液；(c)色谱条件用十八垸基硅垸键合硅胶为填料，采用梯度洗脱，流动相A为PH=2.5的O.Olmol/1磷酸缓冲盐水溶液，流动相B为甲醇，梯度洗脱的程序如下<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>流速0.5ml/min，检测波长为350nm，柱温35'C;理论塔板数按木犀草素峰计算；(d)对照指纹图谱的获得精密吸取标准溶液和供试品溶液5ul，按上述色谱条件，注入液相色谱仪，通过标准品木犀草素的色谱峰，确定供试样品色谱图中的木犀草素峰，按照色谱图方法学考察的方法确定神农香菊对照指纹图"J並l曰5(e)色谱分析将每批次所得的供试品溶液的指纹图谱与神农香菊对照指纹图谱经中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版比较，来确定神农香菊的质量。本发明色谱图的方法学考察1)精密度研究精密吸取供试品溶液5ul，按i述色谱条件，连续进样5次，以木犀草素峰作为参照峰，指定其a值为l.OOO，考察仪器精密度。各特征指纹峰相对保留时间和特征指纹峰相对峰面积的RSD值均小于3%，符合指纹图谱的要求。2)稳定性研究精密吸取供试品溶液5ul，按上述色谱条件，分别于Oh、3h、6h、9h、12h、24h进行检测，以木犀草素峰为参照，指定其a值为l.OOO，考察稳定性，各特征指纹峰相对保留时间和特征指纹峰相对峰面积的RSD值均小于3%，符合指纹图谱的要求。3)重复性研究取神农香菊粉末(20目)各5份，精密称定，照"供试品溶液的制备"所述的方法制备供试品溶液，按上述色谱条件进行测定，以木犀草素峰为参照，指定其a值为1.000，考察方法的重复性，各特征指纹峰相对保留时间和特征指纹峰相对峰面积的RSD值均小于3%，符合指纹图谱的要求。本发明的有益效果①本发明建立的色谱方法具有精密度高、稳定性好、重复性好的优点，符合指纹图谱的要求，可作为神农香菊质量检测方法，全面监控,农香菊的质量；②本发明能将神农香菊活性成分进行有效分离，构建了神农香菊的指纹图谱，填补了神龙香菊在活性成分分离和指纹图谱中研究的空白；③对神龙香菊的质量评价不再局限于对某一种成分的研究，而是从整体评价，应用指纹图谱特征对烟用神农香菊原药材的质量进行全面控制，确保巻烟产品加香加料的稳定性，提供了一种有效的产品质量检测方法和工艺技术创新的评价平台。图1是对照品木犀草素色谱图，图2是神农香菊对照指纹图谱，图3是十批神农香菊指纹图谱叠加图，具体实施例方式下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明，以下实施例是对本发明的解释而本发明并不局限于以下实施例。实施例(a)对照品溶液的制备精密称取木犀草素(中国药品生物制品检定所，批号111520—200201)，加甲醇(色谱纯，美国天地公司)制成每lml含1.0mg木犀草素的溶液，制得对照品溶液。(b)神农香菊溶液的制备取10个不同批次神农香菊原药材粉末(过20目筛)各1.0g，精密称定，精密加入甲醇20ml，称定重量，超声提取30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，过滤，滤液置蒸发皿中蒸干，残渣用甲醇溶解并转移至50ml量瓶中，加甲醇至50ml刻度，摇匀，滤过，取滤液，制得神农香菊溶液。表l10个不同批次的神农香菊样品来源样品产地采集时样品间1神农架板仓07.1162神农架板仓07.123神农架八角庙07.1184神农架八角庙07.1295巴东绿葱坡07.110产地采集时_^_巴东绿葱坡07.12神农架燕子垭02.10神农架燕子垭03.1神农架天门垭04.10神农架天l，垭05.11(c)色谱条件使用十八垸基硅烷键合硅胶为填料的DIONEX-ACCLAIM.120C18(250mmX4.6mm，5m)色谱柱；采用梯度洗脱，流动相A为PH=2.5的0.01mol/l磷酸缓冲盐水溶液，流动相B为甲醇，梯度洗脱的程序如表2:表2梯度洗脱程序时间(min)_流动相A(%)流动相B(%)0~20623820~3562—5238—4835~905248卯~12052—048—100120~1400100流速0.5ml/min，检测波长为350nm，柱温35。C;理论塔板数按木犀草素峰计算应不低于3000。(d)对照指纹图谱的获得精密吸取对照品溶液和神农香菊溶液5iU，按上述色谱条件，注入液相色谱仪，通过对照品木犀草素的色谱峰，确定神农香菊原药材溶液色谱图中的木犀草素峰，按照色谱图方法学考察的方法确定神农香菊原药材对照指纹图谱。图1是对照品木犀草素色谱图。图2是神农香菊的指纹图谱。神农香菊的指纹图谱上相对峰面积大于0.03的峰有17个特征峰，68号峰为木犀草素，如下表3所示:表3神农香菊指纹图谱特征峰表述<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>(e)色谱分析指纹图谱能够综合的评价神农香菊的质量，因此将每批次所得的神农香菊指纹图谱与神农香菊对照指纹图谱经中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版比较。计算10批神农香菊原药材的相似度，相似度不低于0.9，说明神农香菊原药材质量合格。IO批神农香菊原药材指纹图谱叠加图如图3所示。权利要求1.一种神农香菊指纹图谱的测定方法，其特征包括如下步骤(a)标准溶液的制备精密称取术犀草素，加甲醇溶解、混匀、定容，制成每1ml含1.0mg木犀草素的溶液，即得标准溶液；(b)供试品溶液制备精密称取神农香菊粉末20目，精密加入甲醇10～40ml，称定重量，超声提取10～60分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，过滤，滤液置蒸发皿中蒸干，残渣用甲醇溶解并转移至25～100ml容量瓶中，定容，摇匀，过滤，取滤液，即得供试品溶液；(c)设定色谱条件用十八烷基硅烷键合硅胶为填料，采用梯度洗脱，流动相A为PH＝2.5的0.01mol/l磷酸缓冲盐水溶液，流动相B为甲醇，梯度洗脱的程序如下<tablesid="tabl0001"num="0001"wi="136"></tables>流速0.5ml/min，检测波长为350nm，柱温35℃；理论塔板数按木犀草素峰计算；(d)获得对照指纹图谱精密吸取对照品溶液和供试品溶液5μl，按上述色谱条件，注入液相色谱仪，通过标准品木犀草素的色谱峰，确定供试样品色谱图中的木犀草素峰，按照色谱图方法学考察的方法确定神农香菊原药材对照指纹图谱；(e)进行色谱分析将每批次所得的供试品溶液的指纹图谱与神农香菊对照指纹图谱经中药色谱指纹图谱相似度评价系统比较。全文摘要本发明提供了一种神农香菊指纹图谱的测定方法，通过液相色谱仪测定的供试品溶液的指纹图谱与神农香菊对照指纹图谱经中药色谱指纹图谱相似度评价系统比较，应用指纹图谱特征对烟用神农香菊原药材的质量进行全面控制，确保卷烟产品加香加料的稳定性。本发明具有精密度高、稳定性好、重复性好的优点，能将神农香菊活性成分进行有效分离。文档编号G01N33/15GK101685088SQ20081019710公开日2010年3月31日申请日期2008年9月27日优先权日2008年9月27日发明者威万,卢金清,琳李,娟王,詹晓莲,郭国宁申请人:湖北中烟工业有限责任公司