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专利名称：用于检测水产动物病毒的检测试剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种检测水产动物病毒的检测试剂套组。
背景技术：
在亚洲及欧洲国家中，石斑鱼是鱼类中重要的品种，其可产生高经济价值。然而，因幼体会遭受病毒的伤害，使幼体的繁殖比例相当低。有多种病毒会攻击石斑鱼，如神经坏死病毒NNV (nervous necrosis virus)、虹彩病毒(irido virus)和感染性膜脏坏死病毒(infection pancreatic necrosis virus)。而神经坏死病毒对于石斑鱼幼体会造成伤害，并且导致死亡率高于90%以上。神经坏死病毒NNV是一种核酸病毒，属于野田病毒中的β -野田病毒(beranodavirus)的一种。神经坏死病毒的大小约为25-30纳米,其包含两种核糖核酸(RNA) =RNAl及RNA2，其中RNAl可表现蛋白质A，而RNA2可表现蛋白质α，形成NNV的帽结构。常见用于定量检测NNV的步骤是包含从石斑鱼组织中萃取出NNV的微颗粒，并进行RNA反转录为DNA，最后利用实时定量聚合酶连锁反应，亦是实时聚合酶连锁反应。虽然上述的方法在检测NNV可表现出高灵敏度及专一性，但因在操作流程中需小心处理，所以仅可适用于在实验室中的熟练该技术的人员操作，此缺点严重地阻碍了检测NNV方法的普及性，并且在水产养殖业中，NNV的大范围检验很难由实时聚合酶连锁反应完成。近年来，有许多研究团队使用酶联免疫吸附分析(ELISA)，如三明治免疫分析技术，而上述技术常因检测时的操作复杂度，无法将该技术普遍地推广。因此，具有容易操作的优点、高信赖性、高灵敏度和专一性的替代技术是近年来逐渐发展的重点。

发明内容
本发明的目的在于提供一种用于检测水产动物病毒的检测试剂套组。为实现上述目的，本发明采取的技术方案为一种用于检测水产动物病毒的检测试剂，包括多个磁性纳米粒子,分布于水溶液中，其中这些多个磁性纳米粒子中的磁性纳米粒子的构造为磁性核、界面活性剂层，所述界面活性剂层披覆于所述磁性核上，以及多个水产动物病毒抗体，所述多个水产动物病毒抗体结合于所述界面活性剂层上。本发明所述的磁性纳米粒子，其材料选自于四氧化三铁(Fe3O4)、三氧化二铁(Fe2O3)、铁猛酸(MnFe2O4)、铁酸钴(CoFe2O4)及铁酸镍(NiFe2O4)所组成的群组。在较佳的实施例中,所述磁性纳米粒子的磁性核的材料为四氧化三铁(Fe3O4)。本发明所述的界面活性剂是指能使目标溶液表面张力显著下降的物质，以及降低两种液体之间表面张力的物质，一般的界面活性剂为具有亲水与疏水基团的有机两性物质，可溶于有机溶液和水溶液。在本发明中，所使用的界面活性剂材料包含但不限于有机酸、蛋白质Α、蛋白质G、葡聚糖(Dextran)或微脂粒。优选地，所述界面活性剂的材料为葡聚糖。本发明中，所述的水产动物病毒包含神经坏死病毒、虹彩病毒和感染性胰脏坏死病毒。优选地，所述水产动物病毒是神经坏死病毒。此外，本发明所使用的水产动物指石斑鱼。本发明另提供一种检测水产动物病毒的方法，包括提供本发明所述的检测水产动物病毒的试剂，并萃取水产动物内的病毒，进一步将试剂与萃取物混合，量测免疫磁减量讯号，并藉由下述逻辑函数定量该病毒的浓度。
imi%) - a^b + B, …、
I — Γ其中，A为噪音强度，B为饱和值参数，是神经坏死病毒浓度，Φ。是随着变化的参数，Y是密合参数。 本发明还提供一种萃取组织内病毒的方法，其步骤为(I)取出水产动物的脑组织；(2)在含有水产动物脑组织的容器中加入萃取溶液；(3)将含有组织的容器放在冰上，并磨碎该组织；(4)取出容器中的上清液进行检测萃取效率。


图1-1为从石斑鱼幼体萃取神经坏死病毒颗粒的流程图。图1-2为从石斑鱼幼体萃取虹彩病毒颗粒的流程图。图2-1为神经坏死病毒浓度与萃取效率之间的关系示意图。图2-2为虹彩病毒浓度与萃取效率之间的关系示意图。图3-1为表面接有神经坏死病毒抗体(Anti-NNV)的磁性纳米粒子与附有FITC的二级抗体的示意图。图3-2为表面接有虹彩病毒抗体(Anti-GIV)的磁性纳米粒子与附有FITC的二级抗体的示意图。图4为图3所示表面接有神经坏死病毒抗体(Anti-NNV)的磁性纳米粒子与附有FITC的二级抗体在荧光显微镜下观察到受磁铁吸引的一种移动行为。图5为图3所示表面接有神经坏死病毒抗体(Anti-NNV)的磁性纳米粒子与附有FITC的二级抗体在荧光显微镜下观察到受磁铁吸引的另一种移动行为。图6-1为接有神经坏死病毒抗体的磁性粒子的粒径分布图。图6-2为接有虹彩病毒抗体的磁性粒子的粒径分布图。图7为磁性试剂的交流磁化率的虚数部分(Imaginary Part)作为适用的磁场频率函数图。图8为含有虹彩病毒抗体磁性试剂的稳定度测试。图9为免疫磁减量对神经坏死病毒浓度讯号的影响关系图。图10为在实时聚合酶连锁反应的测试方式中，神经坏死病毒浓度与交叉点的关系曲线图。图11为免疫磁减量(MR)与实时聚合酶连锁反应(PCR)检测神经坏死病毒浓度的有效性的关系图。
具体实施例方式为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步描述。实施例1-1萃取石斑鱼幼体中的神经坏死病毒所有神经坏死病毒NNV几乎存在于石斑鱼的脑组织中，本发明实施例将取出的O. 5克脑组织放入微量离心管，并加入200 μ I的萃取液(MagQu Co. ,Ltd.)至微量离心管，为了保持组织的新鲜度，将微量离心管放置在冰上并将组织磨碎，磨碎后3分钟，移开在冰上的微量离心管5分钟，取出在微量离心管中含组织的液体的上部溶液，做免疫磁减量检测并量测NNV的浓度。

图1-1是不同石斑鱼脑组织的萃取过程的流程图，其中图1-1 (a)直接从石斑鱼脑组织萃取神经坏死病毒的RNA,所萃取的RNA被转录为DNA,并藉由实时聚合酶连锁反应检测DNA的浓度，即为小亂 。根据萃取的结构，选择700TCID5Q/ml至4X 107TCID5(l/ml的神经坏死病毒浓度作为检测萃取NNV的浓度范围。所述的TCID5tl是指半数组织培养感染量。图1-1 (b)为萃取脑组织的神经坏死病毒颗粒，经由上述萃取流程，在上部溶液中含NNV颗粒通过实时聚合酶连锁反应检测并表示为(tfflV,part。经上述方式所萃取的NNV浓度，可经由ΦΝΝν,_/ΦΝΝν,κΜ的比例获得萃取效率值。如附图2-1所示，700TCID50/ml至4X107TCID50/ml的神经坏死病毒浓度中，本发明萃取神经坏死病毒的效率超过80%。实施例1-2萃取石斑鱼幼体中的虹彩病毒(GIV)本发明另一具体实施例系萃取石斑鱼幼体中的虹彩病毒(Irido Virus ；GIV)。将取出的O. I克前肾组织放入微量离心管，并加入200 μ I的萃取液(MagQuCo. ,Ltd.)至微量离心管，为了保持组织的新鲜度，将微量离心管放置在冰上并将组织磨碎，磨碎后3分钟，移开在冰上的微量离心管5分钟，取出在微量离心管中含组织的液体的上部溶液，做免疫磁减量检测并量测GIV的浓度。图1-2是不同石斑鱼组织的萃取过程的流程图，其中图l_2(a)直接从石斑鱼前肾组织萃取虹彩病毒的RNA,所萃取的RNA被转录为DNA,并藉由实时聚合酶连锁反应检测DNA的浓度，即为Φ , 。根据萃取的结构，选择700TCID5Q/ml至4X107TCID5Q/ml的虹彩病毒浓度作为检测萃取GIV的浓度范围。所述的TCID5tl是指半数组织培养感染量。图l-2(b)为萃取前肾组织的虹彩病毒颗粒，在上部溶液中含GIV颗粒通过实时聚合酶连锁反应检测并表示为cKIV,part。经上述方式所萃取的GIV浓度，可经由ΦΗν,_/ΦΗν,km的比例获得萃取效率值。如附图2-2所示，700TCID5Q/ml至4X 107TCID5(l/ml的虹彩病毒中，本发明萃取虹彩病毒的效率超过80 %。实施例2试剂合成2-1合成具有神经坏死病毒抗体之纳米磁性粒子混合化学计量比率为I : 2的硫酸亚铁七水(FeSO4 · 7H20)与氯化铁六水(FeCl3 · 6H20)的铁溶液与等量的水性葡聚糖混合，其作为四氧化三铁粒子的界面活性剂并分散在水中。该混合物加热至70-90°C，并以强碱溶液滴定形成黑色的四氧化三铁粒子，团聚体和多余的葡聚糖则以离心的方式移除，并以凝胶过滤层析方式获得高浓度均相的磁流体。该试剂可通过pH为7. 4的磷酸盐缓冲液稀释高浓度磁流体而获得适合的磁性浓度。

为了使抗体结合至磁性纳米粒子外层的葡聚糖上，以神经坏死病毒抗体为例，神经坏死病毒抗体加入过碘酸钠NaIO4溶液至磁性溶液中，使葡聚糖氧化并得到醛基(-CH0)，之后，葡聚糖可通过-CH = N-的链接与神经坏死病毒抗体反应。因此，神经坏死病毒抗体共价连接到葡聚糖上。通过磁性分离，未接合的神经坏死病毒抗体可从溶液中分离。为确定磁性纳米粒子表面接合上神经坏死病毒抗体，如附图3-1所示，本实施例使用一端藉由FITC(异硫氰酸荧光素)荧光的二级抗体与神经坏死病毒试剂混合。实验中，加入过量的FITC 二级抗体与披覆有神经坏死病毒抗体的磁性粒子混合。充分混合后，再藉由磁性分离技术，将混合液中的磁性粒子分离出，而未与磁性粒子表面的神经坏死病毒抗体接合的FITC 二级抗体，因不具有磁性，则会留在原混合液中。因此，本实施例将混合液放在荧光显微镜下观察，首先会看到绿色(灰色)亮点，如图4中箭头所指之处。此亮点是FITC所发出的光亮。为了再次确认二级抗体键结至磁性纳米粒子上，在混合液旁摆上磁铁。此时溶液中的磁性粒子会受到磁铁的吸弓I而移动，通过磁性纳米粒子的移动，若附有FITC的二级抗体与披覆有神经坏死病毒抗体的磁性粒子结合，则亮点也会移动。本实施例中，将磁铁放于图4的右下方，而图5的亮点应朝向右下方移动。此预测在图5中被观察到，这证实磁性粒子上，确实已接上神经坏死病毒抗体(Anti-NNV)。藉由动态激光散射法(dynamic laser scattering)分析具有神经坏死病毒抗体的磁性纳米粒子的粒径分布,而测量神经坏死病毒试剂的磁浓度为O. lemu/g(l. 2mg-Fe/ml)。如图6-1所示，粒子的平均流体动力粒径为55nm，此粒径是根据布朗式磁松弛，时间常数4在55·!的粒子分散在20-25°C的水中，通过方程式(1)，估计为65. 79μ S，其中η是在20-25°C中水的黏度，V是粒子平均流体动力体积，Kb是Boltzmann常数，T是兰氏温度单位。经由上述的估计，此意味着在交流磁场下的频率为I/τΒ(= 15.2kHz)。实际上，分散于水中的粒子的虚部交流磁化率相当于粒子的交流磁性能量的吸附作用。因此在共鸣频率可达到最大吸附作用，并使交流磁化率的虚部达到最大值。因此本实施例藉由磁导率计测量神经坏死病毒试剂的交流磁化率的频率相关虚部。如图7的实验频率范围中，显示标准化交流磁化率的最大值虚部，且显著表现出随着适合的交流磁场频率增加，神经坏死病毒试剂的虚部(Imaginary part) Im[ x ac]NOT也随之增加，并且达到最大值约15kHz,此实验结果符合公式(I)的推论。τΒ = 3 nV/KBT.................公式(I)2-2合成具有虹彩病毒抗体之纳米磁性粒子本发明另一实施例系利用上述合成磁性纳米粒子的方式将虹彩病毒抗体加入过碘酸钠NaIO4溶液至磁性溶液中，使葡聚糖氧化并得到醛基(-CH0)，之后，葡聚糖可通过-CH = N-的链接与虹彩病毒抗体反应。因此，虹彩病毒抗体共价连接到葡聚糖上。通过磁性分离，未接合的虹彩病毒抗体可从溶液中分离。为确定磁性纳米粒子表面接合上虹彩病毒抗体，如附图3-2所示，本实施例使用一端藉由FITC(异硫氰酸荧光素)荧光的二级抗体与虹彩病毒试剂混合。实验中，加入过量的FITC 二级抗体与披覆有虹彩病毒抗体的磁性粒子混合。充分混合后，再藉由磁性分离技术，将混合液中的磁性粒子分离出，而未与磁性粒子表面的虹彩病毒抗体接合的FITC 二级抗体，因不具有磁性，则会留在原混合液中。如上述，虹彩病毒抗体与磁性纳米粒子外层的葡聚糖共价连接后，并藉由上述动态激光散射法(dynamic laser scattering)分析具有虹彩病毒抗体的磁性纳米粒子的粒径分布，测量虹彩病毒试剂的磁浓度为O. lemu/g(l. 2mg-Fe/ml)。如图6_2所示，粒子的平均流体动力粒径为52. 6nm。另，本发明为确定所合成的试剂的保存时间，因此将该试剂存放在4°C，其稳定度至少可达到13周，如附图8。实施例3神经坏死病毒浓度与免疫磁减量讯号建立本实施例将40 μ I与60 μ I的样品溶液混合在玻璃管中，使用磁性免疫分析仪(XacPro-E, MagQu)量测未结合成神经坏死病毒-神经坏死病毒抗体-葡聚糖-纳米磁性粒子前的X aCj0交流信号，之后，该混合物维持在室温下以形成神经坏死病毒-神经坏死病毒抗体-葡聚糖-纳米磁性粒子，量测并纪录其交流信号X a。, 4，通过量测出的X ac,0及X ac, φ，可用下列的公式(2)计算出IMR讯号IMR(%) = (xac,0-xac,Φ)/χ3ε,οΧ100%.......公式(2)对每一个给定浓度的样品溶液，其时间依赖的X ac交流信号皆检测三重复。图9显示神经坏死病毒浓度ΦΝΝν与MR讯号的关系曲线，当神经坏死病毒浓度ΦΝΝν从5TCID5(i/ml改变至107TCID50/ml, IMR讯号则从O. 84%增加至3. 04% .上述的实验结果数据，可由下列逻辑函数(3)推算MR(% )与神经坏死病毒浓度
4* NNV 系。
=,十 i 、 ..........公式⑶
I — I-1
Φ.其中，Α、Β、Φ。及Y是该函数的参数。将实验数据套入逻辑函数中，可得到A =O. 64、B = 3. 47、小。=26684及Y = O. 31，并以实线绘于图8。在逻辑函数(3)中，当小丽趋近于O时，IMR讯号趋近于A值，此结果表示A值是NNV浓度依赖MR讯号的噪音强度。此外当高于Φ。时，讯号趋近于B值，此显示当神经坏死病毒为高浓度时，对于MR讯号，B值为高端值(high-end value)。依据上述，将浓度定义为检测样品的标准，在低浓度的神经坏死病毒中，藉由MR讯号的三重复标准偏差数据，显示出MR讯号高于噪音强度A值。实验数据显示出，当神经坏死病毒为低浓度时，MR讯号的标准偏差为O. 021 %。因此，通过逻辑函数(3)，当IMR讯号的检测标准为O. 903%时，此时神经坏死病毒浓度为17. 2TCID50/mL·实施例4使用实时聚合酶连锁反应检测神经坏死病毒浓度取出100纳克的RNA定量具有神经坏死病毒的RNA浓度，其是使用核酸复制同步定量序列检测系统(ABI Prism 7000 sequence detector, Applied Biosystems)检测。执行实时聚合酶连锁反应的放大作用是使用High Capacity cDNA Archive kit (AppliedBiosystems)和其专一11"生引物,如序列表SEQ ID NO. I。在实时聚合酶连锁反应的过程中，藉由Power SYBR Green PCR MasterMix试剂以荧光实时检测核酸量，并且利用神经坏死病毒的正义和反义引物，如序列表SEQ ID NO. 2和SEQ ID NO. 3进行行实时聚合酶连锁反应。其反应条件，以95°C反应3秒将DNA模板双链打开，再以60°C反应30秒进行引物的黏合及延伸作用，进行45个循环反应,最后藉由SDS软件(版本1.7 !Applied Biosystems)分析实时聚合酶连锁反应讯号。本实施例准备浓度为IO2至108TCID5(l/ml的多种神经坏死病毒样品，并使用实时聚合酶连锁反应方式检测，以荧光强度与放大循环作用的实验关联性测定每一个神经坏死病毒浓度样品的交叉点(crossing point)，如图10显示神经坏死病毒浓度对于交叉点的曲线图，并得到CP = -1.481μΦ_+39.4的线性方程式，并且做为计算神经坏死病毒浓度的标准曲线。实施例5免疫磁减量与实时聚合酶连锁反应分析方式的比较为了确认IMR检测神经坏死病毒浓度的分析方式能取代实时聚合酶连锁反应，本实施例利用IMR与实时聚合酶连锁反应同时测试15个样品，对于每个样品，有两个神经坏死病毒浓度的数值，一是使用IMR侦测的数值为，另一使用实时聚合酶连锁反应侦测的数值为Φ_\ ,ΡΟ 。图11显不出Φ_\ ,ΙΜΕ与Φ_, POi之间的闻度相关性，其相关系数为·O. 99，因此证实利用MR侦测神经坏死病毒浓度是具有可信度。以上所述仅是本发明的优选实施方式而非对本发明保护范围的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，可以对本发明技术方案进行修改或等同替换，这些修改或等同替换也应视为本发明的保护范围。
权利要求
1.一种用于检测水产动物病毒的检测试剂，其特征在于，包含 溶液；及 多个磁性纳米粒子，所述多个磁性纳米粒子分布于所述溶液中，所述多个磁性纳米粒子中的各磁性纳米粒子包含 磁性核； 界面活性剂层，所述界面活性剂层披覆于所述磁性核上 '及 多个水产动物病毒抗体，所述多个水产动物病毒抗体结合于所述界面活性剂层上。
2.如权利要求I所述的用于检测水产动物病毒的检测试剂，其特征在于所述溶液包含水。
3.如权利要求I所述的用于检测水产动物病毒的检测试剂，其特征在于所述磁性纳米粒子的材料选自由四氧化三铁、三氧化二铁、铁酸锰、铁酸钴及铁酸镍所组成的群组。
4.如权利要求I所述的用于检测水产动物病毒的检测试剂，其特征在于所述磁性纳米粒子的磁性核材料为四氧化三铁。
5.如权利要求I所述的水产动物病毒的检测试剂，其特征在于所述界面活性剂层的界面活性剂包含有机酸、蛋白质A、蛋白质G、葡聚糖或微脂粒。
6.如权利要求I所述的水产动物病毒的检测试剂，其特征在于所述界面活性剂层的界面活性剂为葡聚糖。
7.如权利要求I所述的水产动物病毒的检测试剂，其特征在于所述水产动物病毒包含神经坏死病毒、虹彩病毒和感染性胰脏坏死病毒。
8.如权利要求I所述的水产动物病毒的检测试剂，其特征在于，所述水产动物病毒为神经坏死病毒。
全文摘要
本发明提供一种检测水产动物病毒的检测试剂，该检测试剂可透过磁性免疫分析仪检测带有水产动物病毒抗体的磁性纳米粒子的免疫磁减量(Immunomagnetic Reduction，IMR)讯号，并通过逻辑函数计算出水产动物体内的病毒浓度，进一步确认水产动物感染病毒。
文档编号G01N33/569GK102879564SQ20111025798
公开日2013年1月16日 申请日期2011年9月2日 优先权日2011年7月14日
发明者杨谢乐 申请人:磁量生技股份有限公司