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专利名称：：通过干扰巢蛋白表达来筛选抑制肿瘤增殖和促进细胞凋亡的药物的方法
技术领域：
：本发明属于分子生物学领域，涉及一种筛选抑制肿瘤增殖和促进细胞凋亡的药物的方法，尤其是涉及一种通过干扰巢蛋白的表达来筛选抑制肿瘤增殖和促进细胞凋亡的药物的方法。
背景技术：
：细胞骨架蛋白在细胞运动、分裂、信息传递、能量转换、代谢调控以及纤维细胞形态方面具有重要作用。细胞骨架，按纤维直径的大小又可将其分为微管、微丝、中间纤维或称中间丝以及微梁格。中间纤维的分布具有严格的组织特异性。这一点已被应用于肿瘤临床鉴别诊断，以鉴别肿瘤细胞的组织来源。巢蛋白(巢蛋白)是第VI中间丝蛋白。在哺乳动物中，巢蛋白最早发现表达在发育中的神经系统和成年神经系统的神经前体细胞表面，随后在神经系统以外的其他部位如肝脏、血管内皮、骨骼肌、表皮基底层、毛囊、肾脏足细胞等也发现了巢蛋白的表达，而当这些组织细胞发育成熟以后，巢蛋白就停止表达，当成熟的细胞又发生再生(如缺血、坏死、新生瘤样变)时，巢蛋白又呈现返祖性表达。在恶性黑色素细胞瘤中，随着肿瘤侵袭性增强，巢蛋白的表达也增强。这些已发现的现象可能表明巢蛋白与细胞的增殖和恶性度是有一定关系的。目前尚没有任何关于巢蛋白对肿瘤细胞增殖、凋亡以及还未被人所知的功能的研究报道。这种中间丝蛋白参与什么样的信号通路，影响细胞什么方面的生物学功能，进而影响机体的功能，这些都是值得研究和探讨的方面。研究巢蛋白对于细胞的生长，增殖，凋亡，迁移，分化方面是否有影响，巢蛋白影响细胞的哪一些信号通路，也有助于应用在细胞治疗一些疾�。�如癌症，细胞增殖性疾�。�等等。
发明内容本发明的目的是提供一种新的筛选抑制肿瘤增殖和促进细胞凋亡的药物的方法，具体是通过干扰巢蛋白的表达来筛选抑制肿瘤增殖和促进细胞凋亡的药物的方法。本发明所述的一种通过干扰巢蛋白的表达来筛选抑制肿瘤增殖和促进细胞凋亡的药物的方法，包括以下步骤A.提供肿瘤的特定细胞株和培养条件；B.鉴定上述肿瘤细胞株表达巢蛋白的表达；C.加入待筛选的药物；以及D.培养48小时或更长的时间，检测巢蛋白的表达，检测结果与B步骤的结果进行比较，如果出现巢蛋白表达下调的情形，该待选药物成为抑制肿瘤增殖和/或促进细胞凋亡的先导药物。优选地，所述步骤A中，所述的肿瘤细胞株是小鼠黑色素瘤B16细胞株或人黑色素瘤UACC903细胞株，所述培养基是通用的哺乳类动物细胞培养液，培养条件是5%C02、37°C。优选地，所述步骤B中，所述鉴定方法是用免疫荧光细胞化学和RT-PCR方法鉴定巢蛋白的表达。优选地，所述步骤C中，所述待筛选的药物是SiRNA序列。优选地，所述步骤D中，所述检测巢蛋白的表达的方法是免疫荧光细胞化学和RT-PCR检测方法。本发明首先通过对巢蛋白巢蛋白在不同肿瘤组织中的表达的研究，证实了巢蛋白在血管肉瘤和胃肠道间质肿瘤中的表达和恶性度成正相关。首次发现巢蛋白在胰腺腺癌，肝内胆管细胞癌，肺鳞癌和肺腺癌、急慢性粒细胞性白血�。�血管肉瘤的肿瘤细胞中也有表达，目前均未见报道。本发明以小鼠黑色素细胞瘤B16和人黑色素瘤UACC903为例，通过实验研究巢蛋白短暂表达下调对小鼠黑色素细胞瘤B16增殖的影B向，以及利用慢病毒实验研究巢蛋白长期表达下调对小鼠黑色素细胞瘤B16增殖的影响。本发明以SiRNA序列作为药物筛选的示例，验证了上述方法的可行性，通过建立长期干扰巢蛋白表达的小鼠黑色素瘤细胞系B16F10和人黑色素瘤细胞系UACC903，获得巢蛋白与肿瘤细胞生长，增殖，凋亡和迁移等生命活动关系的直接证据。首次发现干扰B16F10巢蛋白基因表达与对照组细胞相比倍增时间延长，细胞增殖减慢，更易于凋亡。首次发现干扰人黑色素瘤细胞UACC903的巢蛋白基因表达，降低UACC903迁移，使细胞增殖减慢，更易于凋亡。从功能上证明了巢蛋白在肿瘤细胞增殖发育上的重要作用。因此，建立通过干扰巢蛋白的表达来筛选抑制肿瘤增殖和促进细胞凋亡的药物的方法是可行的，也是非常有应用前景的。本发明首次提出了这种筛选抑制肿瘤增殖和促进细胞凋亡的药物的方法。本发明在实验过程中已经完成了对三种设计的SiRNA序列的筛�。�表明其中有两种SiRNA序列有效地干扰小鼠B16细胞株巢蛋白表达，从而抑制小鼠黑色素细胞瘤B16的增殖和促进肿瘤细胞凋亡。基于同样的原理和操作，我们也可以对其他潜在的抗癌药物进行筛选。本发明同时构建一个能够长期干扰B16细胞巢蛋白表达的慢病毒载体质粒，装入经筛选的SiRNA序列后，应用在体内肿瘤模型，瘤体内直接注射巢蛋白表达下调的lentivirus直接研究巢蛋白对在体肿瘤增殖凋亡的影B向，为肿瘤的临床治疗提供一定的实验依据。由此，本发明所述的通过干扰巢蛋白的表达来筛选抑制肿瘤增殖和促进细胞凋亡的药物的方法，也可用于除干扰RNA以外其他潜在的抗肿瘤药物的筛选。图1是干扰小鼠巢蛋白表达对照组和干扰组干扰小鼠恶性黑色素瘤B16细胞48小时后光镜检查的结果图，左边的(A)图是对照组，右边的(B)图是干扰组。图2是SiRNA00380nM干扰小鼠B1648小时后10mM(+)-SodiumL-ascorbate促凋亡不同时间段光镜图(200X)。图3是SiRNA00380nM干扰小鼠B1648小时后10mM(+)-SodiumL-ascorbate促凋亡6、12、24小时caspase3和heochst染色图(200X)。图4是干扰小鼠巢蛋白表达对照组和干扰组干扰小鼠恶性黑色素瘤B16细胞48小时后光镜检查的结果图，左边的(A)图是SiRNA80nM干扰组，右边的(B)图是对照组。图5的A、B是80nM对照、80nMSiRNA1转染UACC903细胞48小时后光镜结果图，A为对照组，B为干扰组(IOOX，bar=200);C、D分别是80nM对照、80nMSiRNA1转染UACC903细胞48小时后Ki_67染色结果(red)，干扰组细胞增殖明显下降(200X，bar=100)。图6为分别用对照或干扰序列转染人UACC90348小时后用8um孔径的Transwell做体外迁移实验，A图是对照序列转染细胞的迁移结果，B图是巢蛋白表达下调细胞的迁移结果，与对照组相比，干扰组细胞迁移明显减少。(200X，bar=100)图7为慢病毒载体质粒PLL3.7的图谱。Hpal和Xhol是酶切位点，新合成片断即插入在位于U6启动子下游的Hpal和Xhol的酶切位点中。图8是干扰小鼠巢蛋白表达的慢病毒与乱序对照组慢病毒感染B16细胞72小时后荧光图，A.干扰巢蛋白表达的慢病毒，绿色是GFP，B.红色是巢蛋白；C.乱序对照组的慢病毒，绿色是GFP，D.红色是巢蛋白。图9为A-C有效干扰巢蛋白表达的UACC903细胞株荧光染色。A.UACC903细胞株表达绿色荧光。B.巢蛋白(Red)的免疫组化染色几乎没有表达。C.对应的Hoechst(blue)核染色。D-E对照组的UACC903细胞株荧光染色。D.UACC903细胞株表达绿色荧光。E.巢蛋白(Red)的免疫组化染色可以看见荧光表达。F.对应的Hoechst(blue)核染色。(200X，bar=100)图10为长期干扰巢蛋白表达的人黑色素瘤UACC903细胞的不同时间段细胞表形和形态的观察图。A.对照组病毒感染第3天，(200X，bar=100)。B.对照组病毒感染第8天，(200X，bar=100)。C.干扰组病毒感染第3天，(200X，bar=100)。D.干扰组病毒感染第8天，出现成团生长和凋亡。(400X，bar=50)具体实施例方式实施例一免疫组化检测巢蛋白在不同恶性度肿瘤中的表达本实验采用的病理组织切片主要来源于中山大学第一附属医院病理科和中山大学肿瘤防治中心病理科，包括高，低分化胃肠道间质肿瘤；高，低分化血管肉瘤，海绵状血管瘤；高分化，中分化和低分化胰腺腺癌；高分化，中分化和低分化肝细胞性肝癌；高、低分化肝内胆管细胞癌；胚胎性横纹肌肉瘤，腺泡型横纹肌肉瘤，多型性横纹肌肉瘤，恶性黑色素细胞瘤，睾丸间质细胞瘤，视网膜母细胞瘤，良性和恶性胰岛细胞瘤，高分化，中分化，低分化皮肤鳞癌；造血系统肿瘤如急慢性淋巴细胞性白血病，急慢性非淋巴细胞性白血�。琈DS。巢蛋白在不同肿瘤组织切片上的表达巢蛋白在血管肉瘤和海绵状血管瘤的表达在本实验所取的15例高分化血管肉瘤和6例低分化血管肉瘤中我们可以看到巢蛋白的表达，但是在良性海绵状血管瘤中没有巢蛋白的表达，只有在肿瘤的新生血管内皮细胞中表达巢蛋白。在低分化血管肉瘤中大约有80%的肿瘤细胞表达巢蛋白，比较集中强度中等偏上。而在高分化血管肉瘤中只有大约30%肿瘤细胞表达巢蛋白，两者巢蛋白组化指数有显著性差异(P<0.01)。巢蛋白在胃肠道间质肿瘤(GIST)中的表达在本实验所取的14例高度恶性和14例低度恶性GIST中，都可以看到大约70-80%巢蛋白表达，其中高度恶性GIST有大约80%表达巢蛋白，低度恶性GIST大约有50%表达巢蛋白。统计学分析两者的组化指数有统计学意义(P=0.003)。巢蛋白在胰腺腺癌的表达本实验所取的14例高度恶性胰腺腺癌(7/14)和6例低度恶性胰腺腺癌(3/8)中可以看到巢蛋白的表达，表达强度中等，比较均一，其统计学上没有差异。巢蛋白在黑色素细胞瘤，横纹肌肉瘤的表达巢蛋白在恶性黑色素瘤细胞的表达，而且表达很强，但是在良性黑色素细胞痣表面不表达；巢蛋白在腺泡形横纹肌肉瘤，胚胎性横纹肌肉瘤，多型性横纹肌肉瘤细胞表面都表达，而且在肿瘤组织中的一些正常的横纹肌表面也可以看到微量表达。巢蛋白在造血系统肿瘤中的表达巢蛋白在AML骨髓涂片中表达，主要表达在一些圆形，卵圆形细胞表面；巢蛋白在CML骨髓涂片中也少量表达，主要也是表达在圆形细胞表面；巢蛋白在MDS骨髓涂片有中量表达，主要也是表达在圆形细胞表面。但是在ALL和CLL骨髓涂片表面不表达。巢蛋白在肝细胞性肝癌，肝内胆管细胞癌的表达巢蛋白在肝细胞性肝癌表面不表达，仅仅表达在癌旁的新生血管内皮细胞上，在肝内胆管细胞癌表面有中等强度的表达。附组化指数的计算与统计分析方法先规定一些指数染色强阳性是"3"，中度阳性是"2"，弱阳性是"1"，在免疫组织化学切片上的肿瘤区随机取7-12个视野，在200倍镜下数每一个视野的肿瘤细胞数，同时数不同染色强度的肿瘤细胞数，然后将7-12个视野的肿瘤细胞总数相加，不同染色强度肿瘤细胞数也分别相加，最后除以肿瘤细胞总数得到不同染色强度肿瘤细胞所占的百分比，再乘以各自的染色强度指数，最后相加，得到的就是组化指数。比如如果强阳性的肿瘤细胞占20%，中阳性肿瘤细胞占10%，弱阳性占70%，最后的结果就是20%X3+10%X2+70%XI=1.5，即这个肿瘤切片的巢蛋白染色组化指数是1.5。同一种组织类型肿瘤的高分化和低分化类型切片组化指数用均数±标准误(^士S.E.M)表示。统计学软件采用SPSS10.0，用独立样本T检验对所有高、低分化的血管肉瘤，胃肠道间质肿瘤，胰腺腺癌进行统计，用双尾概率P值来表示，P<0.05表示有统计学差异，P<0.01表示有显著性差异。本实施例说明巢蛋白在不同类型的肿瘤中均有表达，且在血管肉瘤和胃肠道间质肿瘤中的表达和恶性度成正相关。这为本发明将巢蛋白应用于筛选抑制肿瘤增殖和促进细胞凋亡的药物奠定了基础。实施例二小鼠黑色素细胞瘤B16的培养和对巢蛋白表达的监测方法的确立本实验所用的动物是清洁级C57BL/6小鼠，6_8周龄，雌雄不限，购自中山大学医学实验动物中心。主要试剂荧光免疫化学试剂—抗小鼠抗大鼠/小鼠巢蛋白抗体(巢蛋白)，Chemicon公司小鼠抗BrdU抗体，DSHB公司小鼠抗小鼠PCNA抗体，CellSignalingTechnology公司兔抗小鼠Ki67抗体，Abeam公司二抗Cy3偶联的山羊抗小鼠IgG(H+L)，JacksonImmunoResearch公司R-PE偶联的山羊抗兔IgG(H+L)，SouthernBiotech公司血清山羊血清封闭液(即用型)，武汉博士德生物工程公司S-P免疫组化试剂盒(ImmunohistochemicalKit)，迈新公司培养细胞试剂高糖DMEM培养基，Gibco公司月台牛血清(FBS)，Hyclonegonsi公司双抗生素(Penicillinandstreptomycin,Sigma，USA)胰酶/EDTA(Trypsin/EDTA，Gibco)DMS0(Sigma，USA)RT-PCR试剂TrizolandRT-PCRkiti式剂盒(Invitrogen)小鼠P-actin引物(上海生工)小鼠巢蛋白引物(上海生工)小鼠B16细胞原代培养与传代给6-8周龄C57BL/6J小鼠背部皮下注射小鼠黑色素细胞瘤B16传代细胞1X105。一周以后小鼠背部长出肿瘤，就可以实施原代取材。75%的酒精消毒背部皮肤两次，断颈，沿肿瘤边缘剪开背部皮肤，剥离肿瘤外部包膜，暴露黑色素细胞瘤，选取没有组织筋膜，没有血管和结缔组织的肿瘤区域，轻轻剪下一块放入小培养皿中，用眼科剪反复剪碎，加入O.25%/0.02X的胰酶/EDTAlml于离心管中，后将组织放入胰酶中消化，反复吹打，室温5分钟。用细吸管吸出吹打成单细胞的悬液，并且用完全高糖培养基中和，剩下的未消化组织继续加入lml胰酶，吹打消化5分钟。吸出，中和，反复直到所有的组织被消化成单细胞悬液.然后1100rpm，4分钟离心，弃上清，以1-4X105个/mL细胞密度种于25mL培养瓶中，每瓶4mL培养液，5%0)2、371:条件下培养。24小时换液即可见到细胞成梭形贴壁，3天可以传代。根据细胞的接种密度2天传代一次。吸去培养基，0.01MPBS清洗瓶底，弃去PBS，加入0.25%胰酶/EDTA，37t:消化2-5分钟。完全培养基中和胰酶，把细胞转入离心管中，1100rpm离心5分钟。吸弃培养液，用吸管吹打成单细胞悬液，加入新鲜培养液，以1:3细胞密度接种。小鼠B16细胞株巢蛋白基因表达鉴定免疫荧光细胞化学细胞用PBS洗2次，4X的多聚甲醛固定20分钟，用0.01MPBS洗2次，每次5分钟。用免疫组化笔在盖玻片周围画圈，二抗宿主血清封闭60分钟。吸弃血清后，一抗室温孵育4C过夜。0.01MPBS洗3次，每次5分钟。二抗室温孵育0.5-1小时。0.01MPBS洗3次，每次5-10分钟。lg/mlHoechst33344衬染细胞核。荧光显微镜照相系统下观察拍照。RT-PCR鉴定巢蛋白表达提取总RNA:预先将P4代小鼠B16细胞传入六孔板中，培养两天待细胞融合至80X，PBS洗2遍，每孔加入trizo1lml，用Tip头吹打4分钟，静置4分钟，裂解细胞。8分钟后将已裂解的细胞移入无RNA酶的1.5ml的EP管中，然后加入0.2ml氯仿，振荡15秒，室温放置5分钟，12000g4t:离心15分钟。将上层水相转移到一个新的离心管中，加入等体积异丙醇，混匀，室温放置20分钟。12000g4t:离心10分钟。弃去上清，加lml无水乙醇洗涤RNA沉淀，7500g4t:离心5分钟。弃去上清，空气干燥RNA沉淀5分钟，用DEPC处理过的水20ul溶解RNA，取出lul加入199ul无RNA酶的水测定0D260和0D280的结果后计算0D260/0D280，比值应该在1.6_2.O之间，同时再取出2ulRNA跑电泳，电泳胶用1.2%。其余的-8(TC保存。合成cDNA:采用FermentasRT试齐U盒，在20iU体系力Q入1iUDeoxyribo皿clease，lulDeoxyribo皿cleasebuffer禾口1ligRNA，37。C孵育30min后，力口入25mMEDTAlul65。C孵育10min以除DNA污染。处理后的RNA作为合成cDNA的模板，条件为1iigRNAPrimeroligo(dT)180.5iig/ii1X1ylDEPC-treated水to17(TC孵育5min，迅速置于冰上按顺序加入M-MLV5Xreactionbuffer4u110mM4dNTPmix2ii1Ribo皿cleaseinhibitor20Ulul去离子水(nucleasefree)to19u137。C孵育5min，力口入200皿itsRvertAidM-MLVReversetranscriptase,42°C孵育60min后再7(TC孵育10min。迅速置于冰上。合成的cDNA作为下一步PCR的模板。聚合酶链反应(PCR)按下列组份配制PCR反应液(20ul体系)cDNA0.8ii1引物l(lOuM)liil引物2(10uM)lii1Mg2+1.34ul10XbufferwithoutMg2+2ii1d證(mixed)2ii1Tag0.68ii1灭菌去离子水11.2iU反应条件(小鼠巢蛋白)预变性95°C4分钟，变性95°C30秒，退火60°C1分钟，延伸72°C1分钟。35个循环扩增。反应条件(小鼠P-actin):预变性95°C4分钟，变性95°C30秒，退火58°C1分钟，延伸72°C1分钟，30个循环扩增。小鼠P-actin弓l物序列采用5，_agaagatctggcaccacacc_3，5'-tacgaccagaggcatacagg-3'小鼠巢蛋白引物序列采用5，_gg3g3gtcgctteg3ggtgc_3，5，—gtc3gg朋3gcc朋g3g朋g—3，PCR产物用1.2%琼脂糖凝胶电泳鉴定，凝胶成像仪照相。实施例三巢蛋白表达短期下调对小鼠黑色素细胞瘤B16增殖和凋亡的影响设计了三个SiRNA序列，如下siNM_016701_001耙序列AAAGGAGAATTGCAATTCA正义链(5'-3'):AAAGGAGAAUUGCAAUUCAdTdT反义链(3'-5'):dTdTUUUCCUCUUAACGUUAAGUsiNM_016701_002耙序列CAAAGCCTCTTAGAAATGA正义链(5'-3'):CAAAGCCUCUUAGAAAUGAdTdT反义链(3'-5'):dTdTGUUUCGGAGAAUCUUUACUsiNM_016701_003耙序列GTGAGACTCTGGAATGCAA正义链(5'-3'):GUGAGACUCUGGAAUGCAAdTdT反义链(3'-5'):dTdTCACUCUGAGACCUUACGUU阴性对照耙序列TTCTCCGAACGTGTCACGT正义链(5'-3'):UUCUCCGAACGUGUCACGUdTdT反义链(3'-5'):dTdTAAGAGGCUUGCACAGUGCA实验方法消化p5小鼠黑色素细胞瘤B16，以2X104/孔接种在24孔板中，24小时后开始干扰，选取SiRNA001、002、003序列，分别选用30nM、50nM、80nM、lOOnM的终浓度，每一孔总体积500ul，各用lullipofectmin2000和不同浓度的SiRNA重悬在opti-MEMI500ul中；对照组用无关序列的SiRNA代替；阴性对照组用opti-MEMI代替SiRNA;37°C，5%C02孵箱中孵育8小时后换成完全培养基，继续孵育48小时后分别用免疫荧光细胞化学和RT-PCR来检测巢蛋白的表达。检测方法依照实施例二所确定的方法进行。结果显示001SiRNA和003SiRNA干扰48小时不同浓度RT-PCR的结果，002序列没有干扰效果。OOlSiRNA和003SiRNA片断50nM，80nM，100nM均可以不同程度干扰小鼠B16细胞巢蛋白的表达。OOlSiRNA和003SiRNAP-actin和巢蛋白灰度比见下表。表一<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>RNA干扰巢蛋白表达后对小鼠恶性黑色素瘤B16增殖的影响光镜检查干扰小鼠巢蛋白表达对照组和干扰组干扰48小时后光镜检查，如图1所示，可以看到细胞密度的差异性。图1中，A是对照组，B是干扰组。下面通过用(+)-SodiumL-ascorbate(维生素C钠盐)促进B16细胞凋亡，进一步研究巢蛋白的表达缺失对小鼠B16凋亡的影响。(+)-SodiumL-ascorbate促凋亡对SiRNA003干扰小鼠B1648小时后细胞的影响光镜及荧光显微镜观察按8X10V孔接种P5小鼠B16在6孔板中，共接种6个孔。24小时后用SiRNA00380nM浓度干扰，乱序对照组用无关序列代替SiRNA003，阴性对照组用lipofectamin2000代替，每一组都设一个复孔。8小时后换完全培养基，再过48小时，弃去完全培养基，每一孔加入2ml完全培养基，内含100ul0.2M(+)-SodiumL-ascorbate，终浓度10mM，促凋亡6小时，光镜拍片。SiRNA003，80nM干扰小鼠B1648小时后，用lOmMSodiumL-ascorbate促凋亡分别3，6，24小时，普通光学显微镜下观察细胞凋亡状态和染heochst观察细胞核的状态.结果促凋亡3个小时开始可以看到SiRNA003，80nM干扰小鼠B1648小时后，用10mMSodiumL-ascorbate促凋亡3小时细胞开始少量凋亡，6小时有大约40_50%细胞凋亡，24小时大约有80-90%细胞凋亡。对照SiRNA，80nM组和lipofectamin2000组干扰小鼠B1648小时后，用10mMSodiumL-ascorbate促凋亡3小时细胞几乎没有凋亡，6小时有大约10%细胞凋亡，24小时大约有10-15%细胞凋亡。见图2。图2是SiRNA00380nM干扰小鼠B1648小时后10mM(+)-SodiumL-ascorbate促凋亡不同时间段光镜图。10mM(+)-SodiumL-ascorbate促凋亡3个小时可以看到(A)SiRNA00380nM干扰组开始有大量贴壁细胞凋亡(200X);(B)对照80nM组和(C)lipofectamin2000阴性对照组几乎没有细胞凋亡(200X)。10mM(+)-SodiumL-ascorbate促凋亡6个小时可以看到(D)SiRNA00380nM干扰组有40X贴壁细胞凋亡(200X);(E)对照80nM组和(F)1ipofectamin2000阴性对照组有不到10%的细胞凋亡(200X)。10mM(+)-SodiumL-ascorbate促凋亡24个小时可以看到(J)SiRNA00380nM干扰组有80-90%贴壁细胞凋亡(200X);(H)对照80nM组和(I)lipofectamin2000阴性对照组有10-15%的细胞凋亡(200X)。流式细胞仪检测Annex-inV-FITC/PI(Ca+依赖的磷脂结合蛋白/PI)细胞凋亡早期改变发生在细胞膜表面，目前早期识别仍有困难。这些细胞膜表面的改变之一是磷脂酰丝氨酸(PS)从细胞膜内转移到细胞膜外，使PS暴露在细胞膜外表面。PS是一种带负电荷的磷脂，正常主要存在于细胞膜的内面，在细胞发生凋亡时细胞膜上的这种磷脂分布的不对称性被破坏而使PS暴露在细胞膜外。A皿exinV是一种Ca+依赖的磷脂结合蛋白，最初发现是一种具有很强的抗凝血特性的血管蛋白，AnnexinV具有易于结合到磷脂类如PS的特性。对PS有高度的亲和性。因此，该蛋白可充当一敏感的探针检测暴露在细胞膜表面的PS。将上述培养物，用0.25%的胰酶消化每一组细胞，收集包括上清液中的全部细胞，完全培养基中和，1100rpm离心4分钟，0.01MPBS清洗一次，用lmlPBS重悬送流式检测。10mM(+)-SodiumL-ascorbate促凋亡6小时，光镜下可以看见SiRNA00380nM干扰组细胞在六孔板中间100%脱落，边缘大约50%脱落，控制序列组边缘和中央只有大约10%脱落；阴性对照组有一孔几乎没有脱落细胞，复孔脱落细胞大约50%。MTT检测按2XIOV孔接种P5小鼠B16在24孔板中，共接种15个孔。24小时后用SiRNA00380nM浓度干扰，乱序对照组用无关序列代替SiRNA003，阴性对照组用lipofectamin2000代替，每一组都设一个复孔。8小时后换完全培养基，再过48小时，弃去完全培养基，每一孔加入lml完全培养基，内含50ul0.2M(+)-SodiumL-ascorbate，终浓度10mM，促凋亡24小时，检测MTT。在到达时间点的时候，吸去各孔培养基，避光加入0.5mg/mlMTTlml/孑L避光在37°C，5%C02培养箱中孵育3小时，取出避光吸去每一孔的MTT，加入lmlDMS0/孔，避光充分振荡7分钟，将每一孔的DMSO移入1.5mlE卯endorf管中，12000rpm离心5分钟，上清在570nm处测定0D值。检测3小时各孔MTT的变化，可以看到3个小时不同组别以003SiRNA80nM组最低，和lipofectamin2000组比较有显著性差异。caspase3检测同上法SiRNA003，80nM干扰小鼠B1648小时后，用10mMSodiumL-ascorbate促凋亡分别3小时，6小时，24小时，开始做caspase3的免疫荧光细胞化学。细胞用PBS洗2次，4%的多聚甲醛固定20分钟，用含有0.2%的TritonX100的0.01MPBS洗3次，每次IO分钟。正常山羊血清封闭60分钟。吸弃血清后，一抗caspase3(1:200)4t:过夜，室温复温30分钟。0.01MPBS洗3次，每次10分钟。二抗(山羊抗小鼠Cy3，1:150)室温孵育45分钟。0.01MPBS洗3次，每次5分钟。lg/mlHoechst33344衬染细胞核。荧光显微镜照相系统下观察拍照。结果可以看到促凋亡6小时有少量的caspase3阳性细胞；促凋亡12小时有大约20%的caspase3阳性细胞；促凋亡24小时有大约30%的阳性细胞，见图3。本实施例揭示了巢蛋白短期表达下调对小鼠黑色素细胞瘤B16增殖和凋亡的影响，从而可以将巢蛋白表达下调(短期或长期)作为筛选抑制肿瘤增殖和促进细胞凋亡的药物的重要指标之一。本实施例在实验过程中已经完成了对三种设计的SiRNA序列的筛�。�表明其中有两种SiRNA序列有效地干扰小鼠B16细胞株巢蛋白表达，从而抑制小鼠黑色素细胞瘤B16的增殖和促进肿瘤细胞凋亡。基于同样的原理和操作，我们也可以对其他潜在的抗癌药物进行筛选。实施例四巢蛋白表达短期下调对人黑色素细胞瘤UACC903增殖和凋亡的影响短期干扰的鉴定实验方法消化p5人UACC903细胞，以2X104/孔接种在24孔板中，24小时后开始干扰，选取SiRNA001，002，003片断，分别选用30nM，50nM，80nM，100nM的终浓度，每一孔总体积500ul，各用lullipofectmin2000和不同浓度的SiRNA重悬在opti-MEMI500ul中；乱序对照组用无关序列的SiRNA代替；阴性对照组用opti-MEMI代替SiRNA;37度，5%C02孵箱中孵育8小时后换成完全培养基，继续孵育48小时后分别用免疫荧光细胞化学和RT-PCR来检测。结果见图4。图4是干扰小鼠巢蛋白表达对照组和干扰组干扰小鼠恶性黑色素瘤B16细胞48小时后光镜检查的结果图，左边的(A)图是SiRNA80nM干扰组，右边的(B)图是对照组。显示干扰人UACC90348小时后的巢蛋白染色(红色)，与对照组相比干扰组巢蛋白染色明显下调。(200X，bar=100)短期干扰对细胞增殖的影响实验方法Ki67的检测干扰48小时以后，细胞用PBS洗2次，4%的多聚甲醛固定20分钟，用含有0.2%的TritonXIOO的O.01MPBS洗3次，每次10分钟。0.3%H202室温孵育30分钟，0.01MPBS洗三次，一次5分钟.正常山羊血清封闭15分钟。吸弃血清后，一抗PCNA(l:1000)和Ki67(l:100)4。C过夜，室温复温30分钟。0.01MPBS洗3次，每次10分钟。生物素化二抗室温孵育10分钟。0.01MPBS洗3次，每次5分钟。三抗室温孵育10分钟，0.01MPBS洗3次，一次10分钟，DAB显色3分钟，PBS冲洗，苏木素复染1分钟，1%盐酸酒精分化20秒，自来水洗，正置显微镜照相系统下观察拍照。[OH8]光镜观察取在24孔板中接种，80nM干扰24，48，72小时的p5UACC903细胞，200倍光镜下观察拍照。结果见图5。图5的A、B是80nM对照、80nMSiRNA1转染UACC903细胞48小时后光镜结果图，A为对照组，B为干扰组(100X，bar=200);C、D分别是80nM对照、80nMSiRNAl转染UACC903细胞48小时后Ki-67染色结果(red)，干扰组细胞增殖明显下降(200X，bar=100)。表二iUKi67平均组化指数_(2陽tailed)对照组1.9291±0.5195**0.000干扰组__0.8718±0.4810__上表可见，Ki67表达的组化指数在干扰组和对照组之间有显著性差异，证明干扰巢蛋白表达影响了细胞增殖。流式细胞仪检测细胞周期取在六孔板中接种，80nM干扰48小时的p5UACC903细胞，用胰酶消化成单个细胞，PBS洗两次，1100rpm离心4分钟，2mlPBS重悬细胞，加入70%冰乙醇500ul固定送流式测定细胞周期。流式细胞术检测细胞周期结果从检测结果可以看到，对照组S期占细胞总数53.77%，G0-G1期39.62%，G2-M期6.61%，G2/G1.91.在004干扰组S期占细胞总数27.52%，G0-G1期60.70%，G2-M期11.78X，G2/G1.86。可以看出，对照组DNA合成期的细胞比例远远高于干扰组，处于G0-G1期的细胞比例低于干扰组，暗示干扰组细胞大多数处于G0-G1期。<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>短期干扰细胞凋亡的实验实验方法3.1.4.3.1流式细胞仪检测PI/ANNEX:按8XIOV孔接种P5UACC903在6孔板中，共接种6个孔.24小时后用SiRNA00480nM浓度干扰，对照组用无关序列代替SiRNA004，对照组用lipofectamin2000代替，每一组都设一个复孔.8小时后换完全培养基，再过48小时，弃去完全培养基，同时0.25X的胰酶消化每一组细胞，收集包括上清液中的全部细胞，完全培养基中和，1100rpm离心4分钟，0.01MPBS清洗一次，用lmlPBS重悬送流式检测。流式细胞术检测细胞Annexin-V-FITC/PI结果可见80nMSiRNA1转染UACC903细胞48小时后收集细胞检测Annexin-V-FITC/PI的结果细胞有自发凋亡现象；对照组是80nM对照转染UACC903细胞48小时后收集细胞检测Annexin-V-FITC/PI的结果。人短期干扰细胞迁移的实验实验方法按8X104/孔接种P5UACC903在6孔板中，共接种6个孔。24小时后用SiRNA00480nM浓度干扰，对照组用无关序列代替SiRNA004，对照组用lipofectamin2000代替，每一组都设一个复孔。8小时后换完全培养基，再过48小时，消化细胞用无血清的高糖培养基600ul重悬，对照组和干扰组等数目接种到Transwell的两个孔里，下层用lml含10%胎牛血清的高糖培养基重悬，37度培养24小时后取出Transwell小室，用棉签擦去小室内侧的细胞，4X多聚甲醛固定20分钟室温，heochst染核，荧光显微镜下观察，并随机取10个视野拍照，计数，比较对照组和干扰组之间的差别。图6.分别用对照或干扰序列转染人UACC90348小时后用8um孔径的Transwell做体外迁移实验，A图是对照序列转染细胞的迁移结果，B图是巢蛋白表达下调细胞的迁移结果，与对照组相比，干扰组细胞迁移明显减少。(200X，bar=100)表三<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>上表可见，与对照组相比，干扰组细胞迁移数量明显减少，统计学上有显著性差异。细胞迁移计算如下8umTranswell上层接种等数目对照组或干扰组细胞，24小时后擦去小室上层细胞heochst染核计算小室下层细胞，随机计数10个视野细胞总数统计不同组别的差别。实施例五巢蛋白表达长期下调对小鼠恶性黑色素瘤B16与人黑色素细胞瘤UACC903增殖和凋亡的影响干扰小鼠或人巢蛋白表达的慢病毒载体的构建SiRNA，lipofectamin2000共转染B16F10，UACC903，48小时后，免疫组化和RT-PCR鉴定有效干扰的序列。小鼠有效序列为ssoligol:ssoligo2:人有效序列为ssoligol:5，TGGACAAGAGAACCTGGAAATTCAAGAGATTTCCAGGTTCTCTTGTCCTTTTTTC3，ssoligo2:5'TCGAGAAAAAAGGACAAGAGAACCTGGAAATCTCTTGAATTTCCAGGTTCTCTTGTCCA3'慢病毒对照序列如下(人和小鼠共用)ssoligol:ssoligo2:IO(TC4min退火，-20。C保存。用Hpal(平性末端)和XhoI(黏性末端)双酶切慢病毒载体P113.7后切胶回收，将双链DNA片断插入Hpal和XhoI的酶切位点，室温连接3小时，连接产物用DH5a转化，挑克隆抽质粒，HpaI和Xhol双酶切初步鉴定(在构建质粒的过程中没有加入HpaI平性末端的酶切位点，只加入了XhoI黏性末端的酶切位点，故双酶切只有XhoI可以切开，HpaI不能切开)，6个克隆XhoI可以切开，但是HpaI不能切开，初步证实构建有效。测序进一步鉴定。慢病毒包装，收集接种P6293ft细胞在0.1%明胶预包被的细胞培养皿中，待细胞融合至95%时，开始包装病毒细胞预先加5mlH-DMEM完全培养基，挑取序列正确的细菌克�。�摇菌抽质粒，用无菌水溶解(lug/ul)，吸取3ug质�：�9ulmix(lug/ul)，用1.5mlopti-meml溶解，室温5分钟；36ullipo-fectamin2000用1.5mlopti-memI溶解，室温5分钟；混合质�：蚻ipofectamin2000，室温20分钟后加入细胞表面。37。C孵育24小时，换10ml完全培养基，48小时后5000G4"C离心120分钟收集病毒(超高速离心浓縮病毒)，lOOulPBS重悬分装，-80。C保存。图7为慢病毒载体质粒PLL3.7的图谱。Hpal和Xhol是酶切位点，新合成片断即插入在位于U6启动子下游的Hpal和Xhol的酶切位点中。巢蛋白表达长期下调对小鼠恶性黑色素瘤B16增殖和凋亡的影响感染普通B16细胞将B16传入6孔板中，24小时密度到达60X时，加入1ml有效干扰巢蛋白表达的慢病毒或者对照慢病毒，在37t:培养箱中孵育24小时后换完全培养基，48小时后荧光下观察绿色荧光。免疫组化筛选将分别感染了干扰巢蛋白病毒的细胞和对照序列病毒的细胞取出一孔做免疫组化初步筛选有效的克隆吸去培养基，0.01MPBS冲洗两次，一次5分钟，再加入4%PFA室温固定20分钟，含有0.2%tritonX100的0.01MPBS洗三次，一次10分钟。用免疫组化笔在盖玻片周围画圈，正常山羊血清室温孵育45分钟，吸弃血清后，滴加一抗(小鼠抗小鼠的巢蛋白l:150)4t:过夜，室温复温30分钟。吸去一抗，0.01MPBS洗3次，每次10分钟。山羊抗小鼠CY3(1:150)室温孵育40分钟。0.01MPBS洗3次，每次10分钟。Heochst染色5分钟，荧光显微镜照相系统下观察拍照。结果感染B16细胞72小时后荧光显微镜下可以看到绿色荧光表达，免疫组化检测结果对比对照组，巢蛋白干扰组绿色荧光蛋白表达极微量的巢蛋白。见图8。图8是干扰小鼠巢蛋白表达的慢病毒与乱序对照组慢病毒感染B16细胞72小时后荧光图，A.干扰巢蛋白表达的慢病毒，绿色是GFP，B.红色是巢蛋白；C.乱序对照组的慢病毒，绿色是GFP，D.红色是巢蛋白。克隆分析用胰酶消化两种病毒细胞，分别在10毫升培养基中重悬150个细胞，按照每一个孔滴加2滴(100ul)加入96孔板中，两天换液一次，在荧光显微镜下观察一次。消化干扰mouse巢蛋白表达的慢病毒细胞和含有乱序序列的慢病毒细胞，分别计数，分别用150个细胞重悬在10毫升新鲜含有10%胎牛血清的高糖培养基中，接种在96孔板中，一个孔接种100ul培养基。然后放在37度培养箱中孵育，两天换液一次，观察一次实验结果。荧光显微镜拍照。结果对照组平均每两天倍增一次，而巢蛋白干扰组平均每4天倍增一次，倍增时间有显著性差异。结论长期下调巢蛋白表达的小鼠黑色素瘤细胞的群体倍增时间是正常小鼠黑色素瘤细胞的倍增时间的两倍左右。巢蛋白表达长期下调对人恶性黑色素瘤UACC903增殖和凋亡的影响采用上述干扰人巢蛋白表达的慢病毒感染人恶性黑色素瘤UACC903细胞株后，48小时后荧光下观察绿色荧光。图9为A-C有效干扰巢蛋白表达的UACC903细胞株荧光染色。A.UACC903细胞株表达绿色荧光。B.巢蛋白(Red)的免疫组化染色几乎没有表达。C.对应的Hoechst(blue)核染色。D-E对照组的UACC903细胞株荧光染色。D.UACC903细胞株表达绿色荧光。E.巢蛋白(Red)的免疫组化染色可以看见荧光表达。F.对应的Hoechst(blue)核染色。(200X，bar=100)不同时间段细胞表形和形态的观察长期培养稳定转染的干扰人巢蛋白表达的UACC903细胞株和对照组细胞株发现接种第2天荧光显微镜观察两组细胞生长良好，第5天荧光显微镜观察对照组细胞生长良好，干扰组细胞出现了成团生长和细胞凋亡。图10为长期干扰巢蛋白表达的人黑色素瘤UACC903细胞的不同时间段细胞表形和形态的观察图。A.对照组病毒感染第3天，(200X，bar=100)。B.对照组病毒感染第8天，(200X，bar=100)。C.干扰组病毒感染第3天，(200X，bar=100)。D.干扰组病毒感染第8天，出现成团生长和凋亡。(400X，bar=50)SEQUENCELISTING(序列表)〈110>中山大学〈120〉通过干扰巢蛋白表达来筛选抑制肿瘤增殖和促进细胞凋亡的药物的方法〈130〉〈140>200810199074.7<141>2008-10—13〈160>18〈170>PatentInversion3.4〈210>1〈211>20〈212>DNA〈213>人工序列〈400〉1agaagatctggcaccacacc20〈210>2〈211>20〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>2tacgaccagaggcatacagg20<210>3〈211>20〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>3ggagagtcgcttagaggtgc20〈210>4〈211>20〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>4gtcagg朋3gcc朋g3g朋g20〈210>5〈211>19<212>腿〈213>人工序列〈400>5朋3gg3g朋uugc朋皿C319〈210>6〈211>19〈212>薩〈213>人工序列〈400>6皿uccucuim3cguimagu〈210>7<211>19〈212>薩〈213>人工序列〈400>7c朋3gccucuimga朋ug3〈210>8〈211>19〈212>薩〈213>人工序列〈400>8guuucggagaauc皿imcu〈210>9〈211>19〈212>RNA〈213>人工序列〈400>9gug3gacucugg朋ugc朋〈210>10〈211>19〈212〉RNA〈213〉人工序列〈400>10cacucugagaccuimcguu〈210>11〈211>19〈212>RNA〈213〉人工序列<400>11uucuccgaacgugucacgu〈210>12〈211>19〈212>RNA〈213〉人工序列〈400〉12朋gaggcuugc3C3gugca19〈210>13〈211>55<212>廳〈213〉人工序列〈400>13tgtgagactctggaatgcaattcaagagattgcattccagagtctcacttttttc55〈210>14〈211>59〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400>14tcgag3朋aa3gtgagactctgg朋tgc朋tctcttg朋ttgcattcc3gagtctcaca59〈210>15〈211>55〈212>DNA〈213〉人工序列〈400〉15tggacaagagaacctggaaattcaagagatttccaggttctcttgtccttttttc55〈210>16〈211>59〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>16tcgaga朋aaaggac朋gagaacctgg朋atctcttgaatttcc;aggttctcttgtcc;a59〈210>17〈211>55〈212>DNA〈213>人工序列<400>17tttctccgaacgtgtcacgtttcaagagaacgtgacacgttcggagaattttttc55〈210>18〈211>59〈212>DNA<213>人工序列〈400〉18tCg￡lg￡l￡l￡l￡l￡l3ttctCCg朋CgtgtC3Cgttctcttg朋3Cgtg3C3Cgttcgg￡lg￡l￡l￡l59权利要求一种通过干扰巢蛋白的表达来筛选抑制肿瘤增殖和促进细胞凋亡的药物的方法，其特征在于，包括以下步骤A.提供肿瘤的特定细胞株和培养条件；B.鉴定上述肿瘤细胞株表达巢蛋白的表达；C.加入待筛选的药物；以及D.培养48小时或更长的时间，检测巢蛋白的表达，检测结果与B步骤的结果进行比较，如果出现巢蛋白表达下调的情形，该待选药物成为抑制肿瘤增殖和/或促进细胞凋亡的先导药物。2.根据权利要求1所述的通过干扰巢蛋白的表达来筛选抑制肿瘤增殖和促进细胞凋亡的药物的方法，其特征在于所述步骤A中，所述的肿瘤细胞株是小鼠黑色素瘤B16细胞株或人黑色素瘤UACC903细胞株，所述培养基是通用的哺乳类动物细胞培养液，培养条件是5%C02、37°C。3.根据权利要求1所述的通过干扰巢蛋白的表达来筛选抑制肿瘤增殖和促进细胞凋亡的药物的方法，其特征在于所述步骤B中，所述鉴定方法是用免疫荧光细胞化学和RT-PCR方法鉴定巢蛋白的表达。4.根据权利要求1所述的通过干扰巢蛋白的表达来筛选抑制肿瘤增殖和促进细胞凋亡的药物的方法，其特征在于所述步骤C中，所述待筛选的药物是SiRNA序列。5.根据权利要求1所述的通过干扰巢蛋白的表达来筛选抑制肿瘤增殖和促进细胞凋亡的药物的方法，其特征在于所述步骤D中，所述检测巢蛋白的表达的方法是免疫荧光细胞化学和RT-PCR检测方法。全文摘要本发明涉及一种通过干扰巢蛋白的表达来筛选抑制肿瘤增殖和促进细胞凋亡的药物的方法。本发明所述的方法包括以下步骤A.提供肿瘤的特定细胞株和培养条件；B.鉴定上述肿瘤细胞株表达巢蛋白的表达；C.加入待筛选的药物；以及D.培养48小时或更长的时间，检测巢蛋白的表达，检测结果与B步骤的结果进行比较，如果出现巢蛋白表达下调的情形，该待选药物成为抑制肿瘤增殖和/或促进细胞凋亡的先导药物。本发明获得巢蛋白与肿瘤细胞生长，增殖，凋亡和迁移等生命活动关系的直接证据，证实了建立通过干扰巢蛋白的表达来筛选抑制肿瘤增殖和促进细胞凋亡的药物的方法是可行的，本发明首次提出了这种筛选抑制肿瘤增殖和促进细胞凋亡的药物的方法。文档编号G01N33/53GK101726577SQ20081019907公开日2010年6月9日申请日期2008年10月13日优先权日2008年10月13日发明者夏添,杨旭辉,项鹏申请人:中山大学